蛋白质沉淀分离技术的应用

蛋白质沉淀分离技术的应用

1133120106 封义嘉应用化学1101B班摘要蛋白质作为功能性物质常存在于复杂的混合体系中因此需要将其从原料中分离纯化蛋白质是一种不稳定的有机高分子物质。蛋白质的沉淀分离在我们的现实中，生产生活中具有很大的意义

关键词蛋白质分离沉淀

蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

一，蛋白质的沉淀分离

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶;当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度

也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀盐析沉淀法在实验研究中有广泛的应用，如小牛胸腺末端脱氧核苷酰转移酶的分离纯化、磷酸酪氨酸蛋白专一抗体的纯化、雪旺细胞分泌神经营养蛋白的提纯、Ⅰ-型胶原蛋白的提纯、红茶抗菌蛋白纯化、褐云玛瑙螺蛋白腺中糖蛋白分离纯化等。但这种方法需要用大量的无机盐，大规模使用会造成环境污染，为此需要进行复杂的污水处理。

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，如在硫酸铵沉淀中那样相互作用，形成聚集体。实际操作中，当蛋白等电沉淀所需pH值与提取缓冲液的pH值相差甚远时，等电沉淀也能进行。如碱性蛋白质可在酸性条件下溶解并在较高pH值条件下沉淀。具有中性等电点的蛋白质虽在中性pH值附近的缓冲液中能溶解，但很难或不可能用中性等电点来沉淀蛋白质，此时通过蒸馏水透析可沉淀这种蛋白。等电沉淀在适宜条件下也可用于高纯度生物大分子的制备等

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行

4 亲和沉淀法

这种新方法既有亲和层析的优点，又更简便。原理是含敏感促进因子的亲和高分子材料与分离目标蛋白在其均相溶液中形成复合物，改变pH值、温度或离子强度，使复合物沉淀并对其进行解离，则亲和高分子材料分离出去，得到目标蛋白。亲和性的热沉淀高分子能很简便地分离制备蛋白。如将1％的亲和性热沉淀高分子材料与含有溶菌酶和卵清蛋白的溶液混合，20℃下孵化16h，孵化过程中维持搅拌，使其与蛋白形成复合物，然后将温度升至沉淀临界点，析出沉淀，离心分离，再将沉淀溶解在稀的醋酸溶液中，升高温度至临界析出点，将亲和性的热沉淀高分子沉淀出来，离心去除这些沉淀物就能得到溶菌酶和卵清蛋白。

二应用

盐析法，在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、

温度等。针对温度这一条，需要强调：在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意：硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性(PH=5.0左右)，使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。有机溶剂沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1)分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2)沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3)在生化制备中应用比盐析法广泛。但是，在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。因此，操作要求在低温下进行。有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。等电点沉淀法——此法单独应用较少，多与其它方法结合使用；两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸性蛋白质。

利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。

蛋白质分离技术

蛋白质分离纯化的条件 蛋白质是一类结构复杂的生物大分子，在细胞和抽提液中蛋白质的性状也不尽相同， 离开天然环境，蛋白质分子变得极不稳定，因此从正常生物材料中提取各种蛋白质均需要特定的条件。 (一)缓冲液缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持 一定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。各种缓冲液原则上都可用于蛋白质的分离纯化，但具体选择何种缓冲液要视分离纯化的目的物性质及所采用的纯化技术而定，例如缓冲液中的无机成分(磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐等)可以与酶或底物反应,从而影响酶的活性；大多数动物细胞在37℃生理状态下的pH值是7.0-7.5之间，因此应选择相应的缓冲液；对凝胶过滤方法，大多数缓冲液均可适用；离子交换层析中的阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选Tris缓冲液，阳离子交换层析，阴离子缓冲液首选磷酸缓冲液。在选择缓冲液时， 最好对pka相近的一些缓冲液进行比较试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发 生不良的相互作用，影响蛋白质的分析分离。 (二)盐、金属离子和整合剂大多数蛋白质如球蛋白，在稀盐溶液中才能溶解，因此应采用含盐(氯化纳)缓冲液。通常用0.1-0.2mol/L NaCI或KCl来模拟生理状态下的离子强度。某些金属离子特别是二价金属如Ca2+、Mg2++等往往是酶的组成部分，失去金属离子其活性会大大下降,如果这些确是我们所需要保护的，则应避免其与缓冲液中的成分形成复合物。但有些蛋白质含疏基,而这些疏基是活性所必须的，为减少金属离子对活性的影响，可以在 缓冲液中加入特异金属离子的螯合剂(Chelate)除去这些金属离子，如Zn2+的螯合剂为邻二氮杂菲；Ca2+的螯合剂为乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)；重金属及其它金属离子为 乙二胺四乙酸(EDTA)。

沉淀分离法.

一、本章的教学目的与要求 了解沉淀分离法的原理及应用 二、授课主要内容 §3—1 无机沉淀剂分离法 一、氢氧化物沉淀分离法 二、硫化物沉淀分离法 §3—2 有机沉淀剂分离法 一、分析功能团analytical radical 二、有机沉淀反应与沉淀剂 三、重点、难点及对学生的要求 掌握沉淀分离法的原理及使用条件 四、主要外语词汇 deposition 五、辅助教学情况（多媒体课件） 六、复习思考题 1阐述沉淀剂分类 2什么是分析功能团？ 七、参考教材references 参考书：《工业分析》机械工业出版社、重庆大学出版社，1997年，第一版《分析化学》武汉大学、华师大五校合编，2001年，第五版 《分离及复杂物质分析》邵令娴编，化学工业出版社，1984年，第一版

利用沉淀反应进行分离： 举例：①Fe3+，Al3+、Ca2+、Mg2+络合滴定； ②Fe3+，Al3+低含量时掩蔽EDTA测Ca2+，Mg2+，如水硬度； ③Fe3+，Al3+高含量时先分离自掩蔽后测。 §3—1 无机沉淀剂分离法 一、氢氧化物沉淀分离法 可生成氢氧化物的离子较多，根据沉淀物的溶度积，可大致算出各种金属离子开始析出沉淀时pH值。 例如：测定Fe3+ 已知Ksp Fe(OH)3=3.5×10-38 当溶液中[Fe3+]=0.01 M 开始沉淀的pH值[OHˉ]3[Fe3+]≥Ksp = 3.5×10-38 [OHˉ]≥1.5×10-12；pOH≤11.8；pH ≥2.2； 沉淀完全进行时，溶液中[Fe3+]残留10-6 M，已知99.99%的铁Fe3+被测定， 此时[OHˉ] = 10-10.5，pOH = 10.5，pH = 3.5 即测定Fe3+的pH为2.2～3.5 根据Ksp可算出金属离子的沉淀pH范围，各种离子沉淀时的pH值不同，有的在较低的pH值时能测定，有的在较高pH值时开始沉淀，因而可控制pH进行分离。

蛋白质的分离方法

蛋白质的分离方法 蛋白质的分离方法有哪些？他们各依据蛋白质的什么性质或特点？蛋白质的分离纯化方法 分子大小 透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。 密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。 溶解度 等电点沉淀和pH控制 盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。 有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。

温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在0~40℃，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。 电荷 电泳（净电荷、分子大小、形状）：区带电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳 离子交换层析 等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。 层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。 吸附： 吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。 特异亲和力：亲和层析 其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）

分离纯化蛋白质的方法及原理

（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分

2沉淀分离技术

第二讲沉淀分离技术2学时 ※、通过本章学习应掌握的内容 1、什么是沉析？ 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 3、沉析的一般操作步骤是什么？ 4、何谓盐析？其原理是什么？ 5、盐析操作时常用的盐是什么？ 6、影响盐析的主要因素有哪些？ 7、有机溶剂沉析法的原理是什么？ 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 9、等电点沉析的工作原理是什么？ 10、其它常用的沉析方法有哪些？ 一、沉淀分离的目的及其方法 沉淀分离技术是经典的化学分离技术。沉淀的概念是指溶液中的介质在适当条件下由液相变成固相而析出的过程。 沉淀技术的目的包括两个：⑴通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质的目的。 当目标成分是以固相形式回收时，固液分离可除去留在溶液中的非必要成分； 如果目标成分是以液相形式回收时，固液分离可使不必要的成分以沉淀形式

去除。⑵通过沉淀可使已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进一步的加工处理。 沉淀分离技术通常包括下列各种沉淀方法： ⑴无机沉淀剂沉淀分离法：通常是以盐类作为沉淀剂的一类沉淀方法，如盐析法，多用于各种蛋白质和酶类的分离纯化，以及某些金属离子的去除。常用的沉淀剂有：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。 ⑵有机沉淀剂沉淀分离法：以有机溶剂作为沉淀剂的一种沉淀分离方法，多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离；有时也用于蛋白质的沉淀和金属离子的去除；用于酶的沉淀分离时，易导致酶的失活。常用到的沉淀剂有：丙酮、乙醇、甲醇等。 ⑶非离子多聚体沉淀剂沉淀分离法：采用非离子型的多聚体作为目标成分的沉淀剂，适用于生物大分子的沉淀分离，如酶、核酸、蛋白质、病毒、细菌等。典型的非离子型多聚体是聚乙二醇（PEG），根据其相对分子量的大小，有PEG600、PEG4000、PEG20000等型号。 ⑷等电点沉淀法：主要是利用两性电解质在等电点状态下的溶解度最低而沉淀析出的原理。适用于氨基酸、蛋白质及其它属于两性电解质组分的沉淀分离，如大豆蛋白“碱提酸沉”的提取方法。 ⑸共沉淀分离法：又可称为生物盐复合物沉淀法，用于多种化合物特别是一些小分子物质的沉淀。它是利用沉淀的同时对其它待分离成份吸附共沉淀而达到除杂的目的。

沉淀蛋白质的常用方法

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤） 2010-08-18 15:19 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxy cholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Acetone Precipitation To eliminate acetone soluble interferences and protein concentration

2沉淀分离技术

第二讲沉淀分离技术 2 学时 ※、通过本章学习应掌握的内容 1、什么是沉析？ 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 3、沉析的一般操作步骤是什么？ 4、何谓盐析？其原理是什么？ 5、盐析操作时常用的盐是什么？ 6、影响盐析的主要因素有哪些？ 7、有机溶剂沉析法的原理是什么？ 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 9、等电点沉析的工作原理是什么？ 10、其它常用的沉析方法有哪些？ 、沉淀分离的目的及其方法 沉淀分离技术是经典的化学分离技术。沉淀的概念是指溶液中的介质在适当条件下由液相变成固相而析出的过程。 沉淀技术的目的包括两个：⑴通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质的目

的。当目标成分是以固相形式回收时，固液分离可除去留在溶液中的非必要 成分；如果目标成分是以液相形式回收时，固液分离可使不必要的成分以沉淀形式去除。⑵通过沉淀可使已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进一步的加工处理。沉淀分离技术通常包括下列各种沉淀方法： ⑴无机沉淀剂沉淀分离法：通常是以盐类作为沉淀剂的一类沉淀方法，如盐析法， 多用于各种蛋白质和酶类的分离纯化，以及某些金属离子的去除。常用的沉淀剂 有：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。 ⑵有机沉淀剂沉淀分离法：以有机溶剂作为沉淀剂的一种沉淀分离方法，多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离；有时也用于蛋白质的沉淀和金属离子的去除；用于酶的沉淀分离时，易导致酶的失活。常用到的沉淀剂有：丙酮、乙醇、甲 醇等。 ⑶非离子多聚体沉淀剂沉淀分离法：采用非离子型的多聚体作为目标成分的沉淀剂，适用于生物大分子的沉淀分离，如酶、核酸、蛋白质、病毒、细菌等。典型的 非离子型多聚体是聚乙二醇（PEG），根据其相对分子量的大小, 有PEG600、 PEG4OO0 PEG20000等型号。 ⑷等电点沉淀法：主要是利用两性电解质在等电点状态下的溶解度最低而沉淀析出的原理。适用于氨基酸、蛋白质及其它属于两性电解质组分的沉淀分离，如大豆蛋 白“碱提酸沉”的提取方法。 ⑸共沉淀分离法：又可称为生物盐复合物沉淀法，用于多种化合物特别是一 些小分子物质的沉淀。它是利用沉淀的同时对其它待分离成份吸附共沉淀而 达到除杂的目的

有机溶剂蛋白质沉淀

蛋白质纯化方法 蛋白质浓缩有多种方法，有盐析，超滤，离子交换，有机溶剂沉淀等方法。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。医学教育`网搜集整理有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。

蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 （一）透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 （二）冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。 （三）吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。 （四）超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。 （五）凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。 （六）浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。 选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

蛋白质沉淀法

蛋白质沉淀法 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋

白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。 3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 令狐采学 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。

沉淀分离技术

第六章沉淀分离技术 （precipitation) 生物分离过程的一般流程 沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 概述 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯制得高纯度生化产品 盐析 有机溶剂沉析 等电点沉析 有机聚合物沉析 其他沉析技术 盐析 S a l t i n d u c e d p r e c i p i t a t i o n 盐析机理示意图 盐析法机理 （1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

n成本低，不需要特别昂贵的设备。 n操作简单、安全。 n不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。 n分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。 有机溶剂沉淀法 organic solvent precipitation 有机溶剂沉淀法 ●概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度， 使其沉淀析出 ●有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作 用，是较早使用的沉淀方法之一。 ●优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓 度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； ●缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进 行。3）成本高 ●蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍 有机溶剂沉淀法的影响因素 1、温度 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， ◆有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有 机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。。 ◆温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10－-20℃；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行。

蛋白质色谱分离方法

蛋白质色谱分离方法 摘要蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以分离和检测蛋白质一直是人们研究的热点。依据蛋白质的物理、化学及生物学特性，已有多种分离手段，如：超滤法、SDS-PAGE、亲和层析等，其中，液相色谱分离技术由于具有重复性好、分辨率高等优势在蛋白质分离检测中得到了广泛的应用。 关键词高效液相色谱高效离子交换色谱反相高效液相色谱高效凝胶过滤色谱高效亲和色谱 一、引言 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质完全的从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。 1、蛋白质纯化的总战略考虑 蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收率至少达到90%以上。然后进一步作精纯化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，同时要使样品的体积得到充分浓缩，一般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的体积大大缩小，便于下一步精纯化。而且每一步都要做电泳判断纯化效果。 2、蛋白质分离纯化技术的选择 要尽可能多地了解目标蛋白的结构、氨基酸组成、氨基酸序列，以及蛋白质的空间结构所决定的物理、化学、生物化学和物理化学性质等信息，根据不同蛋白质之间的性质差异或者改变条件使之具有差异，利用一种或多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择最佳的蛋白质提纯方法。 二、色谱技术简介 1、色谱分离技术基本概念 色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。当流动相中携带的混合物流经

分析化学中常用的分离和富集方法

第8章 分析化学中常用的分离和富集方法 教学目的：学习各种常用分离和富集方法的原理、特点及应用，掌握复杂体系的 分离与分析；分离法的选择、无机和有机成分的分离与分析。 教学重点：掌握各种常用分离和富集方法的原理、特点及应用。 教学难点：萃取分离的基本原理、实验方法和有关计算。 8.1 概述 干扰组分指样品中原有杂质（溶解）或加入试剂引入的杂质，当杂质量少时可加掩蔽剂消除干扰，量大或无合适掩蔽剂时可采用分离的方法。 分离完全的含义：（1）干扰组分少到不干扰；（2）被测组分损失可忽略不计。 完全与否用回收率表示 100?分离后测得的量回收率＝％原始含量 对回收率的要求随组分含量的不同而不同： 含量（质量分数） 回收率 1％以上 >99.9％ 0.01－1％ >99% 0.01%以下 90－95％ 常用的分离方法：沉淀、挥发和蒸馏、液－液萃取、离子交换、色谱等。 8.1.1沉淀分离法 1.常量组分的分离（自己看书：5分钟） （1） 利用生成氢氧化物 a. NaOH 法 b. NH3法（NH 4＋存在） c. 有机碱法 六次（亚）甲基四胺 pH ＝5-6 d. ZnO 悬浮液法 pH ＝6 （2） 硫化物沉淀 （3） 有机沉淀剂 2.痕量组分的共沉淀分离和富集 （1） 无机共沉淀分离和富集 a. 利用表面吸附进行共沉淀 CuS 可将0.02ug 的Hg 2＋从1L 溶液中沉淀出 b. 利用生成混晶 （2） 有机共沉淀剂 灼烧时共沉淀剂易除去，吸附作用小，选择性高，相对分子质量大，体积也大，分离效果好。 a. 利用胶体的凝聚作用进行共沉淀：辛可宁，丹宁，动物胶b. 利用形成离子缔合物进行共沉淀：甲基紫，孔雀绿，品红，亚甲基蓝c. 利用“固体萃取剂”进行共沉淀。 8.1.2挥发和蒸馏分离法 挥发法：选择性高 As 的氢化物，Si 的氟化物，As 、Sb 、Sn 、Ge 的氯化物 蒸馏法：N －NH 4＋－NH 3↑（酸吸收） 利用沸点不同，进行有机物的分离和提纯。 8.2 液－液萃取分离法 8.2.1萃取分离法的基本原理 萃取：把某组分从一个液相（水相）转移到互不相溶的另一个液相（有机相）的过程。 反萃取：有机相→水相

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及 原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

分离纯化蛋白质的方法及原理 （一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题： 如何加快透析过程 （1）加大浓度差，及时更换透析液 （2）利用磁力搅拌器 常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来 （二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析

（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是： 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是： 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法

沉淀分离技术样本

第二讲沉淀分离技术2学时 ※、经过本章学习应掌握的内容 1、什么是沉析? 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些? 3、沉析的一般操作步骤是什么? 4、何谓盐析? 其原理是什么? 5、盐析操作时常见的盐是什么? 6、影响盐析的主要因素有哪些? 7、有机溶剂沉析法的原理是什么? 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些? 9、等电点沉析的工作原理是什么? 10、其它常见的沉析方法有哪些? 一、沉淀分离的目的及其方法 沉淀分离技术是经典的化学分离技术。沉淀的概念是指溶液中的介质在适当条件下由液相变成固相而析出的过程。 沉淀技术的目的包括两个: ⑴经过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质的目的。当目标成分是以固相形式回收时, 固液分离可除去留在溶液中的非必要成分; 如果目标成分是以液相形式回收

时, 固液分离可使不必要的成分以沉淀形式去除。⑵经过沉淀可使已纯化的产品由液态变成固态, 有利于保存和进一步的加工处理。 沉淀分离技术一般包括下列各种沉淀方法: ⑴无机沉淀剂沉淀分离法: 一般是以盐类作为沉淀剂的一类沉淀方法, 如盐析法, 多用于各种蛋白质和酶类的分离纯化, 以及某些金属离子的去除。常见的沉淀剂有: 硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。 ⑵有机沉淀剂沉淀分离法: 以有机溶剂作为沉淀剂的一种沉淀分离方法, 多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离; 有时也用于蛋白质的沉淀和金属离子的去除; 用于酶的沉淀分离时, 易导致酶的失活。常见到的沉淀剂有: 丙酮、乙醇、甲醇等。 ⑶非离子多聚体沉淀剂沉淀分离法: 采用非离子型的多聚体作为目标成分的沉淀剂, 适用于生物大分子的沉淀分离, 如酶、核酸、蛋白质、病毒、细菌等。典型的非离子型多聚体是聚乙二醇( PEG) , 根据其相对分子量的大小, 有PEG600、PEG4000、PEG 0等型号。 ⑷等电点沉淀法: 主要是利用两性电解质在等电点状态下的溶解度最低而沉淀析出的原理。适用于氨基酸、蛋白质及其它属于两性电解质组分的沉淀分离, 如大豆蛋白”碱提酸沉”的提取

沉淀技术

第五章沉淀技术 学习目标：了解蛋白质的基本性质 掌握蛋白质沉淀的基本原理 掌握沉淀技术的基本方法 能够正确进行蛋白质的沉淀分离方法 第一节蛋白质沉淀的基本原理 沉淀是溶液中溶质由液相变为固相析出的过程。 沉淀技术是通过加入试剂或改变条件,使溶液中的溶质离开溶液生成不溶性颗粒而沉降析出的技术. 第一节蛋白质沉淀的基本原理 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程.此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的. 一蛋白质的溶解性 蛋白质的溶解性是由其组成,构象以及分子周围的环境所决定.影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液性质两类. 蛋白质性质的因素有:分子大小,氨基酸序列,可离子化的残基数,极性/非极性残基比率,极性/非极性残基分布,氨基酸残基的化学性质,蛋白质结构,蛋白质电性,化学键性质. 溶液性质的因素有:溶剂可利用度,pH值,离子强度,温度. 二蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质属于胶体分散系统.由于水化膜和双电层着两种稳定的因素,使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液.由于水化膜和双电层的存在,蛋

白质颗粒彼此不能接近,因而增加了蛋白质溶液的稳定性,阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来. 三沉淀动力学 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起:口热运动(布朗运动); 2对流运动，由机械搅拌产生:3差速沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中D和@两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，而机理3在沉隆过程中起主导作用(如在废水处理中)。由布朗运动所造成的碰撞导致异向聚集，而由对流运动所造成的碰撞导致同 向聚集。 为了简化沉淀过程的动力学，可把沉淀过程分成下述6 个步骤: @初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合; @晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒; 3扩散限制生长，晶核在布朗扩散作用下生长，生成亚微米大小的核，这一步速度很快: @流动引起的生长，这些核通过对流传递(搅拌) 引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的; 5絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力; 6 聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体取得大小和阻力平衡。 第二节蛋白质沉淀技术实施 －、基本方法

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法 一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量

蛋白质沉淀分离技术的应用

蛋白质沉淀分离技术的应用 1133120106 封义嘉应用化学1101B班摘要蛋白质作为功能性物质常存在于复杂的混合体系中因此需要将其从原料中分离纯化蛋白质是一种不稳定的有机高分子物质。蛋白质的沉淀分离在我们的现实中，生产生活中具有很大的意义 关键词蛋白质分离沉淀 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 一，蛋白质的沉淀分离 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶;当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度

也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀盐析沉淀法在实验研究中有广泛的应用，如小牛胸腺末端脱氧核苷酰转移酶的分离纯化、磷酸酪氨酸蛋白专一抗体的纯化、雪旺细胞分泌神经营养蛋白的提纯、Ⅰ-型胶原蛋白的提纯、红茶抗菌蛋白纯化、褐云玛瑙螺蛋白腺中糖蛋白分离纯化等。但这种方法需要用大量的无机盐，大规模使用会造成环境污染，为此需要进行复杂的污水处理。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，如在硫酸铵沉淀中那样相互作用，形成聚集体。实际操作中，当蛋白等电沉淀所需pH值与提取缓冲液的pH值相差甚远时，等电沉淀也能进行。如碱性蛋白质可在酸性条件下溶解并在较高pH值条件下沉淀。具有中性等电点的蛋白质虽在中性pH值附近的缓冲液中能溶解，但很难或不可能用中性等电点来沉淀蛋白质，此时通过蒸馏水透析可沉淀这种蛋白。等电沉淀在适宜条件下也可用于高纯度生物大分子的制备等 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行 4 亲和沉淀法