PCR反应程序

PCR反应程序

1．常规程序

将PCR 反应所需的成分配置完后，在PCR 仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持 30 秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1 分钟（扩增1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成DNA ，完成一个循环。重复这样的循环25～35 次，使扩增的DNA 片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min ，使产物延伸完整，4℃保存。

2．复性（退火）和延伸温度

复性的温度是PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃

之间。具体的温度主要由引物的Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR 。

3．反应时间

变性步骤一般使用30 秒钟，如果模板的G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb 用1 分钟来保证充足的时间。

4．循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105 数量级时，循环数通常为25～35 次。

平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

5．PCR 反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA 聚合酶。早期的PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。对于使用具3’-5’ 外切活性的高温DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引物和dNTP ，以及调整体积的H2O ，B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。

按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。

热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决这一问题。将dNTP 、缓冲液，Mg2+和primer 先配制好，然后加入一粒蜡珠（如Ampli Wax PCR Qam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和DNA 聚合酶等剩余成分。只有当PCR 反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。

PCR技术的基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DN***段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DN***段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和

止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DN***段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是

3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化

一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL 的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K

来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR 扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，

若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DN***段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

紫花中的紫色物质是一种天然的优质色素，但由于B基因表达的酶较少，紫色物质含量较低。设想通过基因工程技术，采用重组的Ti质粒转移一段DNA进入细胞并且整合到染色体上，以促进B基因在花瓣细胞中的表达，提高紫色物质含量。下图是一个已插入外源DNA 片段的重组Ti质粒载体结构模式图。

（1）请填出标号所示结构的名称：

①------------；

②------------；

③------------；

④------------。

（2）T-DNA中的T和何种物质中的T含义相似？------------。（3）含有目的基因的最小结构是------------（填序号）。

（4）B基因位于①中吗？------------。

（5）图中------------不属于基因表达载体。

（6）②比①多出的结构有3个以上，请举2例------------。

答案：

（1）T-DNA；完整的目的基因；复制原点（标记基因，括号内是逆时针时的情况，下同）；标记基因（或复制原点）

（2）t-RNA

（3）①

（4）不，位于染色体中

（5）③（或④）（6）启动子；终止子

标准的PCR反应体系

标准的PCR反应体系 PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umolL 引物各10～100mol 模板DNA 01～2ug TqDNA聚合酶25u g2+ 15mmolL 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30b，常用为20b左右。 ②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH或1Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到70～75，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umolL，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与g2+结合，使游离的g2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质 结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法， 要防止RNse降解RNA。 g2+浓度g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umolL时，g2+浓度为15～20mmolL为宜。g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延 伸。对于较短靶基因(长度为100～300b时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。

PCR反应条件体系总结

PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板D NA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最 好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生 非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PC R失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克 隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1u mol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增， 且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高 可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不

PCR反应体系

PCR反应体系 2007-07-20 11:04:33 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降

q-pcr结果分析报告

摘要： 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Appl ied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。 1. 2－△△CT方法

PCR产物电泳结果分析

产物检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 假阴性，不出现扩增条带： PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

关于PCR总结

PCR总结 若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。 酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。 引物的设计原则 1．引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。 2．基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。 3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp 的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。 4．引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。 5．3’末端：引物的3’端（羟基端）是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。 6．溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的T m值（不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。），其差别不应大于5℃。扩增产物与引物的T m值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有

PCR结果异常分析

PCR结果异常分析 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。 PCR反应的关键环节有： ①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量及活性；④PCR 循环条件。 应寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 1．假阴性，不出现扩增条带 （1）模板： ①模板中含有杂蛋白质； ②模板中含有Taq酶抑制剂； ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白； ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚； ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序应固定不宜随意更改。 （2）酶失活： 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 （3）引物： 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： ①选定一个好的引物合成单位。 ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 ③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。 ④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 （4）Mg2+浓度： Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 （5）反应体积的改变： 通常进行PCR扩增采用的体积为20l、30l、50l或100l,用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20l 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 （6）物理原因： 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检

PCR反应体系有关的过程

PCR反应体系有关的过程 姓名：于烨敏学号：11243220 班级：113 第一部分 1、 PCR原料： DNA模板: 模板包含要用来扩增的靶基因区域，适当提高模板浓度，可减少循环次数，从而减少突变的发生和非特异性产物的形成；但过高的模板浓度会降低反应效率。 上游引物和下游引物： 是人工合成的短的单链DNA片段（寡核苷酸），经常由18-30个碱基组成，用来确定扩增区域的起止位点从而确定扩增的DNA片段大小；物与要扩增的双链DNA的两端精确互补，在退火中可以与DNA模板链特异性地结合。当引物与模板链结合后，DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的DNA链。引物的量不能太多，过多的引物导致非特异性扩增的发生和引物二聚体的形成。 聚合酶： 聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动，阅读DNA编码信息，填充正确的匹配核苷酸，催化DNA新链的合成；来源于生活在热泉中的一种细菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。由于Taq酶没有3'-5'外切酶活性，在复制DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。对于一般的PCR实验来讲，错误的产生不影响实验的结果；但特定的实验，如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶，如Tli或Pfu。由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单，扩增效率较高，因此可同其它酶混合起来以提高扩增长片段时的保真性。单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前，通常利用Taq酶在产物的3'末端增加一个多余的A碱基。 四种dNTP（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）： 是合成DNA新链的原料。dNTP的量与合成产物的大小有关，越长的片段需要越多的dNTP，但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。 缓冲液： 为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。 Mg离子： Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的，它通过稳定引物－模板相互作用而影响退火进程；同时也能稳定聚合酶同引物－模板形成的复制复合物，因此可以增加非特异性退火，进而形成非特异性产物。许多成分如EDTA和dNTP可以结合一部分Mg离子，所以Mg离子准确的用量需要实验来确定。一般来讲，低浓度的Mg离子增加复制的可信度，而高量的Mg离子降低特异性、引入突变。一般反应可通过变化温度、模板质和量而规避提高Mg量的操作。 添加剂： 1. 7-deaza-dGTP, Glycerol (5-10%), formamide (1-5%) or DMSO (2-10%)：当模板GC

PCR反应中基本成分(引物、dNTP、模板等)的作用

PCR反应中基本成分（引物、dNTP、模板等）的作用 PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA 与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA 与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 1、引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 2、酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反

PCR产物电泳结果分析

P C R产物电泳结果分析Last revision on 21 December 2020

产物检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带： PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。 ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

pcr数据分析

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： 1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。 2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。 一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是 10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： 1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。 3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！ 4. 所有成分加完后，离心去除气泡。 5. 每个样品至少3个平行孔。 参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！） 或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司

分析real-time PCR数据

用2-△△Ct法分析real-time PCR数据-----联合应用LightCycler Data Analysis软件和MS Excel By netmee，netmee@https://www.sodocs.net/doc/9a15591556.html, 引用请注明作者。 1、打开存取的数据文件，点击 2、依次点击，，这是适合SYBR green为染料的选项。点击step1：Baseline下的“change graph settings”小图标。取消弹出的Customize Graph 选项卡中的Logarithmis选项，点击“OK”按钮，退出选项卡。 3、点击下的“change graph settings”小图标 ，取消弹出的Customize Graph选项卡中的Logarithmis选项

，点击“OK”按钮，退出选项卡。 4、在选项卡中拖动红色标记线，选取个条曲线都为直线上升部位。 5、可以在选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。观察绿线部分与S型曲线交叉的部分是否为直线。 6、如果确为直线，则左侧的“Crossing Point”值为所需要的Ct值。

7、依次选取下图菜单：将数据导出为文本文件。 8、打开所保存的文本文件，如图选取

“Calculated Concentration”列。

10、将目的基因，本例中为“iNOS”的Ct值按标本对应剪切入beta-actin值右侧一列。分别标记两列数据为“beta-actin”和“iNOS”。 11、设置所有Ct值的单元格格式 12、数字选项卡，分类选择为数值，点击确定。

13、将E列（目的基因Ct值右侧一列）输入公式“=D4-C4”，求出目的基因与同管beta-actin Ct值之差，即△Ct。 14、向下拉复制公式，将△Ct列数值计算出。

PCR反应体系中各种成分的作用

PCR反应体系中各种成分的作用 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行ＰＣＲ扩增,发现在模板量<25ｎｇ的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ｎｇ左右时无扩增产物;当模板量在25ｎｇ～200ｎｇ之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ｎｇ时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μｌ的ＰＣＲ反应体系中,模板ＤＮＡ以25～100ｎｇ为最适用量。同时模板ＤＮＡ在200ｎｇ以下不影响扩增结果,但为降低ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ对反应体系中Ｍｇ2+的不良影响程度,应该尽量降低ＤＮＡ模板用量。 不同Ｍｇ2+浓度时实验结果 设置不同Ｍｇ2+浓度,当Ｍｇ2+浓度为1 0ｍＭ时,无ＰＣＲ扩增产物;Ｍｇ2+浓度为1 5～2 5ｍＭ时,随着Ｍｇ2+浓度的增加,ＰＣＲ扩增产物带型基本一致,但以2 0ｍＭ的扩增效果最好 不同引物浓度对ＰＣＲ结果的影响 设置5种不同浓度的引物进行ＰＣＲ扩增,当引物浓度在0 1～0 2μＭ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μＭ左右为宜。 不同ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ结果的影响

采用2种引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16),分别以4种不同的ｄＮＴＰ浓度进行ＰＣＲ反应,发现ｄＮＴＰ浓度在100μＭ、150μＭ、200μＭ、300μＭ时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当ｄＮＴＰ浓度<200μＭ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与ｄＮＴＰ浓度呈正相关。综合考虑,以100～200μＭ的ｄＮＴＰ浓度为佳。 ＴａｑＤＮＡ聚合酶对扩增结果的影响 设置5个梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度,结果表明随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5ｕ～2 5ｕ浓度间均有扩增产物,但随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度以1 0～1 5ｕ结果较好 不同退火温度下的扩增效果 引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01,按照优化的ＰＣＲ反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。 Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ互相作用及对ＰＣＲ反应的影响用同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比较3种ＭｇＣｌ2浓度与3种ｄＮＴＰ浓度完全随机相结合的9个处理的ＰＣＲ结果,研究了Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ的相互作用。结果表明,Ｍｇｃｌ2在低浓度时,

荧光定量PCR数据分析

利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量 METHODS 25, 402–408 (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT Method Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1 *Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534 摘要： 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 P CR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT 公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulleti n No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有

PCR反应程序

PCR反应程序 1．常规程序 将PCR 反应所需的成分配置完后，在PCR 仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持 30 秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1 分钟（扩增1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成DNA ，完成一个循环。重复这样的循环25～35 次，使扩增的DNA 片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min ，使产物延伸完整，4℃保存。 2．复性（退火）和延伸温度 复性的温度是PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR 。 3．反应时间 变性步骤一般使用30 秒钟，如果模板的G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb 用1 分钟来保证充足的时间。 4．循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105 数量级时，循环数通常为25～35 次。 平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。 5．PCR 反应液的配制 PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA 聚合酶。早期的PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。对于使用具3’-5’ 外切活性的高温DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引物和dNTP ，以及调整体积的H2O ，B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。 按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。

PCR反应体系与反应条件

PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质 结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取

酶切体系及PCR体系

酶切反应体系 1．反应体系尽可能的小。 2．酶切缓冲液为整个体系的十分之一，本实验室内切酶为NEB公司，缓冲液的选择，可参照该公司的使用说明。 3．内切酶的用量为反应体系的十至二十分之一（若为双酶切，则两种酶的总量占总反应体系的十至二十分之一），酶用量过大可能反而不利于酶切（因为内切酶中含有甘油）。4．DNA总量不宜大于2-3ug，否则在进行琼脂糖凝胶电泳时，会产生拖尾现象。 5．一般酶切温度为37℃水浴1-2h (小样鉴定1-2h，如要酶切回收，应切5-8h,特别是单酶切的载体，一定要切全,还应加去磷酸酶1-2h)。 6．一般小样鉴定为20ul总体系（酶一般用0.5ul），酶切回收为50-100ul总体系(酶一般用2-3ul，酶切3-4h后，可补加酶1ul)。 7．一般65℃水浴15分钟，灭活内切酶（也可不灭或，因为加入溴酚蓝后酶就失活了）。8．用0.8-1.2%的琼脂糖凝胶电泳。 PCR反应体系 1．反应体系一般为20-25ul 2．摸板：菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul 3．引物：25umol/l 各0.5ul 4．dNTP : 0.5ul 5．10X Buffer: 如含Mgcl2的为总体系的十分之一（2-2.5ul）,如不含Mg cl2，应加入Mgcl2溶液1.5ul 6．Taq酶：0.5ul 7．加入Milli Q水，补齐至20-25ul PCR参数 1．95-96℃3-5 min 2. 95-96℃30-40 Sec 3. (TM-5℃)一般为45-60℃30-40 Sec 4．72℃ 30-180 Sec（一般一分钟为1000个碱基）5．72℃链延伸10 min 6. 10℃保存 以上只用于普通PCR，一般为鉴定用。

PCR体系优化

由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该 酶的PCR反应体系。 A镁离子浓度 镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要。模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量。如果游离的镁离子含量不够，那么Taq DNA聚合酶则无法行使功能（figurel）。过多的游离镁离子 则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增。因此，研究者应当根据实际的实验结果来 优化每一反应中镁离子的浓度。可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为 1~4mM每次增加或降低 0.5~1 mM扩增产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如， Pfu DNA聚合酶似乎对镁离 子的依赖性更低，但其优化范围通常为2~6mM 许多DNA聚合酶产品提供 Mg-free reaction buffer和单独一管 25mMMgCl2，这样就可以自行调节 Mg+浓度，优化反应体系。MgC2溶液在反复冻融后会出现浓度分层，为获得均 一的溶液，在配液的时候，要确保MgCb溶液完全溶解并充分震荡混匀。非常简单的两步， 溶解和混匀，常常会造成实验失败。 有些科学家倾向于使用包含MgCb的buffer , MgC2的终浓度为1.5mM。值得注意的是有 文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM 的变化，如果在90C加热10min，则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCb 可能会有沉淀现象发生。 M12345678 2.645 1.605 1.198- 0 0.5 10 1.5 2,0 2.5 3,0 3.5