碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究

碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究碱性蛋白酶(alkaline protease)是一类最适pH为碱性的蛋白酶,是一种非常重要的水解酶类,在医药、饲料、食品等领域中都有广泛应用。本论文以Cellulomonas bogoriensis sp.nov为出发菌株,对其产酶条件、碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了研究,并得到以下结论:利用单因素法和响应面Box-Behnken组合设计方法对菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化,得出菌株最佳产酶条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 10.5,装液量75/250 mL,1.5%(w/v)蔗糖为碳源、1.5%(w/v)的牛肉膏酵母浸粉(1:1)为混合氮源、NaCl 含量为2.67%(w/v),培养时间120 h。

经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到一个相对分子质量约为18.3 kDa的碱性蛋白酶,纯化倍数为10.83,回收率为25.79%。酶的最适反应温度70℃,最适pH为11.0。

在4-60℃、pH3.0-12.0范围内酶活力稳定;1 mM的Mg2+、Fe2+会增加蛋白酶活力;而1 mM的Ba2+、Mn2+、Ca2+对蛋白酶活力几乎没有影响,但在10mM时会明显抑制蛋白酶的活力。EDTA浓度为10m M时,碱性蛋白酶的酶活力仍能达到77%。

抑制剂PMSF,TPCK对酶有强烈的抑制作用,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶。酶对甲醇、乙醇、甘油等有机溶剂具有较强的耐受能

力,Triton X-100强烈抑制酶活力。

该蛋白酶最佳作用底物为酪蛋白,可以水解血红蛋白和牛血清白蛋白,不能水解明胶和胶原蛋白,米氏常数Km为19.2μg/mL,Vmax为2000μg/min。该蛋白酶与市售的洗涤剂均有良好的相容性,具有良好的脱毛效果、处理血污的能力和

耐盐性。

测定了该酶的N端序列,为FDVIGGNAYT。本论文纯化的碱性蛋白酶具有耐碱性、耐高温、耐盐及耐有机溶剂等优良的特性,在皮革、洗涤等工业生产中具有应用前景。

组织及血液碱性磷酸酶(AKP ALP)活性检测试剂盒说明书 微量法

组织及血液碱性磷酸酶（AKP/ALP）活性检测试剂盒说明书微量法 货号：BC1595 规格：100T/48S 产品说明： AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。 自备仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。 标准品：液体×1支（EP管中），2μmol/mL酚标准液，4℃保存。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂 一）进行冰浴匀浆，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。 2.血液可直接测定，或者适当稀释后测定。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。 2.试剂三置于37℃水浴中预热30min以上。 3.空白管：取EP管，加入4μL蒸馏水，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；

加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A空白管。 4.标准管：取EP管，加入4μL标准品，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min； 加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。 5.对照管：取EP管，加入40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂 四120μL，混匀；最后加入4μL上清液，混匀后于510nm测定吸光度，记为A对照管。 6.测定管：取EP管，加入4μL上清液，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min； 加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。 其中标准管和空白管只需做一管，测定管和对照管每个样均需做。 三、AKP/ALP活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1.血液中AKP/ALP活力计算 活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚定义为一个活性单位。 AKP/ALP活力(U/mL)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷V样×V样总÷T=6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) C标准品：2μmol/mL；V反总：反应体系总体积（mL），1020μL=1.02mL；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.020mL；V样总：1mL；T：反应时间（min），15min。 2.组织中AKP/ALP活性计算 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚。 AKP/ALP(U/mg prot)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(Cpr×V样)÷T = 6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr （2）按样本质量计算 活性单位定义：37℃中每克样品每分钟催化产生1μmol酚。 AKP/ALP(U/g)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(V样÷V样总×W)÷T

药物分离与纯化技术提纲(自制).

第一章绪论 1.药物分离与纯化过程分为机械分离与传质分离，机械分离针对非均相混合物，传质分离（物质传递）针对均相混合物，分为平衡分离过程与速度控制分离。 2.分离剂可以是能量或物质（质量）。 第二章药物分离纯化前的预处理技术 1.预处理的目的：将目的产物转移到易于分离的相态中（液相），同时除去大部分杂质，改变流体特性，利于后续分离。 2.药物成分的形成阶段只能获得含有目的药物成分的混合物，难以进行药物分离。 3.预处理主要完成任务： （1）去除大部分可溶性杂质（阳离子、生物大分子） （2）采用凝聚或絮凝技术，将胶体状态的杂质转化为易于分离的较大颗粒。（3）改善料液的流动性，便于固液分离 （4）固液分离 （5）将胞内产物从细胞内释放出来 4.沉淀技术： （1）高价离子：Ca2+、Mg2+、Fe3+ a影响离子交换 b对药物降解加速催化作用 （2）生物大分子（可溶性黏胶状物）：蛋白、核酸、多糖 a粘度增大，影响固-液分离。 b乳化作用，吸附离子基团。 5.沉淀法去除杂质常用的方法：等电点沉淀法，变性沉淀法，盐析法，有机溶剂沉淀法，反应沉淀法。 6.等电点沉淀法原理：蛋白质是两性电解质，当溶液PH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。

7.变性沉淀法原理：利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。 8.盐析法概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 9.盐析法影响因素： （1）盐析剂的性质和加入量 （2）溶液的pH值 （3）蛋白类化合物的性质 （4）蛋白浓度 （5）温度 10.常用的凝聚剂：AlCl3·6H2O、Al2(SO43·18H2O(明矾）、 K2SO4·Al2(SO43·24H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4和MgCO3等。 11.凝聚作用与絮凝作用的区别：凝聚作用是指某些电解质（凝聚剂）作用下，破坏胶体系统分散状态，而使胶体粒子聚集过程，而絮凝作用是通过架桥作用将许多微粒聚集在一起，形成粗大的松散絮团的过程。 12.助滤剂：具有一定刚性的颗粒或纤维状的固体。 13.常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性碳等。 14.细胞破碎方法 （1）机械法：高压均浆法（可大规模操作），珠磨法（可较大规模操作）、超声破碎法、X－press法 （2）非机械法：酶解法、化学渗透法、渗透压法、冻结融化法、干燥法。 15.高压匀浆法原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 第三章萃取技术

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义: 1.国内外研究现状 碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。 研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。 相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。 2.选题依据及意义 此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。这种积极采用微生物代替化学法的探究，有利于开发现代生物新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物领域产业的发展。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题 1.海水中碱性蛋白酶高产菌株的筛选；

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常 数测定 一、实验原理 (1).碱性磷酸酶的分离纯化 1. 机械破碎法制备肝匀浆 低浓度乙酸钠：低渗破膜 低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP 2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP 50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP (2).比活性测定 1.比活性的定义 *单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。 *通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 *用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。 2.测定样品的比活性必须测定： *每毫升样品中的酶活性单位数。 *每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理 (3).米氏常数测定 K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度 ＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此, 米氏常数的单位为mol/L。 当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标， 以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。

二. 器材 721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器 托盘天平匀浆器试管 三. 试剂 1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中, 稀释至50ml. 2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水

中, 稀释至10ml. 3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml 及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml. 4. 丙酮(分析纯). 5. 95%乙醇(分析纯). 6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml. 7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g, 4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可. 8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml. 9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.

碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP微板法)

碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 微板法) 产品简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。 Leagene 碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 微板法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用PNP 比色法，其检测原理是Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成p -nitrophenol 。在碱性条件下p -nitrophenol 转变成醌式结构，呈较深的黄色，产物黄色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法测定处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 产品组成： 自备材料： 1、 水浴锅或恒温箱 2、 96孔板 3、 酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制显色工作液： 取出1支pNPP ，恢复至室温后溶解于ALP Assay buffer ，混匀， 冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在6h 内用完。 2、 配制标准品工作液：取出p -nitrophenol(10mM)恢复至室温后，取10μl 溶解于190μ 编号 名称 TE0002 100T Storage 试剂(A): ALP Assay buffer 15ml 4℃ 试剂(B): pNPP 2支 -20℃ 避光 试剂(C): p -nitrophenol(10mM) 0.1ml -20℃ 避光 使用说明书 1份

碱性磷酸酶测定试剂盒注册技术审查指导原则(2016年修订版)

附件1 碱性磷酸酶测定试剂盒注册 技术审查指导原则 （2016年修订版） 本指导原则旨在指导注册申请人对碱性磷酸酶测定试剂盒注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对碱性磷酸酶测定试剂盒的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 碱性磷酸酶测定试剂盒是指基于分光光度法原理对人血

清、血浆或其他体液中的碱性磷酸酶活性进行体外定量测定的试剂。本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。 碱性磷酸酶活性的测定方法目前主要有连续监测法和比色法两类： 1.连续监测法（磷酸对硝基苯酚底物法） 碱性磷酸酶催化水解磷酸对硝基苯酚（4-NPP），生成对硝基苯酚（4-NP），在特定波长处监测吸光度变化速率，可计算碱性磷酸酶活性。 2.比色法（磷酸苯二钠底物法） 碱性磷酸酶催化水解磷酸苯二钠，生成游离酚，酚与4-氨基安替比林结合，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，在特定波长处监测吸光度值，可计算碱性磷酸酶活性。 从方法学考虑，本文主要指以碱性磷酸酶水解底物引起特定产物的吸光度的改变对碱性磷酸酶活性进行定量测定的体外诊断试剂，不包括干化学和酶联免疫检测试剂。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号），碱性磷酸酶检测试剂属于酶类检测试剂，管理类别为Ⅱ类，分类代号为6840。 二、注册申报资料要求

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

详细介绍碱性磷酸酶分离纯化的过程及采取的技术

1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯 化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？ 一、精氨酸激酶的介绍 无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。 二、工艺路线

三、研究内容与方案 1.对虾精氨酸激酶的提取、分离 取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因： 巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、 PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解 ＊注意事项 该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定 2.对虾精氨酸激酶的纯化 1）DEAE-纤维素柱层析 装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。平衡使用DEAE cellulose DE-52阴离子交换层析柱平衡液洗脱2-3个柱体积，平衡12h。加样打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一层，然后加入酶液，加样量一般不超过约2-3ml。洗脱采用NaCl浓度梯度洗脱法，将DEAE cellulose DE-52层析柱洗脱液A液和B液分别加到梯度混合仪两容器内，将B液150ml加入左杯，A液150ml加入右杯，打开梯度混合仪两容器内，流速1.5ml/min，通过波长280nm的核酸蛋白检测仪后，由自动收集器收集。 ＊选择阴、阳离子交换层析的原则： 蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阴离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pIpH的

木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观

为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法

可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术 凝胶过滤法

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室 合作者指导老师 总分教师签名批改日期 碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。 AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。 一实验原理 1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm 处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。 3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表 示： 式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。 ①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物

碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒使用说明

碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法) 货号：G5610 有效期：6个月有效。 产品内容： 产品规格 试剂(A):ALP Assay buffer 2.5ml 试剂(B):ALP显色液 2.5ml 试剂(C):显色基液7.5ml 试剂(D):Phenol标准(1mg/ml)1ml 试剂(E):ddH2O1ml 产品说明： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。 碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸。在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定510nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试

剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 自备材料： 96孔板、水浴锅或恒温箱、酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、配制标准品工作液：取出Phenol标准(1mg/ml)恢复至室温后，取0.1ml溶解于1.9ml ddH2O，使浓度达到0.05mg/ml，即为标准品工作液-Phenol(0.05mg/ml)。按照下表稀释系列标准品溶液。 012345 010******** Phenol(0.05mg/ml)(μ l) ddH2O(μl)55453525155 相当于金氏单位(U/L)010******** 2、准备样品： （1）细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-80℃冻存，用于碱性磷酸酯酶的检测。 （2）血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-80℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。 （3）高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS 等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室 合作者指导老师 总分教师签名批改日期 碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重

组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。 一实验原理 1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg ?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚

BCIP NBT碱性磷酸酶显色试剂盒

仅供科研使用版本号：180718 BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 【产品组成】 【保存条件】 4℃,避光,12个月。 【产品概述】 BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit)是一种用于免疫组化显色、Western等膜显色和诱导多功能干细胞iPS鉴定等的试剂盒。BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit可用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS的鉴定，也可用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测\细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。 【使用方法】 1、对于组织切片或细胞样品或膜，在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗 涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3～5次，每 次3～5min。 3、按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液： 4、洗涤完毕后，去除洗涤液。 5、加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。 5、室温避光孵育5～30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 6、去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色反应。 7、对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

药物分离纯化

1.什么是化学萃取？影响化学萃取的因素？溶质与萃取剂之间的化学作用？ 2.什么事截留分子量？各种分离膜（如微滤、超滤、纳滤）的截留组分范围怎样？ 3.什么是乳化现象？消除乳化的方法有哪些？ 4.什么是反萃取、萃取相、萃余相？ 5.什么是有效成分和有效部位？ 6.什么是双水相萃取技术？有哪些特点？ 7.什么是半仿生提取法？其优点有哪些？ 8.什么是分子印迹技术，其特点如何？ 9.什么是分子蒸馏，其操作过程如何，有哪些特点？ 10.依据分离记理，色谱法分为哪几类？ 11.根据料液和溶剂的接触和流动情况，萃取操作过程如何划分？ 12.什么是凝胶色谱，其分离机理如何，有哪些用途？其操作过程如何？ 13.什么是住色谱，如何操作？ 14.活性氧化铝有哪些类型？特点是什么？其含水量关系如何？ 15.何为浸漉法，去操作过程如何？ 16.离子交换树脂有哪些类型,影响其选择性的因素？其操作过程如何？ 17.容积提前中药有效成分时，选择溶剂的原则，常见容积大机型大小如何？ 1分离纯化过程：通过物理、化学或生物等手段，或将这些方法结合，将某混合物系分离纯化成两个或多个组成彼此不同的产物的过程。 分离纯化技术：在工业中通过适当的技术手段与装备，耗费一定的能量来实现混合物的分离过程，研究实现这一分离纯化过程的科学技术。 1、药物分离的特点：（1）药物的品种繁多，结构复杂，不同来源的药物性质差别很大，采用的分离技术原理和方法也多种多样。（2）以天然形式存在的药物，或生物来源的药物通常含量较低，杂质的量远远大于有效成分的量。分离过程需要多种方法联合应用，使有效成分的含量不断提高。（3）药物中很多品种特别是天然成分和生物活性物质具有稳定性差、易分解、易变性等特点，在选择分离方法时需要考虑被分离物质的性质，采用适当的分离方法和条件，以保证产品的稳定性（4）从药物研究到药品生产，分离在量上的差别很大，小到 以鉴定、含量测定的6- 10g级，大到生产的吨级的纯化。（5）药品的质量要求高，必须达到国家标准，生产环境需要达到一定的洁净度，防止环境对产品的污染。 2、分离纯化方法按原理分为机械分离和传质分离。 3、萃取：将样品中的目标化合物选择性地转移到另一相中或选择性地保留在原来的相中（转移非目标化合物），从而使目标化合物与原来的复杂机体相互分离的方法。反萃取：调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。萃取相：当溶剂与混合液混合后成为两相，其中一个以萃取剂为主（溶有溶质）的称为萃取相。萃余相：另一个以原溶液为主的（即溶剂含量较低）称为萃余相。萃取液：利用蒸馏、蒸发和结晶等方法除去萃取相中的溶剂后得到的液体称为萃取液。萃余液：利用蒸馏、蒸发和结晶等方法除去萃余相中的溶剂后的液体称为萃余液。化学萃取：也称反应萃取，是利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。影响化学萃取的因素：（1）被萃取药物的结构（2）pH的影响（3）温度的影响（4）无机盐的存在（5）溶质的结构（6）萃取剂（7）稀释剂。 4、化学萃取中，溶质与萃取剂之间的化学作用主要有：（1）配位反应（2）阳离子交换反应（3）离子缔合反应萃取（4）协同反应萃取。 5、根据料液和溶剂的接触和流动情况，可以把萃取操作过程分成单级萃取操作和多级萃取

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯 化 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、

干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法 可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】