转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程

转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程（编号：019）

1、目的及适用范围

该SOP用来建立稳定表达目的蛋白的细胞系。

2、主要仪器及试剂

CO2细胞培养箱、生物安全柜、酶标仪、转膜仪、电泳仪、DMEM培养基、胎牛血清、0.025%胰酶、筛选药物（抗生素）

3、操作步骤

3.1 确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。

3.1.1提前24h在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2细胞培养箱中37℃培养过夜。

3.1.2 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（如：0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/mL），此梯度因抗生素而异。

3.1.3培养10-14d以绝大部分细胞死亡浓度为准,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半。

3.2 转染按转染试剂说明书步骤进行。

3.3 转染48h后按1:10的比例将转染细胞传代到6孔板中，换成含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。

3.3.1滤纸片法：用消毒的5×5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15s，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。细胞在24孔板中长满后转入35mm培养皿中，长满后再转入10cm皿中扩大培养。

3.3.2有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-2～10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔培养板中培养，7-10d后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

3.4 ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。

4、问题向导

目的蛋白没有得到表达可能原因：

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稳定性试验操作规程

稳定性试验操作规程 一、目的： 保健食品稳定性试验是指保健食品通过一定程序和方法的试验，考察样品的感官、化学、物理及生物学的变化情况。通过稳定性试验，考察样品在不同环境条件下（如温度、相对湿度等）的感官、化学、物理及生物学随时间增加其变化程度和规律，从而判断样品包装、贮存条件和保质期内的稳定性。 二、适用范围： 所有市售批次产品。 二、稳定性试验的要求： 1.稳定性试验包括长期试验和加速试验。长期试验和加速试验考察产品质量稳定性的样品，总体考察时间应涵盖所预期的保质期，长期试验和加速试验的数据应以与0月数据相比无明显改变。 2.长期试验和加速试验适用于软硬胶囊及固体制剂的保健品, 供试品取样量是全检量的两倍。供试品应是市售包装一致的产品。 3.长期试验和加速试验供试品的质量标准应与市售产品质量标准一致。 4.加速试验所用设备：应能控制温度±2℃，相对湿度±5%，并能对真实温度和湿度进行监控。 4.研究保健品稳定性，要采用专属性强、准确、精密、灵活的分析方

法，并对方法进行验证以保证供试品稳定性试验结果的可靠性。 三、保健品的稳定性试验： 1.加速试验： 加速试验是在超常的条件下进行的。其目的是通过加速供试品的化学或物理变化，探讨供试品的稳定性，为供试品审评、包装、运输及储存提供必要的资料。要求供试品，在温度37℃±2℃、相对湿度75%±5% 的条件下放置3个月，避免光线直射。在试验期间第0个月、1个月、2个月、3个月末各取样一次，按稳定性重点考察项目进行检测。将结果与0月的数据比较，以确定样品的有效期。 2.长期试验： 长期试验是在接近供试品的实际储存条件下进行，其目的为制订样品的有效期提供数据。要求供试品，在温度25℃±2℃、相对湿度60%±10% 的条件下放置至保质期，避免光线直射。第一年每 3 个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月，按稳定性重点考察项目进行检测。第二年，分别于18个月、24个月、36个月仍需继续考察，取样按稳定性重点考察项目进行检测。第三年以后一年取一次。将结果与0月的数据比较，以确定样品的有效期。 四.稳定性重点考察项目： 保健品主要剂型的重点考察项目见附表，表中未列入的考察项目，可根据样品的特点再定。 附表保健品稳定性重点考察项目参考表

整理)慢病毒稳转细胞株步骤

稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基

试验药物留样标准操作规程

修订历史 REVISION HISTORY 航天中心医院药物临床试验机构 Medical Institution Conducting Clinical Trials For Human Used Drug, Aerospace Center Hospital

一、目的 规范试验用药的留样，保证留样样品的真实性与试验用药的可溯源；保证留样的抽样方法、留样量、保存方法符合按质量标准全检的要求。 二、适用范围 生物利用度和生物等效性类试验用药，其他类试验参照此SOP执行。 留样样品包括试验药品（制剂）、参比制剂或对照药品（含安慰剂）。 三、涉及的人员和岗位 机构办公室、机构试验用药管理员，Ⅰ期、各临床专业组及其试验用药管理员。 四、标准操作规程 1 专业组、机构办公室与申办者和/或CRO确定项目委托协议时，明确下述内容。 1.1 生物利用度和生物等效性类试验的试验用药必需留样，其他类试验尽可能留样。留样操作遵从本文件的规定。 1.2 申办者对试验用药的包装方式需便于试验用药的随机抽取和留样样品的保存。 盲法试验的包装条件：申办者需以单位剂量进行包装、在每个包装上标有随机编码；以药品组的形式向我机构提供，各组完全一致且每组编有随机编码，每组样品均足够临床试验使用，组数应满足试验使用和留样“5倍量”的要求。 1.3 试验用药的供应量需满足试验使用和留样量的相关技术指导原则的规定。应注意遵从“按批留样”的规范要求，即与申办者按批核算供应量。 2 试验用药留样的基本规范从申办者提供的全部试验用药中随机抽取进行临床试验试验的药品和用于留样的样品，确保留样样品由申办者提供的进行试验用的同批产品中获得。 3 试验用药的试验使用与留样程序 试验用药递送至我机构，经验收、入库保存在机构试验药房。试验启动时，随机抽取试验用药品、一次性或分次对专业组发放。使用完成后，随机抽取留样样品或全部作为留样样品，使用剩余的试验用药需并入留样样品。试验用药使用后的包装一并留样保存。

药品稳定性试验标准操作规程

目的：考核药品质量稳定性，为确定药品的合理有效期提供科学依据。 范围：原料、中间产品、成品的稳定性试验 1．药物稳定性试验的目的是考察药物在规定的条件下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期。 2．稳定性试验的基本要求 2.1稳定性试验包括影响因素试验、加速试验和长期试验。其中影响因素试验适用于原料药，而加速试验和长期试验适用于原料药和制剂。 2.2 加速试验和长期试验样品所用容器、包装材料和包装方式应与上市产品一致。 2.3 应重视有关物质的检查。 3．影响因素试验 影响因素试验是在比加速试验更强烈的条件下进行，其目的是探讨药物的固有稳定性，了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件与建立降解产物的分析方法提供科学依据。试验时，将样品置于适宜的容器中，摊成≤5mm厚的薄层，疏松原料药可摊成≤10mm厚的薄层，进行以下试验： 3.1高温试验 3.1.1将供试品置于适宜的容器中（如称量瓶或培养皿中）摊成≤5mm厚的薄层，疏松原料药可摊成≤10mm厚的薄层，在60℃下放置10天，于第5天和

第10天取样，按照稳定性重点考察项目进行检测，即：性状、熔点、含量、有关物质、吸湿性、以及根据药品性质选定的考察项目。 3.1.2 若检测结果与0天结果比较，有明显变化（如含量下降5%），则40℃下按同法进行试验。如60℃的结果无明显变化，不再进行40℃试验。 3.2 高湿度试验 在25℃将供试品开口置于相对湿度90±5%的恒湿密闭容器中（在密闭容器中放置硝酸钾饱和溶液），放置10天，于第5天和第10天取样，检验上述项目，重点考察供试品的吸湿性。如吸湿增重5%以上，则在相对湿度75±5%条件下（在密闭容器中放置氯化钠饱和溶液），同法进行试验。如吸湿增重5%以下，而且其他项目符合要求，则不再进行此项试验。 3.3 强光照射试验 将供试品开口置于装有日光灯的光照箱或适宜的光照箱中，照度为4500±500lx，放置10天，于第5天和第10天取样，检验上述项目，特别要注意外观的变化。光照箱要有恒定的照度，要注意防尘。 4．加速试验 4.1加速试验是在超常的条件下进行，其目的是通过加速药物的化学或物理变化，探讨药物的稳定性，为药品评审、包装、运输及贮存提供必要的资料。具体试验方法为： 取供试品三批，按市售包装，在温度40±2℃，相对湿度75±5%（在密闭容器中放置氯化钠饱和溶液）条件下，放置六个月。分别在第1个月、2个月、3个月、6个月末取样检测。按稳定性重点考察项目检测。如在6个月内供试品经检测不符合质量标准，则应在30±2℃，相对湿度60±5%（在密闭容器中放置亚硝酸钠饱和溶液）条件下，同法进行加速试验，时间仍为6个月。 4.2对温度特别敏感的药物，预计只能在冰箱中（4～8℃）保存的药物，其加速试验，可在25±2℃、相对湿度60±5%（在密闭容器中放置亚硝酸钠饱和溶液）条件下进行，时间为6个月。 4.3 对于包装在半透性容器的制剂，如塑料袋装溶液、塑料瓶装滴眼剂和滴

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4

(一)筛选结果鉴定: （1)基因组ＤＮＡ提取→PＣR鉴定外源基因 （２)SHG－44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-４4-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定Ｐ16蛋白表达(Westeｒn-blot)。 (3)测定外源性基因对ＳHＧ-４４细胞增殖的影响 ①流式细胞仪分析：SHG-４4、ＳHＧ－44-vect、SＨG-44-重组ｐｃDＮA3→单细胞悬液→７0%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、Ｓ期比例。 ②细胞生长曲线测定：SHG-4４、SHＧ-4４-vect、SＨG-44-重组ｐcＤ NA3→5×104/孔接种２4孔培养板→２４hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。 ③软琼脂克隆形成率分析:SHG－44、SＨＧ-44－vect、ＳHG-44－重组pｃDNA3→1０4细胞→0.3％低熔点琼脂糖培养→１－２周后计数不可少于５0个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。 三、注意事项 1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和ＤNA 混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下,这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体／DNA混合物无需滤过除菌。 ２、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体／ＤＮＡ与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。 3、在转染之前更换培养基,可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。 ４、脂质体／DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。 常见问题和解答： Q：我觉得套环法操作不如９6孔办法效率高。 A：也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用９6孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆．即使是增加到每

(完整版)检验方法验证标准操作规程

标准操作规程STANDARD OPERATING PROCEDURE 目的：建立检验方法验证标准操作规程，规范验证操作。 适用范围：所有检验方法的验证。 责任者：质量保证部、质量控制部 程序： 1、检验方法验证的基本内容 检验方法验证的基本内容包括方案的起草及审批，检测仪器的确认．适用性验证(包括准确度试验、精密度测定．线性范围试验、专属性试验等)和结果评价及批准四个欠的方面。它的基本内容可以用下图表示。 2、检验方法验证的基本步骤 首先是制定验证方案，然后对大型精密仪器进行确认，最关键的一步是检验方法的适用性试验，最后是检验方法评价及批准。 2．1验证方案的制定 检验方法的验证方案通常由质量验证小组提出。根据产品的工艺条件、原辅料化学结构、中间体、分解产物查阅有关资料，提出规格标准，确定检查项目，规定杂质限度，即为质量标准草案。根据质量标准草案确定检查和试验范围，对检验方法拟定具体操作步骤，最后经有关标题检验方法验证标准操作规程共7页第1页 制定人颁发部门GMP办公室编号： SOP--F—004 分发部门质量验证小组、质量保证部新订√替代 审核人批准人生效日期年月日

人员审批方可实施。 2．2大型精密仪器的确认 分析测试中所用的检测仪器一般可分为三类 (1)普通仪器：崩解仪，折光仪、分析天平、酸度计、溶点测定仪、电导仪等： (2)较精密仪器：旋光仪、永停滴定仪、费休氏水分测定仪、自动滴定仪、药物溶出度仪、可 共7页第2页见分光光度计、电泳仪等； (3)大型精密仪器：紫外分光光度计、红外分光光度计、气相色谱仪、高效液相色谱仪、薄层扫描仪等。 为了保证分析测试数据准确可靠，每台检测仪器在投入正式使用之前都应进行确认。检测仪器的确认是检验方法验证的基础，应在其它验证试验开始之前首先完成。检测仪器确认工作内容应根据仪器类型。技术性能而定，通常包括：安装确认、校正、适用性预试验和再确认。2．2．1安装确认 同工艺验证中机械设备一样，仪器安装确认的土要内容包括如下各点： (1)要登记仪器名称．型号。生产厂商的编号、生产日期．生产厂商名称，企业内部的固定资产设备登记号及安装地点； (2)收集汇编和翻译仪器使用说明书和维修保养手册； (3)检查并记录所验收的仪器是否符合厂方规定的规格标准： (4)检查并确保有该仪器的使用说明书。维修保养手册和备件清单： (5)检查安装是否恰当，气、电及管路连接是否符合要求； (6)制定仪器标准操作规程(SOP)和维修保养制度，建立使用记录和维修记录； (7)制定清洗规程；． (8)明确仪器设备技术资抖(图纸，手册，备件清单、各种指南及该机器设备有关的其它文件)的专管人员及存放地点。 除上面提到的内容外，在安装确认方案中对仪器的性能用途应有一概述并记录维修服务单位名称。联系人、电话号码、传真号、银行帐号等，以利于日后的维修保养活动，这对大型精密仪器尤为重要。对于仪器来说，安装确认中的一项重要内容是功能试验。这项工作在安装结

拉力试验机安全操作规程

2.范围：实验室测定用拉力试验机。 3.权责：技术研发部、品质部。 4.定义：无 5.内容： 5.1 打开试验仪器主电源，开启PC操作主机。 5.2 启动程序软件，选择对应的传感器联机。 5.3 在“输入用户参数”窗口选择需做的试验方案模式。 5.4 输入存盘文件名，或采用默认文件名。 5.5 测量式样品尺寸，并输入包含试验标距、式样直径等相关数据。 5.6 安装夹具，夹持式样品。 5.6.1 选用适当的夹具或连接头，装入试验仪器上的接口内，插入插销，旋紧锁紧螺母。 5.6.2 调试仪器横梁高度，把试样安装在两端夹具或连接头上，再调整高度，保持式样垂直。 5.6.3 将软件界面上的力值和位移项目清零。 5.7 调试或发送衡量移动速度，开始试验，软件自动切换到试验界面。 5.8 观察试验过程，运行中若出现意外情况应立即停止试验。（点击软件按钮或拍仪器上的急停按钮）。 5.9如果当变形达到试验方案设置的引伸计切换点时，程序有提示窗口，试验进入力保持状态，卸下引伸计，关闭提示窗口，试验继续运行。 5.10试验结束，在试验结果栏中，程序自动计算结果并生成曲线。 5.11输入试验结果（断后标据、拉脱拉断）。 5.12如果还有试样品，如果已输入式样尺寸，请重复6-11步，如果还未输式样尺寸，请重复5-11步。 5.13关闭PC操作主机，关闭试验仪器主电源。 6.注意事项： 6.1开机时主机和计算机的开机顺序会影响计算机的通讯初始化设置，所以务必请用户严格按照上述开机顺序进行。 6.2每次开机后要预热5分钟，待系统稳定后，才可进行试验工作。 6.3如果刚刚开机，需要再开机，至少保证1分钟的间隔时间。 6.4在更换夹具后，首先要注意调整好可调挡圈。 6.5尤其在用小力值传感器做试验时，一定要调整好可调挡圈的位置，以免操作失误而损坏小力值传感器。 6.6大变形在不使用时，请将两夹头放入保护装置内，或将其旋转开，以免移动横梁在移动过程中撞坏夹头。 6.7任何时候都不能带电插拨电源线，否则很容易损坏电气控制部分。 6.8试验过程中，不能远离试验机。

持续稳定性考察管理规程

标题持续稳定性考察管理规程 编制记载分发记载 起草人：年月日文件编码：发布号： 审核人：年月日分发部门：复印号： 批准人：年月日 质量部发布 生效日：年月日 目的：建立持续稳定性考察管理规程，对上市后生产的药品继续进行稳定性考察和研究，监测在有效期内药品的质量，为规范此项工作而建立管理规程。 范围：主要适用于市售包装药品以及待包装产品。 主责：质量部、质量控制实验室。 释义： 关联： 正文： 1 持续稳定性考察的目的： 是在有效期内监控药品质量，以发现药品与生产相关的稳定性问题（如杂质含量或溶出度特性的变化），并确定药品能够在标示的贮存条件下，符合质量标准的各项要求。 2 持续稳定性考察对象： 主要针对市售包装药品。但也需兼顾待包装产品。还应当考虑对贮存时间较长的中间产品进行考察。 3 稳定性考察方案：每个品种需要制定考察方案，考察方案应由质量受权人批准执行。 3.1 考察方案应涵盖药品有效期； 3.2 每种规格、每个生产批量药品的考察批次数；

3.3 制定考察项目、检验方法依据及合格标准； 3.4 容器密封系统的描述； 3.5 考察周期及检验频次； 3.6 贮存条件（采用与药品标示贮存条件相对应的《中华人民共和国药典》规定的 长期稳定性试验标准条件）。 4 稳定性考察留样原则及批次数量： 4.1 产品批准上市后首次生产的前三批验证产品，对不同包装材料及包装规格的销售产品均要分别留样进行长期稳定性考察。 4.2 生产第二年起各年的产品，对生产的每种规格、每种内包装形式的药品，至少每年应当留取一批进行持续稳定性考察。 4.3 有重大变更或生产和包装有重大偏差的药品应当列入稳定性考察。改变原辅料、与药品直接接触的包装材料变更、生产工艺、主要生产设备及其他影响药品质量的主要因素变更时，应当对变更实施后生产的药品留样三批进行加速试验和长期稳定性试验。 4.4 重新加工、返工或回收的批次，也应当留样进行加速试验和长期稳定性试验。 4.5 考察样品留样数量：按照取样频次、考察项目、考察期内所需的全检量。 5 产品稳定性考察试验计划： 5.1 根据每年的生产情况，按要求填写每个品种“产品稳定性考察试验计划表”，按照计划进行稳定性试验管理。 5.2 产品稳定性考察试验计划表内容，产品名称、批号、规格、生产日期、有效期至、取样日期、检验时间、检验用量、考察目的、考察周期、考察期至。 5.3 样品提取要求： 5.3.1 样品必须按照稳定性试验计划从恒温恒湿箱和其他储存条件下按时取出，样品取样时间偏差范围：

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5

Q：G418怎么配制？ A：我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES 溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。 Good answer: 推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L HEPES 的简单配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度 15-20mM。 Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过G418杀伤曲线，300ug\ml 就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行？会不会有什么问题？ A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul 加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。 Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418？如果要加的话什么浓度比较合适？

检验方法验证标准操作规程

标准操作规程 STANDARD OPERATING PROCEDURE 目的：建立检验方法验证标准操作规程，规范验证操作。 适用范围：所有检验方法的验证。 责任者：质量保证部、质量控制部 程序： 1、检验方法验证的基本内容 检验方法验证的基本内容包括方案的起草及审批，检测仪器的确认．适用性验证(包括准确度试验、精密度测定．线性范围试验、专属性试验等)和结果评价及批准四个欠的方面。它的基本内容可以用下图表示。 2、检验方法验证的基本步骤 首先是制定验证方案，然后对大型精密仪器进行确认，最关键的一步是检验方法的适用性试验，最后是检验方法评价及批准。 2．1验证方案的制定 检验方法的验证方案通常由质量验证小组提出。根据产品的工艺条件、原辅料化学结构、中间体、分解产物查阅有关资料，提出规格标准，确定检查项目，规定杂质限度，即为质量标准草案。根据质量标准草案确定检查和试验范围，对检验方法拟定具体操作步骤，最后经有关人员审批方可实施。 2．2大型精密仪器的确认 分析测试中所用的检测仪器一般可分为三类 (1)普通仪器：崩解仪，折光仪、分析天平、酸度计、溶点测定仪、电导仪等： (2)较精密仪器：旋光仪、永停滴定仪、费休氏水分测定仪、自动滴定仪、药物溶出度仪、可

见分光光度计、电泳仪等； (3)大型精密仪器：紫外分光光度计、红外分光光度计、气相色谱仪、高效液相色谱仪、薄层扫描仪等。 为了保证分析测试数据准确可靠，每台检测仪器在投入正式使用之前都应进行确认。检测仪器的确认是检验方法验证的基础，应在其它验证试验开始之前首先完成。检测仪器确认工作内容应根据仪器类型。技术性能而定，通常包括：安装确认、校正、适用性预试验和再确认。2．2．1安装确认 同工艺验证中机械设备一样，仪器安装确认的土要内容包括如下各点： (1)要登记仪器名称．型号。生产厂商的编号、生产日期．生产厂商名称，企业内部的固定资产设备登记号及安装地点； (2)收集汇编和翻译仪器使用说明书和维修保养手册； (3)检查并记录所验收的仪器是否符合厂方规定的规格标准： (4)检查并确保有该仪器的使用说明书。维修保养手册和备件清单： (5)检查安装是否恰当，气、电及管路连接是否符合要求； (6)制定仪器标准操作规程(SOP)和维修保养制度，建立使用记录和维修记录； (7)制定清洗规程；． (8)明确仪器设备技术资抖(图纸，手册，备件清单、各种指南及该机器设备有关的其它文件)的专管人员及存放地点。 除上面提到的内容外，在安装确认方案中对仪器的性能用途应有一概述并记录维修服务单位名称。联系人、电话号码、传真号、银行帐号等，以利于日后的维修保养活动，这对大型精密仪器尤为重要。对于仪器来说，安装确认中的一项重要内容是功能试验。这项工作在安装结束，检查合格后即可着手进行。仪器功能试验足在不使用样品的前提下，确认仪器达到设计要求，也可认为是空载试验。例如气相色谱仪的程序升温设定后能否按设定程序执行，溶出仪转速能否达到规定的性能要求。紫外分光光度计的吸收度与透光率的转换是否符合要求。高效液相色谱仪高压泵过压保护是否起作用等，这是检查仪器安装后能达到规定的性能指标。对普通仪器进行的功能试验比较简单，有的除仪器校正外，没有其它特殊的功能试验要做，如酸度计，电导仪，折光仪等。不同的仪器有不同的技术标准，应根据仪器使用说明书的要求进行试验。 2．2．2校正 校正是仪器确认及检验方法验证中的一个重要环节，应当在验证试验以前进行校正。紫外分光光度计校正包括波长校正、吸收度测试、准确度测试、杂散光检查。 气相色谱仪与高效液相色谱仪均要求做系统适用性试验。在规定的色谱条件下测定色谱柱的最小理论塔板数。分离度和拖尾因子，并规定变异系数应不大于2％。 对于化学检验中使用的计量仪器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均应校正。

振动试验台安全技术操作规程简易版

The Daily Operation Mode, It Includes All The Implementation Items, And Acts To Regulate Individual Actions, Regulate Or Limit All Their Behaviors, And Finally Simplify Management Process. 编订：XXXXXXXX 20XX年XX月XX日 振动试验台安全技术操作 规程简易版

振动试验台安全技术操作规程简易 版 温馨提示：本操作规程文件应用在日常的规则或运作模式中，包含所有的执行事项，并作用于规范个体行动，规范或限制其所有行为，最终实现简化管理过程，提高管理效率。文档下载完成后可以直接编辑，请根据自己的需求进行套用。 ?物品放置：将振动试验的物品放入试验 台上的夹具中，用扳手将固定螺丝拧紧，防止 振动中物品脱落损坏； ?开机：打开启动按钮，此时听到“嗒” 的一声，表示振动台电源接通，如果没有声 音，则先按停止按钮再重新按启动按钮； ?振动频率调节：根据实际情况，把频率 调节旋钮旋到合适位置，在调整频率过程中， 需缓慢调节，以防瞬间频率过高，将物品振 坏； ?关机：振动实验结束后．先把频率按钮

调至0Hz，然后按下停止按钮，取下试验物品，关闭振动台电源； ?振动台要固定位置，防止滑动； ?振动台所放物品一定要保持平衡，以防物品不平衡而在振动过程中损坏； ?插拔电源插头时，要小心操作，以防被电击伤； ?振动过程中，切忌用手触摸被振物品，以防振动中的物品将手击伤； ?试验台经常保持清洁，长期不用应套好塑料防尘罩，放置在干燥的环境内。 该位置可填写公司名或者个人品牌名 Company name or personal brand name can be filled in this position

实验室常见仪器使用标准及操作规程SICOLAB

超净工作台 标准： A.根据环境的洁净程度，可定期（一般2～3个月）将粗滤布拆下清洗予以更换； B.定期（一般为一周）对超净工作台环境进行灭菌，同时，经常用纱布沾上酒精或丙酮有机溶剂将紫外杀菌灯外表面揩擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌效果； C.当加大风机电压不能使操作风速达到0.32m/s时，必须更换高效空气过滤器； D.更换高效空气过滤器时可打开顶盖，更换时应注意过滤器上的箭头标志，箭头指向即为层气流流向； E.更换高效空气过滤气后，应用尘埃粒子计数器检查四周边框密封是否良好，调节风机电压，使操作平均风速保持在0.32～0.48m/s范围内，再有用Y09-4型尘埃粒子计数器检查洁净度。操作规程： A.使用工作台时，应提前1小时开机，同时开启紫外灭菌灯，处理操作区内表面积累的微生物，三十分钟后关闭杀菌灯； B.新安装的或长期未使用的工作台，使用前必须对工作台和周围环境先用超净真空吸尘器或用不产生纤维的工具进行清洁工作台，再采用药物灭菌法和紫外线灭菌法进行灭菌处理； C.操作区内不允许存放不必要的物品，以保持操作区的洁净气流流型不受干扰； D.操作区内应尽量避免作明显扰乱气流流型的动作； E.操作区内的使用温度不得大于60℃。 冰箱 使用标准： A.在冰箱接入电源之前，请仔细核对冰箱的电压范围和电源电压是否相等； B.冰箱必须有干燥的接地，如果电气线路没有接地，那么必须请电工将冰箱单独接地； C.不可将汽油、酒精、胶粘剂等易燃、易爆品放入冰箱内，以免引起爆炸； D.冰箱不能在有可燃性气体的环境中使用，如发现可燃气体泄漏，千万不可拔去电源插头，关闭温控器或灯开关，否则会产生电火花，引起爆炸； E.切勿用水喷洒冰箱顶部，以免使电气零件受损，发生危险； F.清洁保养及搬动冰箱时必须切断电源，并小心操作，不让电气元件受损； G.冰箱应放置在平坦、坚实的地面上，如放置不平，可调节箱底平脚； H.冰箱应放置在通风干燥，远离热源的地方，并避免阳光直射； I.冰箱在一般使用时，会结霜，当结霜特别严重时，可关机或关掉电源进行人工化霜，必要时可打开柜门加速霜层融化； J.当冰箱搁置不用时或长时间使用箱内出现异味时，必须进行清理； K.不可用酸、化学稀释剂，汽油、苯之类物品清洗冰箱任何部件； L.箱内不要放熟的食品，热的仪器必须冷却至室温后，再放入箱内； 操作规程： A.首次通电或长时间不用重新通电时，由于箱内外温度接近，为迅速进入冷藏状态，可把温度调至最冷处，待冰箱连续运行2～3小时，箱温降低后，再将温度调至适当位置； B.在使用中，不要经常调动温度控制器； 电子天平 操作规程： A.将电子天平置于稳固、平整的台面上； B.插上电源，打开开关；

药物稳定性试验指导原则(2015版药典)分析

范围：药物制剂。 责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。 内容： 稳定性试验的目的是考察原料药或药物制剂在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期。 稳定性试验的基本要求是：（1）稳定性试验包括影响因素试验、加速试验与长期试验。影响因素试验用1批原料药进行。加速试验与长期试验要求用3批供试品进行。（2）原料药供试品应是一定规模生产的。供试品量相当于制剂稳定性实验所要求的批量，原料药物合成工艺路线、方法、步骤应与大生产一致。药物制剂的供试品应是放大试验的产品其处方与生产工艺应与大生产一致。药物制剂如片剂、胶囊剂，每批放大试验的规模，片剂至少应为10 000片，胶囊剂至少应为10 000粒。大体积包装的制剂如静脉输液等，每批放大规模的数量至少应为各项试验所需总量的10倍。特殊剂型、特殊品种所需数量，根据具体情况另定。(3)供试品的质量标准应与临床前研究及临床试验和规模生产所使用的供试品质量标准一致。(4)加速试验与长期试验所用供试品的包装应与上市产品一致。(5)研究药物稳定性，要采用专属性强、准确、精密、灵敏的药物分析方法与有关物质(含降解产物及其他变化所生成的产物)的检查方法，并对方法进行验证，以保证药物稳定性试验结果的可靠性。在稳定性试验中，应重视降解产物的检查。（6）由于放大试验比规模生产的数量要小，故申报者应承诺在获得批准后，从放大试验转入规模生产时，对最初通过生产验证的3批规模生产的产品仍需进行加速试验与长期稳定性试验。 本指导原则分两部分，第一部分为原料药，第二部分为药物制剂。 1.原料药 原料药要进行以下试验。 1.1影响因素试验 此项试验是在比加速试验更激烈的条件下进行。其目的是探讨药物的固有稳定性、了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件与建立降解产物的分析方法提供科学依据。供试品可以用一批原料药进行，将供试品置适宜的开口容器中(如称量瓶或培养皿)，摊成≤5mm厚的薄层，疏松原料药摊成≤10mm厚薄层，进行以下

如何选择合适的细胞稳转株

如何选择合适的细胞稳转株 细胞稳转株是一种经过特定基因修饰的细胞株，可根据实验所需表达外源基因、进行基因敲除、敲入、以及精确改变基因序列（如点突变）。对比一般瞬转方法，利用细胞稳转株开展实验能够获得长期而稳定的特定性状，因此有助于增强实验的可重复性。细胞稳转株除了可用于基因调控研究，也非常适合于长周期的药物筛选和药理学研究、重组蛋白和抗体生产等实验。载体家凭借其资源完备的载体定制平台，通过病毒转导常规肿瘤细胞的方式可构建多种应用类型的细胞稳转株。 过表达模型细胞稳转株 通过慢病毒系统或转座子系统将外源基因表达框稳定整合进靶细胞基因组，实现外源基因在靶细胞的长期稳定表达。对比瞬转方法，构建过表达稳转株可避免瞬转中因转染效率导致的表达效率不一致的问题。构建好的细胞株中的外源基因不会因为细胞传代而丢失，可以持续表达特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究，重复实验时不需要对细胞重新转染质粒，大为节省了实验时间。 诱导表达模型细胞稳转株 采用Tet-on系统进行诱导表达目的基因，虽然可以直接进行质粒瞬转，但是载体家亦提供该类载体的慢病毒包装以构建相关的稳转细胞株。构建好的Tet-On系统细胞株同时表达tTS和rtTA 两种转录调控因子,而目的基因的表达可受四环素调控。其中tTS在四环素不存在的情况下会结合目的基因的上游TRE启动子，抑制目的基因表达。在细胞体系中添加四环素或其类似物后，rtTA进行响应并结合TRE启动子，激活目的基因表达。 shRNA干扰模型细胞稳转株 shRNA稳转株一般使用慢病毒或逆转录病毒在靶细胞基因组中导入shRNA表达框，实现shRNA在细胞系中的长期稳定表达。不同于siRNA瞬转，shRNA稳转株可内源性地稳定表达siRNA效果，不受转染效率影响，从而获得更稳定的基因敲低效果 CRISPR基因编辑细胞稳转株 构建CRISPR基因编辑细胞稳转株是当今研究基因和细胞功能关系的流行工具。通过gRNA引导Cas9靶向靶细胞基因组特定序列的CRISPR基因编辑，如基因敲除、敲入和定点突变，可以从DNA水平修饰靶细胞的基因序列。载体家提供两种gRNA表达模式，第一种是转导gRNA/Cas9共表达载体，gRNA和Cas9在细胞株中同时表达。第二种是构建Cas9表达稳转株，再根据实验需求导入gRNA表达载体。使用单Cas9表达稳转株可以获得更大的实验灵活性，如导入多个gRNA打靶GOI，或者多个gRNA与多种Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之间进行搭配等。

PCR实验室标准操作规程

ＰCR实验室作业指导书 文件编号: 第1版 编制: 审核: 批准: 生效日期:２015年*月*日 质管部

ＰCR实验室公正性声明 1、坚持公正立场认真对待每一例检测,不受任何对检测工作质量有不良影响得、来自实验室 内部或外部得不正当得商业、财务与其她方面得压力与影响。避免卷入任何可能会降低技术能力、公正性、判断或运作诚实性得信任得活动。 2、严格遵循实验室认可依据得国际标准,严格按标准得管理要素与技术要素得要求建立自我 完善得管理体系与控制检测全过程各环节得机制,所有与检测有关得人员熟悉与之相关得质量文件，并在工作中执行这些政策与程序,真正把标准作为科学管理检测实验室得先进管理模式,尽可能把差错降到最低限度,确保检测数据准确可靠,检测结果与技术判断正确有效。 3、坚持以“客户为中心、质量第一”得服务宗旨,严格保护客户得机密与所有权,热忱提供优 质服务,努力实现让上级放心、客户满意得服务标准。 4、主动开展实验室得比对实验与其她有效地检测质量监控方案,并通过日常检测得监督机制, 持续改进、不断完善管理体系,从而保证其充分性与有效性。 修订页

目录 前言 (1) 质量方针 (2) 质量管理体系组织结构图 (3) 一、工作制度?４ PCR实验室得设置及管理规程 (4) PＣR实验室内务管理规程.................................................................................................................................... ５PCＲ实验室人员得配置及管理规程?6 ＰCR实验室管理规程 (8) PＣR实验室生物安全防护措施? 11 12 PCR实验室废弃物得处理管理规程? PＣR实验室清洁消毒管理规程? 13 ＰＣR实验室仪器设备得管理规程 (14) 试剂管理规程 (15) 16 清洁剂、消毒剂管理规程? 异常情况应急处理管理规程?１7 采购管理规程 (20) 23 仓库管理制度? 26 临床标本得管理规程? PCR实验室记录管理规程 (27) 检验报告单发放、保密管理规程?２８ PCR实验室岗位责任制 ....................................................................................................................................... 2９二、操作指导书.................................................................................................................................................... 3０PCＲ实验室得清洁消毒操作规程....................................................................................................................... ３0 31 冰箱、冷藏柜得使用操作程序? 冰箱、冷藏柜得维护保养操作程序 (32) 34 洁净工作台使用操作规程? 洁净工作台维护、清洁操作规程........................................................................................................................ ３5 AＢI ７5００实时跟踪荧光ＰCＲ仪使用操作规程? 37 38 ABＩ750０实时跟踪荧光PＣＲ仪维护保养操作规程? 高速冷冻离心机使用标准操作规程 (39) 40 高速冷冻离心机维护保养操作规程? 41 生物安全柜使用操作规程? 生物安全柜得维护保养操作规程 (42) 加样器得使用操作规程 (43) 加样器得维护保养操作规程 (44) 干式恒温箱得使用操作规程 (45) 干式恒温箱得维护保养操作规程 (46) 47 紫外灯得使用操作规程?

机械性能试验室安全操作规程(标准版)

机械性能试验室安全操作规程 (标准版) The safety operation procedure is a very detailed operation description of the work content in the form of work flow, and each action is described in words. ( 安全管理 ) 单位：______________________ 姓名：______________________ 日期：______________________ 编号：AQ-SN-0764

机械性能试验室安全操作规程(标准版) 1．设备使用前应检查其性能及润滑是否良好。当确认各机件无裂纹，电器装置正常，机座牢固，保护接零(地)线完好后，方可开动。 2．使用时应严格遵守各试验机的安全操作规程。 3．试验机上不准放置工具、试样等物品。 4．脆性材料的硬度，弯曲、压缩及疲劳试验须加防护装置。 5．高温拉伸或其它升温试验，需要电炉加热时，应检查电炉的电阻丝是否完好，设备接地及联锁装置是否可靠。装卸试样时必须断电，必要时应戴上石棉手套。易燃易爆物品必须远离电炉，室内应备有灭火器材。 6．设备发生电气故障，应立即切断电源，通知电工修理。 7．试验设备不准超过额定负荷运行。工作时精力要集中，不得

离开工作岗作，如需要离开，应停机或向代管人作交待。 8．进行试验时必须注意： (1)根据试样形状，规格及性能，选择好测量范围、夹具，加相应的砝码及安装必要的附件； (2)试验开始，先作几次瞬时启动(开、停)，以便于润滑和检查试验机运转部件的状况； (3)工作完毕后，将一切运转机件调回到原始位置，关闭油阀、电源； (4)人体应避开试样冲击方向。 9．试验机每年由计量部门校验一次。每季度用测力计自行校验一次。测力计每年校验一次。各种试验机械应装置牢固。每班应检查一次。 ——摘自《机械工人安全技术操作规程》 XXX图文设计 本文档文字均可以自由修改

(完整版)SMP-11-014-01稳定性考察管理规程.doc

文件编号SMP-11-014 稳定性考察标准管理规程 版本号01 黑龙江宝庆隆生物技术有限责任公司 文件名称稳定性考察管理规程 文件编号SMP-11-014 版本号01 拷贝号 起草人起草日期年月日审核人审核日期年月日审核人审核日期年月日批准人批准日期年月日颁发部门质量管理部执行日期年月日分发部门中心化验室 1目的 为产品稳定性考察提供原则及依据，考察药品（包括原料、成品等）在温度、湿度、 光线的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件和有效期的确定提 供科学依据，同时通过考察建立产品的有效期；并在有效期内监控已上市药品的质量， 以发现药品与生产相关的稳定性问题，确定药品能够在标示的贮存条件下，符合质量标准的各项要求，确保产品质量。 2范围 适用于成品、原料的稳定性考察。 3责任者 中心化验室、质量管理部、质量受权人

文件编号SMP-11-014 稳定性考察标准管理规程 版本号 01 4职责 4.1 中心化验室副主任负责本标准管理规程的起草。 4.2 中心化验室主任负责本标准管理规程的审核。 4.3 质量管理部部长负责本标准管理规程的审核。 4.4 质量受权人负责本标准管理规程的批准。 5依据 《中国药典》2010 年版二部及《药品 GMP 指南》-质量控制实验室与物料系统 6内容 6.1 稳定性考察的类别 6.1.1 上市前阶段：影响因素试验、加速试验、长期试验。 6.1.2 上市后阶段：上市后持续稳定性考察（条件等同于长期稳定性试验）、承诺稳定性试验（条件等同于为加速试验和长期稳定性试验）。 6.1.3 其他稳定性试验：中间产品放置时间稳定性试验、批量放大及上市后变更(如生产设备变更，原辅料变更，工艺调整等 )稳定性试验、特殊目的稳定性试验，例如对偏差调查等的支持性试验。此类稳定性试验的条件均可参考上市前试验的条件，根据不同产品特性和稳定性试验的目的选择。 6.2 已上市阶段稳定性试验的目的 6.2.1 监控已上市药品在有效期内的质量，以发现药品与生产相关的稳定性问题（如含量、有关物质变化），并确定药品可以或预期可以在标示的贮存条件下，符合质量标准的各项 要求。考察产品上市后在生产、包装、质控、使用条件等诸多方面重大的变更对产品稳定 性的影响，考察变更后药品的稳定性趋势，以评价变更的合理性。