蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤

蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤

蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤

一、注意事项：

1. 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH 值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。

2. 盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。

3. 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。

4. 盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中

放置一段时间。3.5为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。

5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。

6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。

二、实验步骤：

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大(20度时饱和

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蛋白提取步骤

提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。

BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。

蛋白提取步骤

提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS

细胞总蛋白提取方法

细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×

6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）

蛋白质的盐析与透析

蛋白质的分离纯化 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液，双缩脲试剂 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天

1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS

Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)

Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月

第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%

蛋白质提取方法

蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，

盐析法

盐析法综述 摘要：沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。盐析法是其中的一种，盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 关键词:沉淀法；盐析；原理；方法评价；蛋白质盐析 沉淀法 沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。 有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。、非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。最常用的是铅盐法，可以用于除去杂质，也可用于沉淀有效成分。沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合,在混合液中加人适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧,从而制得相应的粉体颗粒。一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 对沉淀形式的要求 （1）沉淀的溶解度要小，以保证被测组分能沉淀完全。 （2）沉淀要纯净，不应带入沉淀剂和其他杂质。 （3）沉淀易于过滤和洗涤，以便于操作和提高沉淀的纯度。 （4）沉淀易于转化为称量形式。 盐析法 胶体的盐析 胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低，形成沉底析出的

蛋白提取实验步骤51063

蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打， 或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保 存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复 冻融。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

蛋白提取方法

?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品

蛋白质提取综合性实验

生物化学综合性实验 蛋白质的提取（沉淀法）和定量分析之 鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定 一、实验目的 研究盐析沉淀和等电点沉淀法的基本原理和技术。 一、二、实验原理 1、沉淀法粗分离蛋白质[1][2] 沉淀法是分离纯化生物大分子物质常用的一种经典方法，可分盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等。 蛋白质分子表面含有带电荷的基团，这些基团与水分子有较大的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白质水溶液和稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。 由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它们在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到粗分离蛋白质的目的。 盐析法是1878年Hammarster首次使用的，可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸铵等，其中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大，25℃可达4.1mol/L的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分段效果较其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。 鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。 等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。 卵清蛋白的等电点为4.6-4.8，而球蛋的等电点是5.1。 2、蛋白质的测定 根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250染色法等。 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm之光密度，方可通过计算测得

提取蛋白的常规方法

1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间

盐析法沉淀蛋白质的原理

盐析法沉淀蛋白质的原理 1 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 ⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。

⑵中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯 度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的 （NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。 ⑶盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。

【实验操作】蛋白质的提取和分离实验操作

优选精品资源欢迎下载选用 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

【1】生物样本中蛋白质的提取及测定(分子医学实验)

《分子生物学实验》 实验报告 实验名称：生物样本中蛋白质的提取及测定 姓名：杰 学号：3140104666 组别： 同组同学：唐曦

带教教师：伟俞萍 实验日期：2015年9月15日 目录 1.原理： (3) 1.1生物样本中蛋白质的提取 (3) 1.2生物样本中蛋白质的测定 (3) 1.2.1 Lowry法 (3) 1.2.2 考马斯亮蓝法 (4) 1.2.3 紫外吸收法 (4) 2.操作步骤 (4) 2.1生物样本中蛋白质的提取 (4) 2.2生物样本中蛋白质的测定 (5) 2.2.1 Lowry法 (5) 2.2.2 考马斯亮蓝法 (5) 2.2.3紫外吸收法 (5) 3、实验结果 (6) 3.1 原始数据 (6) 3.1.1 Lowry法 (6) 3.1.2 考马斯亮蓝法 (7) 3.1.3 紫外吸收法 (7)

3.2 数据处理 (8) 3.2.1 Lowry法 (8) 3.2.2 考马斯亮蓝法 (9) 3.2.3 紫外吸收法 (10) 4.讨论： (11) 1.原理： 1.1生物样本中蛋白质的提取 离体不久的组织，在适宜的温度及pH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活；有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟，其含量即有明显的降低。因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需的脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。取出的脏器或组织，可根据不同的方法制成不同的组织样品。包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。由于动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。 1.2生物样本中蛋白质的测定 1.2.1 Lowry法 1921年，Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度，反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸-磷泪酸）生成蓝色

蛋白质的提取和分离实验操作

实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

蛋白质的提取与纯化

蛋白质的提取与纯化 一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等

中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。