当前位置：搜档网 › 分子生物学实验课考试

分子生物学实验课考试

分子考试资料整理

1.质粒DNA的构型与电泳速率的关系？

答：DNA分子的迁移速率取决于由DNA分子的大小与构型而形成的分子筛效应。

①在相同的构型下，DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。

②相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。当琼脂糖凝胶的浓度较低时，电泳速率为：超螺旋DNA>线性DNA＞开环DNA。

2.碱裂解法提取质粒DNA的原理以及三种溶液的作用？

①基本原理

质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA 与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

②三种溶液的作用（溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS (新鲜的)；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。）

溶液I: Tris-Cl:适当pH值,

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解,悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部,

EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生长(是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂)

溶液II：NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂。

这一步要记住两点：第一，不能用旧的NaOH；第二，时间不能过长，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

SDS: 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

溶液III：醋酸钾: K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去；

高浓度的盐，使得沉淀更完全（在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀）。

2 M的醋酸:中和NaOH，创造质粒复性的环境。

3. 感受态细胞制备过程应注意的问题；

①细胞的生长状态和密度

最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600（0.4-0.5）控制。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

②质粒DNA的质量和浓度

一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。

③整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌。

④用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染

⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴

⑥CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。

⑦化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；

4.挖胶过程应注意什么？

①保证切下的条带没有外源DNA的污染。

②切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积。

③切胶时尽量在长波长下进行，减少紫外对DNA的损伤。

④为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，可采用薄而宽的梳子来跑胶。

5.如何灭活RNase？

A. RNase 灭活剂

①焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

②异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

③氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

④ RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

⑤其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

B.RNase灭活剂

C.玻璃器皿200℃高温烘烤2小时

D.塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。

6.提取RNA和DNA时所用的饱和酚有什么不同？

①水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的PH小于7，一般是PH为5.0左右，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，在酸性环境中，DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。

②Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。由于PH值大于7，在碱性环境中DNA处于水相，RNA 处于有机相。从而分离上清，即可得到DNA。

7.如何减少蛋白诱导过程中包涵体的产生？

①降低诱导温度，一般15-25℃②降低诱导剂ITPG浓度③使用中等强度或弱的启动子④进行融合表达⑤增加蛋白质折叠的添加剂⑥与伴侣分子和折叠酶共表达⑦选择突变的菌株⑧优化培养基条件

7.单酶切时，为提高连接效率应采取什么措施？为什么？

通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过连接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

8.连接反应中，插入片段与载体的合适比例是多少？

载体与目的基因摩尔数之比为1：3-5 如果插入片段较小，而载体较大，和载体的摩尔比例3-6:1连接效果好，如果载体和插入片段大小相近，摩尔比1：1较好；如果插入片段和载体的摩尔比例过大，会导致多克隆的插入；如果插入片段和载体的摩尔比例过

小，会导致假阳性增多。

9.筛选阳性克隆的方法？

菌落PCR、酶切鉴定、Cracking gel、菌落原位杂交、测序

10.蓝白斑筛选的原理是什么？如何出现大量蓝斑，可能是什么原因？

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：许多载体（PUC序列）都带有一个大肠杆菌的DNA 的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌含编码β-半乳糖苷酶C端aa序列。当无外源基因插入时，载体表达的N端β-半乳糖苷酶多肽与受体菌表达的C端β-半乳糖苷酶多肽功能互补，具有β-半乳糖苷酶活性。可以将生色底物X-gal分解成蓝色物质，从而在培养基中形成蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，造成插入失活，而使表达的产物不具有β-半乳糖苷酶活性，不能分解底物X-gal，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

原因：1）载体与目的基因连接做的不好，重组质粒太少，大量的自连载体进入感受态细胞。

2）酶切不完全，未被酶切的空载体进入感受态细胞。

11. 已知一个基因的核酸序列，如何进行蛋白表达？步骤？

①目的基因的获取：提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，根据核酸序列设计引物，PCR扩增目的基因②克隆载体的选择与构建：提取质粒DNA③重组质粒的构建，即外源基因与表达载体的连接：双酶切，电泳检测，切胶回收目的片段，连接，获得重组质粒。

④重组DNA导入受体菌：转化，将重组质粒导入受体菌⑤重组体的筛选：用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并将阳性菌落保存留种。

⑥克隆基因的表达：先将菌种复苏、扩繁；用IPTG分别诱导阳性克隆菌和空载体菌；取适量蛋白样，处理好后，上样、跑胶，染色、脱色、拍照。观察重组蛋白的表达情况。

a. 对于阳性克隆菌，向5ml菌液中加入IPTG至终浓度0.6mM（30ul 0.1M IPTG），继续震荡培养；

b. 对于空载体菌，向5ml菌液中加入30ul 0.1M IPTG （终浓度0.6mM IPTG）；

12.质粒的特点是什么？

结构：大多为共价、闭合环状、超螺旋（circular covalently closed DNA,cccDNA)

功能：正常生长非必须的，但赋予细菌某些性状特征（具有遗传标记）

复制和遗传：细菌内的共生型遗传因子，其复制独立于细菌染色体,但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。

可以转移。

13.PCR的原理是什么？PCR程序通常有哪几个步骤？

聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模拟体内DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。

步骤：

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

14.当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？

答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。

15.大肠杆菌转化（CaCl2法）的原理？

0℃下，细菌处于CaCl2的低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA与CaCl2形成羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子基因得以表达，在抗生素选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

16.感受态细胞制备及转化中的影响因素？

①细胞的生长状态和密度

最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

②质粒DNA的质量和浓度

③整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌。

④用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染

⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴

⑥CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。

17.CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，低温的主要目的是什么？热休克温度和目的是什么？

低温目的：

（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（2）有助于DNA—Ca2+吸附于细胞表面

（3）防止DNAase降解DNA 。

热休克温度是42℃；目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。

18.影响PCR扩增的因素有那些？

引物的质量与特异性；PCR循环条件（退火温度）；Mg2+浓度；模板DNA的质量；酶的质量。

19.引物设计的基本原则？

①引物长度一般在18~25碱基之间。

②避免引物内和引物之间的二级结构

③两个引物的Tm值要接近。

④ G+C含量在40%~60%之间，避开局部富含GC或AT，3’端避开AT rich结构

⑤碱基要随机分布。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补，特别是3’末端的3个碱基。

⑧引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

⑨引物5′端可以修饰，引物3′端不可修饰。

20.SDS-PAGE的原理？

SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。蛋白质分子与SDS充分结合。

PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bi )在加速剂N N N′ N′-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵 (简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

21.SDS-PAGE电泳的速率为什么只与蛋白的分子量有关，而与所带电荷多少无关？

蛋白质分子与SDS充分结合后，所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量，因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量。

22.提取RNA过程中，怎样才能有效地降低材料本身给RNA提取带来的降解？

①新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。

②新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

③冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。

④外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。

⑤内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高

23.异硫氰酸胍法提取RNA的原理？

异硫氰酸胍可以裂解细胞释放出核酸，并同时使蛋白质变性，抑制内源的RNase活性。在酸性条件下（NaAc pH4.0），RNA溶于水相，而DNA溶于有机相。这样，在加入苯酚/氯仿后，RNA就溶于上层水相中，而DNA溶于下层苯酚/氯仿中，蛋白处于中间层。含有RNA的水相被转移出来以后，在异丙醇的作用下沉淀，从而被分离出来。

24.理想状态下DNA、RNA OD260/280分别为多少？在什么范围比较合适？偏大或偏小分别说明什么？

①基因组DNA 1.7

2.0)，比值<1.8：蛋白质污染；比值>2.0: RNA污染

②理想的RNA2.0, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。如果OD260/OD280过低（<1.7），通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。

OD260/OD280比值偏低？

蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5或TE 。用水作为稀释液将导致比值偏低。

25.基因组DNA提取的一般原理？如何判断基因组DNA的浓度和质量？

①将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。

②紫外分光光度法 OD280；琼脂糖凝胶电泳

③基因组DNA的质量检验：紫外分光光度法 OD260/280; OD260/230；酶切法（Hind III ）、完整性检测：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象。

26.提取基因组DNA的用途有哪些？

构建基因组文库、Southern 杂交、RFLP、基因克隆（PCR）、制作基因芯片

27.提取基因组DNA所用试剂：组织消化液(100ml)： 5ml 1M Tris-HCl、4ml 0.5M EDTA、2ml 10% SDS、 150ul 60mg/ml Protease K； Tris饱和酚；酚/氯仿（1:1）；氯仿；无水乙醇； 70%乙醇；5M NaCl； TE

28.RNase的来源？

样品、试剂、多次使用的器皿、手、说话产生的唾沫、空气

29.RNase酶注意事项

①玻璃器皿处理：量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200℃烘烤2小时以上。

②塑料器皿处理：0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。。

③试剂处理：实验用的所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至终浓度0.1%，然后剧烈震荡混匀10分钟，然后高压灭菌以消除残余的DEPC。

④专用的RNA操作室、专用器械。

⑤操作时戴口罩、帽子、手套

一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

注意：DEPC与氨水混合后会产生致癌物，须小心在通风柜中使用。

30.组织和细胞样品收集，保存？

①组织样品收集后，需要立即保存在液氮中(1min)，或在样品中加入一定量的保护剂，有一些商业化的产品可以选用（RNA later， RNA store）。

②一般实验收集50-100mg组织就足够了。

31.RNA保存(-80℃)：DEPC-H2O 、0.1 mM EDTA、TE (10mM Tris, 1mM EDTA)

32.如何估计RNA的产量？

①RNA的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关

②mRNA的含量一般占总RNA含量的2-5%

③样品如果低于20mg或10000个细胞，在抽提时需要考虑加入合适的RNA沉淀载体。

④电泳，加RNA marker来定量

⑤紫外分光光度计（OD260），通常0.5-1.5ug/ul比较合适

33.常用的RNA提取方法？

异硫氰酸胍法、盐酸胍法、RNAzol法；Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。

34.Solution D的成分及其作用？

①4M 异硫氰酸胍（裂解细胞，抑制RNase）②25mM 柠檬酸钠， pH7.0 (缓冲液)③

0.5% 十二烷基肌酸钠（裂解细胞，抑制RNase）④DEPC水配制

35.Trizol法提取昆虫中肠总RNA需要的试剂：

氯仿：异戊醇（24:1）、异丙醇、75%乙醇（in?DEPC-treated?water ）、RNase?free 水或0.5%?SDS 溶液[准备不含 RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate?(DEPC)?to?0.01%?(v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5%?SDS 溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]。

36.昆虫中肠总RNA的提取

组织匀浆、相分离、沉淀RNA、洗涤RNA、沉淀再溶解、RNA检测

37.RNA提取注意事项

①在提取液中加入巯基乙醇对降低酚类的干扰可能有所帮助

②在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。

③溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。

④在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数。

⑤提取RNA请尽量在低温下操作。

38.如何提高RNA提取效率？

充分匀浆，以分散细胞；选择合适的提取方法；选择新鲜的组织；选择合适的样品储存条件；避免内源和外源Rnase的污染；正确的沉淀方法：乙醇沉淀：0.1 倍体积的5 M NH4Ac + 2-2.5 倍体积的无水乙醇， -20 ℃ >25 min ；异丙醇沉淀：0.6-1倍体积的异丙醇。

39.mRNA的分离纯化：采用Oligo dT-纤维素，从总RNA中分离出mRNA。

该法利用mRNA 3‘末端有Poly（A）的特点，在总RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下， mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来。一般而言，经过二次Oligo dT柱后，可得到较高纯度的mRNA。

40.核酸的贮存——DNA保存：

1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液(PH为8)，可减少DNA脱氨反应；EDTA可以抑制DNase的活性。

2）长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；

41.提取基因组DNA主要试剂的作用：

EDTA：二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性

SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNA、DNA酶有抑制作用；与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性

蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质；蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。

苯酚的特点：

蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性；苯酚溶于有机溶剂，微溶于水；提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率；氧化苯酚会破坏DNA。

42.为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？

苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。

氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。

PH8.0的Tris溶液可以使的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。

在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。

无水乙醇沉淀：沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出。

43.一个合格表达载体的组成要素：

①复制起始位点Ori。即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

②抗生素抗性基因。可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+

③多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

④P/E 启动子/增强子

⑤Terms 终止信号

⑥加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用

44.原核表达系统中的各因素：

复制子：通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关

筛选标记和报告基因：氨苄青霉素，卡那霉素

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一

组成型表达 :组成型启动子

诱导调控型表达 :IPTG

融合表达：GST, His-tag

分泌表达 :信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜

可溶性表达 :

转录终止子 :控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降

核糖体结合位点 :多数载体启动子下游都有SD序列

表达菌株 :不同的表达载体对应有不同的表达菌株

45.对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达蛋白质时注意阅读框错位；③根据表达天然蛋白质或融合蛋白来选择相应的表达载体。

46.琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为固体支持基质进行的电泳。主要利用DNA分子在电场中泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到分离混合核酸的目的。

47.影响电泳速率的因素

DNA分子量的大小、DNA的分子构象、琼脂糖凝胶的浓度、电压、电泳缓冲液的离子强度

48.二型限制酶只需镁离子，识别切割特异性强，切割发生在识别位点。

49.限制酶切割后的DNA电泳得到的电泳条带有些扩散

有蛋白质与DNA结合、酶切条件不合适、有外切核酸酶污染、星号活性

50.连接注意事项

反应液：应有ATP和Mg2+,而不要有高盐或EDTA，应使CIP,BAP 或SAP完全失活，DNA 应具5‘磷酸基团。

DNA浓度：总DNA量应1-10ug/ml, 否则太多DNA不能形成环状DNA。目的基因：载体的摩尔浓度比应是3：1。（经验：回收插入片段浓度30ng/ul左右连接效率最好，大于10ng/ul 比较保险，小于5ng/ul连接效率很低）

转化时连接产物量：不能加太多连接产物到感受态细胞，一般是50ul细胞加1-5ul连接物(约12ng pDNA)

酶量和反应时间：根据产家定义来决定，一般16℃过夜或25℃/1h

实验结果的正确分析？

①实验一质粒DNA提取：T-easy Vector质粒DNA浓度非常低（20-80ng/ul；proB质粒DNA浓度较正常（80-220ng/ul）；电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，胶未完全凝固）；质粒DNA的带型分析；电泳条带浓度确定

②实验二：回收效率低的可能原因：

1.胶块未完全溶解；可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；

2. 胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；

3.电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；可在溶胶时加入10ul pH5.0 3mol/L的NaAC；为使DNA更好拦截在膜上，可添30%异丙醇在加热溶解后的液体里。

4.漂洗液中的乙醇未充分挥发；

5.加洗脱液时未加在膜上；

6.洗脱效率低。加洗脱液后可在55度下 5min或在50度10min再离心，等等。

实验三：连接产物转化效率低的原因

①回收产物质量（挖胶回收过程中，紫外下曝光过长，DNA或受到损伤）

②连接反应体系的问题：Buffer，ATP/Mg离子，若buffer储存时间过长，ATP降解，导致连接失败。体系中盐浓度过高或EDTA含量高会导致连接失败。

实验五GST的诱导表达：脱色不彻底；上样量稍多（蛋白浓度大）；

离心不彻底；空载体表达出条带：增加胶浓度（12-15%）、延长电泳时间，以增加分辨率。

分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

建立一个分子生物学实验室所需的仪器

分子生物学技术信息关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器一、上游分子克隆分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：

二、核酸分子杂交核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。核酸分子杂交中常用的仪器：三、下游蛋白的表达及分离纯化目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达

分子生物学实验设计报告-四川大学

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达一、引言荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省

时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。三、实验步骤 1.质粒DNA的提取实验原理： ~

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

分子生物学实验课程教学大纲

分子生物学实验课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215 课程类别：专业课总学时数：68实验时数：18 学分：3.5 开课单位：生命科学学院生物综合教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学实验是生物技术专业一门必修的专业课，涵盖了分子与细胞生物学的许多内容，并与结构基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学、生物医学、分子病毒学、分子免疫学等学科有着重要的联系。分子生物学实验课程教学以理论课教学为基础，理论与实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设本课程的目的是使学生掌握分子生物学实验设备的操作方法，使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养学生的动手能力和科学研究能力，为学生学习生命科学中的其他相关课程作好基础准备。同时也使学生具备分子生物学基本的实验技能，学会发现问题和解决问题的能力，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。本课程的任务是通过实验教学，使学生了解和初步掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法，教学内容包括植物基因组DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增目的基因及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在实验内容和方法、技术上进行合理安排，力争让学生在有限的课时中尽可能多地了解和掌握现代分子生物学基本理论和有关实验的基本方法和技术原理，并尽可能多地引进、介绍新的、先进的实验方法和技术，以开阔学生视野，提高学生的动手能力和创造性思维能力，培养高素质的生命科学人才。二、本课程与其它课程的联系与分工学习和研究分子生物学的目的在于阐明生命活动的化学物质基础，并与其它学科配合，来揭示生命活动的本质和规律。《生物化学》、《细胞生物学》和《遗传学》是先修课程。三、课程内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；实验一植物基因组DNA的提取植物基因组DNA的提取的目的及原理[1]；植物基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法[3]；作业：提取的DNA呈褐色的原因及解决办法？实验二琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤[1]，琼脂糖电泳的实验方法[3]；作业：琼脂糖凝胶电泳中电压如何设置？实验三聚合式酶联反应（PCR）扩增目的基因

分子生物学实验报告

分子生物学实验院系：生命科学与技术学院专业：生物科学（基地）班级： 201101班学号：姓名：分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具

有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂

《分子生物学》实验指导(2015-2016)

《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

分子生物学习题与答案

第0章绪论一、名词解释 1.分子生物学 2.单克隆抗体二、填空 1．分子生物学的研究内容主要包含（）、（）、（）三部分。三、是非题 1、20世纪60年代，Nirenberg建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成体系。研究结果发现poly(U)指导了多聚苯丙氨酸的合成，poly(G)指导甘氨酸的合成。（×）四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 3. 分子生物学研究内容有哪些方面？ 4. 分子生物学发展前景如何？ 5. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么？ 6．简述分子生物学发展史中的三大理论发现和三大技术发明。 7. 简述分子生物学的发展历程。 8. 二十一世纪生物学的新热点及领域是什么？ 9. 21世纪是生命科学的世纪。20世纪后叶分子生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。试阐述分子生物学研究领域的三大基本原则，三大支撑学科和研究的三大主要领域？答案：一、名词解释 1.分子生物学：分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究。

2.单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。二、填空 1.结构分子生物学，基因表达与调控，DNA重组技术三、是非题四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？答案：有人把它定义得很广：从分子的形式来研究生物现象的学科。但是这个定义使分子生物学难以和生物化学区分开来。另一个定义要严格一些，因此更加有用：从分子水平来研究基因结构和功能。从分子角度来解释基因的结构和活性是本书的主要内容。 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。狭义：偏重于核酸的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。 3. 分子生物学主要包含以下三部分研究内容：A.核酸的分子生物学，核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于50年代以来

分子生物学实验技术全攻略

分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取

实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物

分子生物学实验教学大纲

分子生物学实验教学大纲一、说明 1、课程类别专业课 2、教学目的通过实验教学使学生了解、验证、巩固和加深所学理论知识，掌握分子生物学研究的基本实验技能，如：质粒（植物/动物）DNA的分离及纯化、植物总RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳等技术。培养科学、严谨、实事求是的学风，提高动手能力、分析问题解决问题的能力以及创新性思维。 3、教学内容本门课教学主要以某一基因为主线，从基因的分离、纯化、克隆、及鉴定等方面入手，帮助学生掌握分子生物学基本的实验方法和技能，在此基础上对分子生物学方法的应用和意义有一个整体的把握，在可能的情况下同时提供多种实验材料让学生自行设计和准备实验，培养其独立科研能力。 4、教学方式以实验操作为主，配合原理教授、实践性教学、多媒体教学和学生实验报告、撰写论文、自学等方法进行学习。 5、考核内容及方式实验操作 30％，实验结果 30％，实验报告 30％，考勤 10％。参照以下几个方面评定成绩。（一）认真预习实验并书写实验预习报告；（二）实验态度认真，操作规范，遵守实验室管理规定；（三）按规定步骤进行实验，实验结果准确；（四）认真撰写实验报告。 6、本课程授课时间（学期），总学时数。本课程在三年级开设，总计36学时，学时分配见下表: 教学时数分配表

二、教学内容 1、教学目标（课程）通过本课程的教学使学生了解和掌握现代分子生物学研究的基本原理、方法、技术和技能，包括DNA 提取、PCR 扩增等。通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维以及对生命科学探索的兴趣和爱好。 2、教学内容（分章节描述）实验一质粒DNA的提取 1．主要内容碱裂解法提取载体质粒。 2．教学要求学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA 1．主要内容（1）电泳基本知识介绍（2）琼脂糖凝胶的制备（3）质粒的定量。 2．教学要求掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验三植物总RNA的提取及检测 1．主要内容（1）RNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握植物组织中提取RNA的基本原理和实验技术方法。实验四动物总DNA的提取 1．主要内容（1）总DNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握动物组织中提取总DNA的基本原理和实验技术方法。实验五 PCR基因扩增 1．主要内容（1）PCR基本原理（2）PCR溶液体系的制备（3）PCR仪使用 2．教学要求掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。（二）重点和难点

分子生物学实验心得体会

关于分子生物学实验的体会梁慧媛（生技01 级）不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。分子生物学实验心得体会刘东强（生科01 级）分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值刘佳凝（生技01 级）一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我

分子生物学课程教学大纲

《分子生物学》课程教学大纲课程编号：233201 课程名称：《分子生物学》总学时数：64 实验学时：0 先修课及后续课：先修课为《生物化学》，《遗传学》；后续课为《基因工程》一、说明部分 1. 课程性质：生物技术专业课，必修 2. 教学目标及意义本课程是高等院校生物专业的专业课。旨在使学生掌握分子生物学的基本知识、基本概念，并了解分子生物学的发展趋势及应用前景。 3. 教学内容和要求本课程安排在学生完成《生物化学》、《遗传学》等有关基础和专业基础课程之后的第六学期。内容上注意与以上课程的衔接，并避免不必要的重复。同时注意与后续课程《基因工程》等课程的衔接。课堂教学应力求使学生掌握基本概念，了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、DNA的复制、RNA的转录、蛋白质的合成、RNA在蛋白质合成中的功能、遗传密码、基因表达与调控的本质、基因组与比较基因组学；由于该课程内容繁多，发展迅速，故授课教师在吃透教材基础上，应广泛阅读相关参考资料，紧跟本学科发展，随时补充新内容，使学生及时了解本学科的重要进展及发展动态。分子生物学的发展依赖于现代分析和研究技术，因此，配合分子生物学实验课程，讲解一些分子生物学的重要研究方法。 4. 教学重点，难点重点：DNA的结构与功能；DNA的转座；基因的表达与调控难点：基因表达的调控 5. 教学方法与手段在教学方法上采取课堂讲授为主，辅以多媒体课件、提问、综述、实验、作业、教学辅助材料等，以加强学生对理论知识的消化和理解，在教学过程应注意积极启发学生的思维，培养学生发现问题和解决问题的能力。 6. 教材及主要参考书教材：朱玉贤，李毅.《现代分子生物学》，第三版；北京：高等教育出版社.2007. 主要参考书：（1）杨岐生.《分子生物学基础》，杭州：浙江大学出版社.1998. （2）郜金荣等.《分子生物学》，武汉：武汉大学出版社.1999. （3）阎隆飞，张玉麟.《分子生物学》，北京：中国农业大学出版社.1997. （4）魏群，分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，2003. （5）李振刚.《分子遗传学》，北京：科学出版社，2000. （6）Weaver R. Molecular Biology. 2nd Edition.北京：科学出版社，2001.

分子生物学常用实验指南

生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）

2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

神经生物学实验指导书

神经生物学实验指导书实验一脑内重要神经核团和神经生物学研究方法简介 Methods for neuroscience research and nuclei in brain 1.实验目的理解神经核团的概念，理解重要的神经核团；掌握脑立体定位图谱的使用方法；了解神经生物学研究的常用方法。 2.实验器材、试剂及实验材料手术刀、毛剪、注射器， 1%戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium)、依文氏蓝(Evans Blue)，大鼠。 3.实验步骤 3.1脑的大致结构和重要神经核团脑膜至外由内分别有：硬脑膜、蛛网膜、软脑膜，其下是大脑皮层，边缘系统等结构。重要的核团（神经内分泌相关的丘脑下部核团）有：PVN（室周核）、PeN （室旁核）、SON（视上核）、ME（正中隆起）、Hippocampus（海马）等。下表给出几个重要核团的大致范围，值得注意的是：核团在不同截面上的位置和形状是不同的，因此具体位置应查阅图谱。神经核团距离前囟（mm）中心线两侧（mm）距脑背侧（mm） PVN（室周核）-1.0~-4.2 0.0~0.8 5.0~5.5 PeN（室旁核）0.0~-3.2 0.0~0.5 6.5~9.5 SON（视上核）0.0~-1.8 1.0~2.3 8.5~8.8 ME（正中隆起）-2.4~-3.4 0.0~0.5 9.5~10.0 Hippocampus（海马）-1.8~-6.2 0.5~6.3 3.2~8.0 3.2实验内容 a)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（40mg/kg）； b)在颅骨前囟后3-5mm处打孔； c)用微量注射器吸入3μl依文氏蓝，注入大鼠背侧三脑室。 d)大鼠断头，除去颅骨，观察脑的结构。 George Paxinos and Charles Watson，The Rat Brain in Stereofaxic coordinates，Academic press，1986 4.江湾Ⅰ型脑定位仪的使用 6.1脑立体定位仪的原理 a)脑立体定位仪分为两大类：直线式和赤道式。

分子生物学实验设计实验

分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：余光辉/20 方成/20

一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O

3.材料含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿 4.实验步骤（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液（3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中（7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意（1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液上样缓冲液（6×） 3.材料提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，

分子生物学实验指导-3

北京化工大学分子生物学实验指导

实验一少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部