显微镜的原理和使用
光学显微镜的原理和应用
简介
一、光学显微镜发展历史与最新进展
已近400年的历史。十九世纪之前发展非常缓慢。
1665年：英国物理学家R.Hoock的第一台显微镜的雏形。
十八世纪初：慧更斯目镜的发明。
十九世纪中：Lister和Amici制造了消色差物镜，部分消除了色差，后者首次制成水浸物镜，使数值孔径NA>1。
1886年：Ernst Abbe与Carl Zeiss第一个生产出了复消色差物镜,消除了球差和色差的干扰，提高了数值孔径(1.4)，并奠定了现代光学理论原理。
1893年：August K?ler教授发明了著名的柯勒照明。
1890-1899年：金相显微镜、消像散透镜和双筒目镜以及第一台体视显微镜的诞生。
二十世纪初：出现了齐焦物镜。
1932年底：诞生了透射电子显微镜，电子显微镜的分辨率是传统光学显微镜的1000倍以上。
1930－1940年：显微分光光度计的出现，预示着显微定量技术的开始。
1940－1950年：出现了荧光显微镜。
二次大战之前：Zeiss公司基于诺贝尔奖获得者荷兰物理学家Frits Zernike 的光学理论制造了第一台观察活细胞的相差显微镜。
1955年：物理学家Georges Nomarski改良了Wollaston棱镜，诞生了另外一种增强活细胞反差技术的显微镜－Nomarski干涉显微镜即微分干涉差显微镜。
1975年：Robert Hoffman又提出了一种增强活细胞反差的技术，即Hoffman调制相差显微镜。
1970－80年：医学图像处理与分析系统
1970－80年：流式细胞仪
1980－90年：诞生了激光扫描共焦显微镜。比普通光学显微镜的分辨率提高了1.5倍。80年代末和90年代初：诞生了双光子扫描显微镜。
二十世纪90年代末~至今：全内反射显微镜，物镜数值孔径达到了1.6。
分辨率：
普通光学显微镜：xy- 0.25 μm
共焦显微镜：xy- 0.18 μm，z- 300nm
全内反射显微镜：z- 100nm
4pi：z<100nm
STED：xy- 20nm
透射电镜：xy- 0.1nm
二、生物光学显微镜主要种类：
眀场透射光显微镜: 观察经过组化染色的标本。
暗视野显微镜：适于观察未染色的标本－活细胞。散射光成像。
相差显微镜：适于观察活细胞。光相位差转换成振幅差。
微分干涉差显微镜: 适于观察活细胞。利用双束偏振光的干涉增强反差。
荧光显微镜：观察标记了荧光探针的样品（活细胞或固定样品）。
偏振光显微镜：利用偏振光观察晶体结构或具有双折射性的结构，如: 细胞骨架、纤维、膜。
Hoffman调制相差显微镜：观察活细胞
三、光学显微镜的基本组成
光学显微镜主要由光学成像部分和机械结构部分组成。
光学成像：物镜、目镜、照明系统、滤片系统
机械结构：镜座、镜臂、载物台、镜筒、
物镜转换器、调焦装置
光学成像部分：
（一）物镜
1．组成和作用：由凹凸透镜组成，直接使样品成放大倒立的实像（放大1 100倍）。物镜品质的好坏、档次的不同决定了整个显微镜的质量。
2．分类
1）按介质不同分类：
干燥物镜（简称：干镜）（空气n=1）
油浸物镜（简称：油镜）（油n=1.515）
水浸物镜（简称：水镜）（水n=1.333）
2）按校正像差分类：
消色差物镜（achromatic objective）
平场消色差物镜（plan objective）
平场半复消色差物镜（plan fluotar objective）
平场复消色差物镜（plan apochromatic objective）
3）按工作距离分类
长工作距离物镜
普通工作距离物镜
4）按功能分类
相差物镜
偏振光物镜
微分干涉差物镜
5）按镜筒长度分类
有限远物镜
无限远物镜
（二）目镜
组成和作用：由凹凸透镜组成，将物镜形成的倒立实像放大为10-16倍的虚像。
按目镜视场数可分为：非广角目镜、广角目镜、
超广角目镜等。
对于10 X目镜而言,
视场数<18mm，常称为非广角目镜。
视场数≥18mm,常称为广角目镜。
视场数>20mm, 常称为超广角目镜。
（三）照明系统
1．视场光阑
2．聚光器
3．光源
1. 视场光阑
视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成像在标本面上。所以在目镜中看清标本的同时也能看到视场光阑多边形或圆形图像。可变视场光阑的像应外切于目镜中的视场光阑，使光线只能照明需观察的标本，尽可能减少标本四周的散射光。
2．聚光镜（器）
组成和作用：
由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径大小相适应的光束，达到均匀照明标本的目的。
可变孔径光阑
可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同，要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,，聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑，此光阑即为可变孔径光阑。
3．光源
1）照明光源：天然：阳光
人工：卤素灯、高压汞灯、氙灯
2）照明方式：分透射照明和落射照明
简介
I）透射照明：光源来自标本下方，透过样本到达物镜，透射照明光源通常采用卤素灯。目前最常见的透射照明方式：
柯勒照明
II）落射照明：
光束通过物镜落射到标本上，物镜收集反射光，进而成像。物镜本身又作为聚光镜。主要用于荧光显微镜、反射光显微镜和偏光显微镜。通常荧光显微镜采用高压汞灯或氙灯作为光源。
（四）、滤片系统
1．普通滤片分三类：
日光型滤片：用于矫正色温，把显微镜灯光的色温转变为
（DFL）阳光的色温，使彩色照片颜色还原正确。
中性滤片：使光源的光减弱，对波长无选择性，也不改变（N4）色温。
补偿滤片：如染色为红色可选用绿色滤片增加反差。
（GREEN）
2．荧光滤片
详见第四节（荧光显微镜）
第一节透射光显微镜
一、光路结构与原理
第一节透射光显微镜
1．成像：
物体在物镜后方形成倒立放大实像(此像在目镜焦点以内) 通过目镜形成倒立放大
虚像(此像在眼睛明视野25cm以内) 通过晶状体在视网膜上成为正立的像。
2．焦点：
凸凹透镜焦点，凸为实焦点，凹为虚焦点。
3. 透镜成像的基本特性
-平行于光轴的入射光通过透镜的焦点出射。
-通过焦点的入射光平行于透镜的光轴出射。
-通过透镜轴心的入射光出射方向不变。
4.有限远光路
特点：
1) 物体位于物镜前焦点之外
2) 非平行光路
3) 镜筒长度：物镜后焦面至目镜前焦面的距离(160mm）。
5. 无限远校正显微镜光路(Zeiss,1824年提出；1980年后应用)
特点：
1)物体位于物镜的前焦平面上
2)为平行光路
3)具有镜筒透镜
二物镜的性能
1．数值孔径（numeric aperture NA）
数值孔径是物镜最重要的参数之一，
它直接影响物镜的分辨率和物镜的
光亮度。
NA=n?Sin u
n：物镜与样品之间介质的折射率
u：1/2孔径角，进入物镜口边缘入射光束
与物镜光轴之间的夹角
增大u和n，可以增大NA
干燥物镜：介质为空气n＝1
NA：0.05～0.95
水浸物镜：介质为水n ≈ 1.33
NA：0.7～1.25
油浸物镜：介质为镜油（香柏油）n ≈ 1.5
NA：0.85～1.4
工作距离：物镜前透镜与样品之间的距离为工作距离。距离越短，u越大，NA 越大。
通常物镜的最大数值孔径为 1.4, 但现在有一种特殊物镜，其数值孔径可达１.6，这类物镜用于全内反射显微镜。
2．分辨率（resolution power R）
区分物平面两个点间最小距离为分辨距离即分辨率，它代表分辨微细结构的本领。
R = 0.61 λ / NA (R=0.61/ 2 NA)
λ：光波波长（通常λ=550nm）
NA ：物镜数值孔径
若，NA=1.4，波长λ：550nm
则R＝0.61×0.55/1.4=0.24μ
0.25 μ是光学显微镜的极限分辨率
数值孔径越大，波长越短，分辨率
数值越小，而显微镜分辨能力越高。
?I＝26.4％d=0.61 λ / NA
光学极限分辨率是由光的衍射特性决定的
3．放大率（magnification M）
放大率（M）=物镜放大率(M1)×目镜放大率(M2 )
物镜放大率：M1= ? / F1
有限远光路：?：镜筒长度，物镜后焦面至目镜前焦面的距离(160mm）。
F1：物镜焦距。
无限远光路：?：镜筒透镜的焦距
目镜放大率：M2 =250 / F2
250mm：眼到物的明视距离
F2：目镜焦距。
M2的放大率不超过16倍。
4．景深－焦点深度（focal depth）D F
景深表示清晰的像平面所能对应物平面前后空间的深度；或指焦点与样品上某点相一致时，能看清这一点及其上下两侧的结构，那麽，清晰部分的厚度即景深，也称之为焦点深度。
D F＝1/7NA*M +λ/2NA2
式中：
D F ：景深
NA : 数值孔径NA
M ：总放大率
λ:光波波长, 单位:mm
注：放大倍数越大，数值孔径越大，显微镜景深越小。
5.镜像亮度（light of image, L）
镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的
平方呈反比。
L = NA2/ M2,
M2 = ( M1 × M2) 2
注意：
在同一放大率下选用不同数值孔径的物镜，其镜像亮度不同。数值孔径越高，镜像亮度越高。数值孔径相同或相差不大的情况下，物镜倍率越高，镜像亮度越暗。这一点在观察荧光样品时尤其要注意，应权衡选用适当的物镜。
NA对荧光图像的亮度尤其重要。
6. 物镜工作距离
物镜工作距离越长，NA越小。
Confocal中要观察厚的样品时，在相同倍率下，数值孔径接近的情况下，应选择工作距离长的物镜来观察。
63x/1.32 oil L: 0.07mm
63x/1. 2 w L: 0.22mm
聚光镜
组成和作用：
由前端透镜、可变孔径光阑组成。作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源发出的光线形成一束与物镜数值孔径相适应的光束，达到均匀照明标本的目的。
可变孔径光阑
可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同,要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑，此光阑即为可变孔径光阑。
聚光镜分为干、湿两种。
所谓“湿”即使用时需滴上浸液.这类聚光镜NA为1.2～1.4。“干”使用时不需滴浸液,NA常为0.9。徕卡还备有干、湿两用的聚光镜，NA 0.9/NA 1.25。
数值孔径为0.9的聚光镜与孔径为1.25的100倍油镜配合使用,其分辨率不会降低。因为可变孔径光阑的大小可以为物镜数值孔径的2/3 3/4,即1.25*3/4=0.94,NA0.9干聚光镜正好与之相适应,也免去操作者滴油及清洁的麻烦。
对于特别追求鉴别率的场合,则应采用湿聚光镜,使用时,应在载玻片与聚光镜上表面滴上相应的浸液。
柯勒照明：是一种较为完善的照明方式，目的是得到最好的反差和最清晰的图像。严格的柯勒照明必须符合下面三个条件：
－照明均匀，灯丝像位于聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本。
－孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要。
－具有可变的视场光阑，以适应不同倍率物镜的不同照明范围需要。
第二节物镜的分类和标识
一、物镜的分类
（一）按像差校正程度分类：
1．消色差物镜
它校正了球差,彗差和二种色光的位置色差。此类物镜存在严重的轴外像差,特别是场曲。对￠18mm中间像而言(以下同),成像的清晰范围约50%,即视场中心调节清晰后,边缘像模糊不清,反之,边缘像调节清晰后,视场中心像模糊不清。物镜外壳无特殊标记。徕卡的BME及DME显微镜的物镜就属此种类型。此类物镜为最低档物镜，适于普通明场观察。
2．平场消色差物镜
它在消色差物镜基础上,还校正了像散和场曲,像面平坦。清晰范围不低于90%。物镜外壳刻有PL或N PLAN字样。徕卡的产品目录中,N PLAN物镜就属于此类物镜。
3．半平场消色差物镜
这类物镜的清晰范围介于消色差物镜与平场消色差物镜之间,但明显优于消色差物镜。接近平场消色差物镜。其外壳常刻有C PLAN字样。
4.平场半复消色差物镜
色差的校正程度介于平场消色差物镜与平场复消色差物镜之间。但较近于平场复消色差物镜。物镜外壳刻有PL FLUOTAR，此类物镜通常作为观察荧光的物镜来使用。5．平场复消色差物镜
它在平视场消色差物镜的基础上,还对第三种色光校正了位置色差,这种物镜成像质量最佳,其数值孔径也较同倍率物镜大。因此,鉴别率也最高，也更适于用来观察荧光。物镜外壳刻有PL APO字样（此类物镜为最高档物镜）。
（二）、按筒长分类
1．筒长有限远
物镜的共轭距离(物到像的距离)为195mm,物镜的机械筒长(物镜螺纹端面（物镜后焦平面）到目镜支承面（目镜前焦平面）)为160mm。徕卡产品中BME,CME采用此类物镜。
2．筒长无限远
物镜把物体成像于无限远, 因此, 必须要有镜筒透镜将无限远的光线聚焦到目镜焦面上才能观察。徕卡产品中DME,DMLS,DMLB…等均采用此类物镜。
此类物镜的突出优点是,在物镜与镜筒透镜之间可方便地插入各种附件,而不会引起成像位置的变化，镜筒上有∞标识。
（三）、按功能分类
1.相差物镜：徕卡产品中此类物镜上刻有PH1（2或3），数字表明应配合相应的相差环使用。
2.偏振光物镜：徕卡产品中此类物镜上刻有POL。
3.微分干涉差物镜：徕卡产品中此类物镜上刻有D（E或C、A、B），该字母一是代表此类物镜为微分干涉差物镜，二是表明应配合相应的屋拉斯顿棱镜使用。
（四）、按工作距离分类：
1.长工作距离镜头：徕卡产品中此类物镜上刻有L，通常用于倒置显微镜，用来观察培养皿的细胞。此类物镜的特点数值孔径低，非常不适于观察荧光。低倍物镜（≦×10) 通`常为长工作距离物镜,不需要标称L 。
2.可变工作距离镜头：徕卡产品中此类物镜上刻有CORR，适用于不同厚度的盖薄片。
二、物镜外壳的标识
40x/0.65 40x：有限远物镜,放大率为40倍
160/0.17 0.65：数值孔径NA
160：机械筒长160mm
0.17：盖玻璃厚度(消色差物镜)
N PLAN 40x/0.65 N PLAN：平场消色差
∞/0.17 40x：无限远物镜,放大率为40倍
0.65: 数值孔径NA
∞: 筒长无限远
0.17: 竖玻璃厚度
第二节物镜的分类和标识
第三节相差显微镜
二、光学原理
相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，使相位差变成振幅差，表现出明暗对比，使人眼能辨认无色透明物体的细节（如培养的活细胞）。
在相差显微镜中，为了实现相位变化向振幅变化的转变，在光路中必须满足下列两个条件：
1)要能够区分通过物体的直射光和在物体中被衍射的光。
2)应改变非衍射光即直射光的相位和振幅，以产生进行相干干涉的最佳条件。
因此，相差显微镜中利用环状光阑（相差环）和相位板来减少直射光的强度（振幅），并推迟直射光或衍射光的相位，从而创建产生相干光和干涉的条件。
三、装置
1.环状光阑：大小不同的环状孔做成光阑，透明部分透光，位于多功能聚光镜支架处，
与相应相差物镜配合使用，此类物镜由“Ph”表示。
作用：把直射光与衍射光所成的像分开。
2.相位板：为一种玻璃板，其上装有两种膜，即：相位膜与吸收膜；两种膜重叠在一个区
域范围。
位置：安装在相差物镜内，位于物镜的后焦平面处。
1）相位膜：喷镀氟化镁。
作用：推迟直射光或衍射光的相位
相位板的符号：
A＋相位板：推迟直射光1/4波长使直射光和衍射光处在同一相位上，两种光干涉合成光为二者振幅之和结果：物体亮，背景暗，明反差。
A－相位板：推迟衍射光1/4波长，使直射光和衍射光差1/2波长，两种光干涉，合成光振幅为二者振幅之差结果：物体暗，背景亮，暗反差。
2）吸收膜：喷镀铬、银
作用：使直射光能量衰减75％
第四节微分干涉相位差显微镜（DIC）
微分干涉差显微镜也是用来观察未染色的活体细胞，它是利用偏振方向不同的偏振光产生光的干涉，使物体边缘的高度差，成为光的振幅差，而形成反差来观察透明物体。
一、偏振元件
1.偏振片
自然光（全方位振动的光）通过某个光学元件后转换成只在某个方向振动的偏振光，这种元件称为偏振元件。更确切的说，应称为起偏振器。常用的起偏振器可用来使自然光转换成直线偏振光。它们是利用反射与折射，双折射和二向色性（或称选择吸收）的原理制成的。
第四节微分干涉相位差显微镜
二、光学原理
微分干涉差显微镜和相差显微镜一样也是用来观察透明的位相物体。相差显微镜是利用透过标本细节的衍射光和周围介质的直射光，对直射光或衍射光加以干扰，使两光束满足相干条件，而达到相位差变振幅差的目的。微分干涉差显微镜是使两束偏振光中一束通过标本细节，另一束通过周围介质，进而使两束偏振光满足相干条件，以其光程差的变化转变成振幅差来观察未染色的物体。
第四节微分干涉相位差显微镜
第四节微分干涉相位差显微镜
自然光经过振动方向为45°起偏振器后成为线偏振光射向屋拉斯顿棱镜。此棱镜由二个光轴正交且平行于入射面和出射面的双折射晶体胶合而成。通常由石英晶体或方解石晶体制成。一束线偏振光在棱镜的胶合斜面上分离成二束振动方向互相垂直的寻常光(O)和非寻常光(e),由于棱镜位于聚光镜的焦面上,经聚光镜后O光和e光平行地剪切位相物体。然后经物镜后聚焦在物镜的后焦面上。所谓屋拉斯顿棱镜2与屋拉斯顿棱镜1相仿,其差别仅仅其中一个棱镜的光轴与出射面成一定的角度.目的使O,e光的汇合在一起,棱镜胶合面使汇合点与物镜后焦面重合.这样,O,e光经此棱镜后,O光变e光,e光变O光,但又合二为一.但振
动方向不在同一平面上,因此无法干涉.为此在其后方向安置一块振动方向为45°的检偏振器,使O,e光在同一振动面内.相干成像于显微镜的中间像面。
第五节荧光显微镜
二、荧光特性
1. 分子不能将全部吸收的能量转变为荧光，部分能量以其它的形式释放，因此，荧光的效率总是小于1。荧光效率可由下式表示：
上式中发射光量子数即荧光强度，吸收光量子数即激发光强度，在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。荧光强度由下式表示：
荧光强度＝荧光效率×激发光强度
2.由于分子在无辐射跃迁中失去一部分能量，因此，发射荧光的能量总是比激发光能量小，发射荧光波长总是长于激发光波长。
3.一定物质在一定条件下有一定的激发（吸收）光谱和发射光谱的能力。因此，也就有最大激发（吸收）峰（Maximum Excitation-Ex)和最大发射峰(Maximum Emmision-Em)。吸收光谱偏向于短波方向，发射光谱偏向于长波方向，两者成镜像对称关系。同样，最大吸收峰波长短于最大发射峰波长（Ex 三、光路原理 荧光显微镜采用落射光光路。为使人眼能在目镜中观察到发射荧光，在显微镜光路中必须采取两个措施： 1）落在标本上的光应为包括激发峰且具有一定带宽的单色光，通常由激发滤片来实现。 2）对于从标本发出的光除发射荧光外，还有很强的被反射的激发光，且被标本反射的激发光的强度远远大于发射荧光的强度，因此，采用二色光分光镜和阻挡滤片双重作用来抑制激发光到达目镜。 第五节荧光显微镜 2.荧光滤片系统 1) 激发滤片：位于光源和物镜之间，作用是选择适于特定荧光物质的激发波长。 2)二色光分光镜：它的放置方向与激发光的方向呈45 ，位于激发光滤片和发射光滤片之间，具有特征值M（lecica显微镜用RKP表示）。波长短于M的光被反射，波长大于M的光可通过，也就是说它对激发光具有高反射率，而对激发出的荧光具有高透过率，它是分离激发光（短波长）和发射荧光（长波长）的一个重要组件。 3)阻挡滤片：位于目镜之前。其作用是进一步使发射荧光与激发光分离，以获得更纯的发射荧光。 第五节荧光显微镜 4)荧光滤片的种类 a) 带通滤片(BP: Band Pass filter) 符号BP530/30 代表只允许波长在515-545nm 范围内的波长通过。 即以530nm为中心，带宽为30nm 。常作为阻挡滤片和激发滤片。 第五节荧光显微镜 b)长波通滤片(LP: Long Pass Filter) 符号LP530，代表只允许波长长于530nm的光通过，常作为阻挡滤片。 思考题：若激发光为蓝光，阻挡滤片分别为带通滤片BP530/30和长波通 滤片LP530时，在观察红绿荧光双标记的样品时效果有何差异? c)二色光分光镜(Dichrome Beam Spliter) 符号RKP510（Leica公司），代表510nm以下波长的光被反射，510nm以上波长的光可以通过。是荧光光路中最重要的滤片装置。 第五节荧光显微镜 为了使用方便，常将激发滤光片，二色光分光镜及阻挡滤光片组合成一个模块。对于不同的荧光染色法，必须选用合适的模块才能得到满意的结果。 常用模块至少三类： 紫外光激发模块UV 蓝光激发模块 B 绿光激发模块G 这些模块对应着不同染色法，如B模块常用FITC染色法，G模块常用TRITC染色法。 第六节显微镜的使用 1.柯勒照明的调节： a.用10×物镜将标本调节清晰。 b.可变视场光阑关至最小。 c.上下调节聚光镜，使可变视场光阑的多边形图像在目镜中清晰可见， 调节聚光镜调中螺钉，使可变视场光阑居中，打开可变视场光阑，使其外切于目镜视场光阑。 d. 拔出目镜，用肉眼直接观察物镜后焦面，调节可变孔径光阑，使可变孔径光阑的大小为物镜通光孔的2/3～3/4,插入目镜观察。或者不用拔出目镜，将可变孔径光阑的显示数字（1～8）设置为物镜数值孔径的7～8倍即可。 第六节显微镜的使用 物镜的正确选择： 1.观察荧光时尽可能使用高数值孔径物镜。 2.物镜工作距离与样品厚度。 3.功能物镜与相应功能的配套使用。 4.注意盖片厚度对成像的影响。 5.聚光镜的数值孔径与物镜数值孔径的配合。 透射电子显微镜的原理及应用 一．前言 人的眼睛只能分辨1/60度视角的物体，相当于在明视距离下能分辨0.1mm 的目标。光学显微镜通过透镜将视角扩大，提高了分辨极限，可达到2000A 。。光学显微镜做为材料研究和检验的常用工具，发挥了重大作用。但是随着材料科学的发展，人们对于显微镜分析技术的要求不断提高，观察的对象也越来越细。如要求分表几十埃或更小尺寸的分子或原子。一般光学显微镜，通过扩大视角可提高的放大倍数不是无止境的。阿贝（Abbe ）证明了显微镜的分辨极限取决于光源波长的大小。在一定波长条件下，超越了这个极限度，在继续放大将是徒劳的，得到的像是模糊不清的。 图1-1（a ）表示了两个点光源O 、P 经过会聚透镜L ，在平面上形成像O ，、P ，的光路。实际上当点光源透射会聚成像时，由于衍射效应的作用在像平面并不能得到像点。图1-1（b ）所示，在像面上形成了一个中央亮斑及周围明暗相间圆环所组成的埃利斑（Airy ）。图中表示了像平面上光强度的分布。约84%的强度集中在中央亮斑上。其余则由内向外顺次递减，分散在第一、第二……亮环上。一般将第一暗环半径定义为埃利斑的半径。如果将两个光源O 、P 靠拢，相应的两个埃利斑也逐渐重叠。当斑中心O ，、P ，间距等于案例版半径时，刚好能分辨出是两个斑，此时的光点距离d 称为分辨本领，可表示如下： α λsin 61.0d n = （1-1） 式中，λ为光的波长，n 为折射系数，α孔径半角。上式表明分辨的最小距离与波长成正比。在光学显微镜的可见光的波长条件下，最大限度只能分辨2000A 。。于是，人们用很长时间寻找波长短，又能聚焦成像的光波。后来的X 射线和γ射线波长较短，但是难以会聚聚焦。 1924年德布罗（De Broglie ）证明了快速粒子的辐射，并发现了一种高速运动电子，其波长为0.05A 。，这比可见的绿光波长短十万倍！又过了两年布施（Busch ）提出用轴对称的电场和磁场聚焦电子线。在这两个构想基础上，1931-1933年鲁斯卡（Ruska ）等设计并制造了世界上第一台透射电子显微镜。经 实验1 显微镜的使用实验报告 班级：10生科二班/星期三上午第二大节课/第二小组 姓名：杨袁予童组员：杨方、朱树生 实验时间2113年 3月 6 日 一、实验名称显微镜的使用方法 二、实验目的: 1、掌握显微镜的构造，熟练使用显微镜进行试验观察。 2、能够分析显微镜常见故障的原因，并作适当处理。 三、实验内容： 1、利用高、低倍显微镜和油镜观察一些永久装片。 2、将所观察到的镜像绘制成图片。 三、实验器材: 显微镜、装片或切片等。 四、实验原理： 1、显微镜的用途 显微镜是一种精密的放大仪器，是研究生物学不可缺少的工具。在学习生物学的过程中，要研究许多细微的结构，必须借助显微镜进行观察。 2、显微镜的构造 光学显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成，其中光学系统主要包括物镜、目镜、遮光器和光源等。 3、显微镜的成像原理 光学显微镜的光学系统两由大部分组成。由目镜和物镜组成成像系统，由反光镜和旋转光样构成照明系统。 五、实验步骤: 1、低倍镜的使用 （1）取镜和放置：右手握住镜臂,左手托住镜座。把显微镜轻轻地放在实验桌上略偏左、离实验桌边缘5cm为宜。 （2）对光：转动转换器：使低倍物镜正对通光孔(镜端与孔保持2厘米距离)。转动遮光器，使大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内，右眼睁开同时用手转动反光镜对向光源。直到目镜里看到白亮的视野。（3）放置玻片标本：把要观察的装片放在载物台上，有标本的一面向上使标本正对通光孔的中心，然后用压片夹压住。 （4）调节焦距：下降镜筒，侧目注视物镜头，用手旋转粗准焦螺旋直到物镜头接近装片为止。上升镜筒，左眼注视目镜内，用手旋转粗准焦螺旋使镜筒缓缓上升，直到从目镜内看清物像为止。再轻微来回转动细焦螺旋，使物像更清晰。 2、高倍镜的使用 （1）选好目标：一定要先在低倍镜下把需进一步观察的部位调到中心，同时把物像调节最清晰的程度，才能进行高倍镜的观察。 （2）转动转换器：调换上高倍镜头，转换高倍镜时转动速度要慢，并从侧面进行观察（防止高倍镜头碰撞玻片），如高倍镜头碰到玻片，说明低倍镜的焦距没有调好，应重新操作。 （3）调节焦距：转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察。调节细准焦螺旋。如果视野的亮度不合适，可用集光器和光圈加以调节。 一. 重点和难点 重点：显微镜的原理和使用方法、装片的制作 难点：熟练掌握显微镜的使用及相关知识的应用和迁移，解决相关操作问题，对相应的题型能做出科学的分析，得出正确的答案。 二. 具体内容 显微镜的结构和使用 （2）显微镜的成像 ①光源（天然光或人工光源）→反光镜→光圈→物体→物镜（凸透镜）→在镜筒内形成物体放大的实像→目镜→把经物镜形成放大的实像进一步放大 ②显微镜放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数 （3）高倍显微镜的使用 ①用低倍显微镜观察 取镜与安放： a. 右手握镜臂，左手托镜座。 b. 显微镜放在实验台的前方稍偏左。 对光： a. 转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。 b. 选一较大的光圈对准通光孔，左眼注视目境，转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内，通过目镜，可能看到自亮的视野。 低倍镜观察： a. 把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。 b. 转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（此时实验者的眼睛应当看物镜镜头与标本之间，以免物镜与标本相撞）。 c. 左眼看目镜内，同时反向缓缓转动粗准焦螺旋，使镜筒上升，直到看到物像为止，再稍稍转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 ②高倍镜观察 a. 移动装片，在低倍镜下使需要放大观察的部分移动到视野中央。 b. 转动转换器，移走低倍物镜，转换为高倍物镜。 c. 调节光圈，使视野亮度适宜。 d. 缓缓调节细准焦螺旋，使物像清晰 ③注意事项 a. 使用显微镜一定要严格按照取镜→安放→对光→压片→观察的程序进行。 b. 下降镜筒时，一定要用双眼从侧面注视物镜，使之接近装片，但又要防止镜头触及装片。否则会压碎装片和损坏物镜（l0x物镜的工作距离为0. 5-1 cm）。 c. 有必要使用高倍物镜时，必须先在低倍物镜下将目标移到视野的中心，然后换用高倍物镜。因为在低倍物镜下看到的物像放大倍数小，但看到的标本实际面积大，容易找到目标；与低倍物镜相比，高倍物镜下看到的物像人，同样的视野面积看到的标本的实际面积小，在装片不动的情况下，高倍物镜看到的只是低倍物镜视野的中心部分。 d. 换高倍物镜时，千万不可将镜筒升高，正确的做法是直接转动转换器，换上高倍物镜即可。 e. 使用高倍物镜之后，透镜与装片之间的距离很近，使用粗准焦螺旋容易压碎玻片和损坏透镜，或者由于物像一闪而过，找不到要观察的目标．因此，必须用细准焦螺旋调焦，细准焦螺旋只在调节图像清晰度时使用。 ④原理说明 1. 识别镜头：（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。放大倍数越大镜筒越短。（2）物镜：装在镜筒下端的转换器上，一般有2-3个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，放大倍数越大镜筒越长 2. 放大倍数：显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。放大的是物体的直线长度和宽度而不是面积。 3. 工作距离：是指显微镜处于工作状态（物象调节清楚）时物镜的下表面与盖玻片（盖玻片的厚度一般为0.17mm）上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。如物镜是10×的工作距离比物镜是40×的工作距离大。 4. 明暗程度：（1）显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。（2）反光镜它有平、凹两面，再经通光孔照至标本。可向任意方向转动，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱时使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。（3）光圈或遮光器在通光孔下方，光圈由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节进光量；遮光器由几个直径大小不同的孔组成，选择某一孔以确定进光量。 5. 物像：镜下见到的是完全的倒像，即标本位于玻片右上角时在镜下的左下角位置出现，移动的规律是物象在镜下的左下角时将玻片向左下角移动可以将物象移到视野的中央来。但是物体的运动方向不变，即标本中细胞质是顺时针方向流动的，镜下仍为顺时针流动。 6. 污物的位置：在视野中常看到污物，要明确污物不会在反光镜上，因为反光镜的作用是将光源光线反射到玻片标本上；确定污物的位置首先移动玻片如污物随之移动即污物在玻片上；如污物不动，再转动目镜污物也随之转动即污物在目镜上；否则在物镜上。 7. 普通光学显微镜下可以见到的细胞结构有：细胞壁、细胞核、液泡、叶绿体、线粒体、核仁，在质壁分离时可见到细胞膜，有丝分裂时可见到染色体。 8. 玻片标本：必须是透明的，要使光线能透过标本内部。常用的种类有切片（洋葱根尖纵切片）；装片（洋葱表皮临时装片）；压片（洋葱根尖临时压片观察有丝分裂）；涂片（血涂片、自生固氮菌的临时涂片）。 实验一显微镜的构造及使用方法 一、目的要求 1.了解显微镜的构造、性能及成像原理。 2.掌握显微镜的正确适用及维护方法。 二、实验器材 1.显微镜、纱布、绸布 2.酵母菌示教标本 三、普通光学显微镜简介 微生物的最显著的特点就是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜并掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。 显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。光学显微镜包括：明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、立体显微镜等。其中明视野显微镜为最常用普通光学显微镜，其它显微镜都是在此基础上发展而来的，基本结构相同，只是在某些部分作了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可以分为机械和光学系统两大部分。 图1-1 显微镜构造 1.目镜 2.镜筒 3. 转换器 4. 物镜 5. 载物台 6. 聚光器 7. 虹彩光圈 8. 聚光镜调节钮9.反光镜10. 底座11. 镜臂12. 标本片移动钮 13. 细调焦旋钮14. 粗调焦旋钮15.电源开关16.光亮调节钮17.光源 1.机械系统： （1）镜座Base：在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。 （2）镜臂Arm：连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。 （3）镜筒Tube：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面可与转换器相连接。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式和斜筒式； 有单筒式的，也有双筒式的。 （4）旋转器Nosepiece：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安 电子显微技术在纳米科学研究中的作用 摘要：本文概述了电子显徽技术在纳米科学研究中的应用特点和适用范围，介绍了透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、扫描隧道显微镜(STM)和原子力显微镜(AFM)等电子显微技术在纳米材料中的新应用和新方法。 关键字：电子显微技术纳米科学 纳米科学技术是在0.1nm~100nm尺度空间内，研究电子，原子和分子运动规律与特性的高技术学科。纳米科学技术涵盖纳米物理学，纳米电子学，纳米材料学，纳米机械学，纳米制造学，纳米显微学，纳米计量学，纳米化学，纳米生物学，纳米医学。纳米科学技术是现代物理学与先进工程技术相结合的基础上诞生的，是基础研究与应用探索紧密联系的新兴高尖端科学技术。纳米科学和技术是在纳米尺度上研究物质的特性及其相互作用，并且对这些特性加以利用的多学科的高科技。纳米科技是未来高科技的基础，适合纳米科技研究的仪器分析方法是纳米科技中必不可少的实验手段。 电子显微技术是以电子束为光源，用一定形状的静电场或磁场聚焦成像的分析技术，比普通光学显微镜具有更高的分辨率。根据其所检测信号的不同，电子显微技术主要包括透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、扫描透射电镜(STEM)、扫描隧道显微镜(STM)、原子力显微镜(AFM)、电子探针(EPM)、俄歇电子能谱(AES)、场发射显微镜(FEM)和场离子显微镜(FIM)等。 目前，电子显微技术已广泛应用于纳米科学研究的各个领域。使用电子显微技术可以获取高质量的图片，从而帮助我们理解纳米结构，以达到改进合成方法和提高性能的目的。将它与最新发展起来的测控技术相结合，实行原位纳米器件的加工、制造和性能表征，如纳米晶体化学组分的表征[1]。总之纳米技术的飞速发展使得电子显微技术成为了纳米科学研究不可缺少的有力的工具。 1 扫描电镜技术 扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope)，简称SEM，是一种大型的分析仪器，是3 0 年代中期发展起来的一种新型电镜，是一种多功能的电子显微分析仪器，主要功能是对固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析，广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域。SEM一般只能提供微米或亚微米的形貌信息，与TEM相比，其分辨率较低，因而表征结果不如透射电镜准确，但目前的SEM都配有x射线能谱仪装置，可以同时进行显微组织形貌的观察和微区成分分析，是当今普遍使用的科学研究仪器。李东等[2] 实验一光学显微镜的使用与微生物观察 第一节普通光学显微镜的使用 一、实验目的 1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。 2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。 3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。 二、基本原理 （一）普通光学显微镜的构造 普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。 1、机械系统 机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。 （1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。 （2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。 （3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。 （4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。 （5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。 （6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。 图1-1 普通光学显微镜的构造 1. 镜座 2. 镜臂 3. 镜筒 4. 转换器 5. 载物台 6. 压片夹 7. 标本移动器 8. 粗调螺旋 9. 细调螺旋 10. 目镜 11. 物镜 12. 虹彩光阑（光圈）13. 聚光器14. 反光镜 2、光学系统 光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。 （1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指针，指示视野中标本的位置。在进行显微测量 高中生物实验：普通光学显微镜的使用方法 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 机械部分 镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3-4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快 速和较大辐度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 照明部分 装在镜台下方，包括反光镜，集光器。 反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。 光学部分 目镜：装在镜筒的上端，通常备有2-3个，上面刻有5*、10*或15*符号以表示其放大倍数，一般装的是10*的目镜。 物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3-4个物镜，其中最短的刻有“10*”符号的为低倍镜，较长的刻有“40*”符号的为高倍镜，最长的刻有“100*”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途，光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基本组成部件。 1. 显微镜主机体（stand） 显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座（base） 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator） 透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch） 这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开关。 显微镜的原理和使用方法 显微镜的原理和使用方法-装片的制作 显微镜的结构和使用 （2）显微镜的成像 ①光源（天然光或人工光源）→反光镜→光圈→物体→物镜（凸透镜）→在镜筒内形成物体放大的实像→目镜→把经物镜形成放大的实像进一步放大 ②显微镜放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数 （3）高倍显微镜的使用 ①用低倍显微镜观察 取镜与安放： a. 右手握镜臂，左手托镜座。 b. 显微镜放在实验台的前方稍偏左。 对光： a. 转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。 b. 选一较大的光圈对准通光孔，左眼注视目境，转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内，通过目镜，可能看到自亮的视野。 低倍镜观察： a. 把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。 b. 转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（此时实验者的眼睛应当看物镜镜头与标本之间，以免物镜与标本相撞）。 c. 左眼看目镜内，同时反向缓缓转动粗准焦螺旋，使镜筒上升，直到看到物像为止，再稍稍转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 ②高倍镜观察 a. 移动装片，在低倍镜下使需要放大观察的部分移动到视野中央。 b. 转动转换器，移走低倍物镜，转换为高倍物镜。 c. 调节光圈，使视野亮度适宜。 d. 缓缓调节细准焦螺旋，使物像清晰 ③注意事项 a. 使用显微镜一定要严格按照取镜→安放→对光→压片→观察的程序进行。 b. 下降镜筒时，一定要用双眼从侧面注视物镜，使之接近装片，但又要防止镜头触及装片。否则会压碎装片和损坏物镜（l0x物镜的工作距离为0. 5-1 cm）。 c. 有必要使用高倍物镜时，必须先在低倍物镜下将目标移到视野的中心，然后换用高倍物镜。因为在低倍物镜下看到的物像放大倍数小，但看到的标本实际面积大，容易找到目标；与低倍物镜相比，高倍物镜下看到的物像人，同样的视野面积看到的标本的实际面积小，在装片不动的情况下，高倍物镜看到的只是低倍物镜视野的中心部分。 中药粉末显微鉴别技术 第一 取样、制片、染色 节 一、取样 取样的代表性直接影响到结果的判断准确，因此必须重视取样的各个环节。 （一） 对照品 对照品粉末是检定供试品的参照物，其制备是显微鉴别的先决条件。有经验者，可自取标本，鉴定后制作，或购买药材经品种基原鉴定。还应注意有些药材的显微特征受生长年限及环境的影响，会产生一定的波动，所以对于供试品的产地、采收期、加工方法等也应当认真记录。 （二） 供试品 中药材 原药材应注意基原、产地、规格的完整性、清洁程度以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，并详细记录。 （1）从同批药材包件中抽取有代表性的检定用样品。 （2）对破碎的、粉末状的或大小在1cm以下的药材，一般药材100g-500g；粉末状药材25g；贵重药材5g-10g；个体大的药材，根据实际情况抽取代表性的样品。 （3）将所取有代表性样品混合均匀，即为总样品量。 （4）前处理：将供试品捡净后，用量较小时，可以用乳体或小型电磨粉碎过《中国药典》6号筛（1.0μm-250μm）备用。 1、中成药 （1）取样：从各批号的箱、包、瓶中随机取样，记录好厂家、批号，从各包装盒中任意取1丸，每批号不得少于3次。各供试品留样保存，保存期限至少1年。 水丸无包衣时，可直接取2丸-3丸，乳钵中研成细粉后，取少量置裁玻片上，滴加规定的试液，搅拌均匀，使粘结的细胞、组织分离，再按粉末特征加水合氯醛试液或其他适当试液处理后观察。 水蜜丸或大蜜丸；可直接用刀片横向切开取一薄片，或用小钢铲取一小块（约15mg）放置在载玻片上制片观察。 （1） 去包衣：中药片剂常见包衣为糖衣，隔离层常使用胶浆、糖浆和滑石 透射电子显微镜的原理 XXX （大庆师范学院物理与电气信息工程学院 2008级物理学 200801071293 黑龙江大庆163712） 摘要：透射电子显微镜在成像原理上与光学显微镜类似。它们的根本不同点在于光学显微镜以可见光作照明束，透射电子显微镜则以电子为照明束。在光学显微镜中将可见光聚焦成像的玻璃透镜，在电子显微镜中相应的为磁透镜。由于电子波长极短，同时与物质作用遵从布拉格(Bragg)方程，产生衍射现象，使得透射电镜自身在具有高的像分辨本领的同时兼有结构分析的功能。 关键词：第一聚光镜；第二聚光镜；聚光镜阑；物镜光阑；选择区光阑；中间镜 作者简介：XXX（1988-），黑龙江省绥化市绥棱县，物理与电气信息工程学院学生。 0引言： 工业多相催化剂是极其复杂的物理化学体系。长期以来,工业催化剂的制备很大程度上依赖于经验和技艺,而难以从原子分子水平的科学原理方面给出令人信服的形成机制。为开发更高活性、选择性和稳定性的新型工业催化剂,通过各种表征技术对催化剂制备中的过程产物及最终产品进行表征是一个关键性的基础工作。在当前各种现代表征手段中,透射电子显微镜尤其是高分辨透射电子显微镜,可以在材料的纳米、微米区域进行物相的形貌观察、成分测定和结构分析,可以提供与多相催化的本质有关的大量信息,指导新型工业催化剂的开发。 为什么透射电子显微镜有如此高的分辨率那？本文阐述了透射电子显微镜的工作原理。 1透射电子显微镜的定义/组成 1.1定义 在一个高真空系统中，由电子枪发射电子束， 穿过被研究的样品，经电子透镜聚焦放大，在荧光 屏上显示出高度放大的物像，还可作摄片记录的一 类最常见的电子显微镜称为透射电子显微镜。[1] 1.2组成 透射电子显微镜由照明系统、成像系统、记录 系统、真空系统和电器系统组成。（如图1） 2透射电子显微镜的照明系统 照明系统的作用是提供亮度高、相干性好、束 流稳定的照明电子束。它主要由发射并使电子加速 的电子枪和会聚电子束的聚光镜组成。 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方 法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又 能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基 本组成部件。 1. 显微镜主机体（stand）显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座（base）底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有 透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator）透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch）这是新一代AXIO系列显 微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电 源开关。 5. 电源开关（mains switch）与亮度调节旋钮（brightness control）电源开关用 来接通或切断显微镜所需用的交流电源。电源开关旋钮也可调节照明光源的亮度，使所观 察的视域可随时获得适当的亮度，可调范围为3-12V。作显微照相时，可根据曝光以及彩 色底片色温的要求来调节灯光的亮度。当准备关掉电源之前，应先将亮度调节旋钮调到最小。 6. 粗、微调焦旋钮（coaxial coarse/fine focusing controls）调焦旋钮转动时带 动燕尾导板上下移动，而导板上则装有物台托架和聚光镜托架，从而使物台趋向或远离物 镜达到调焦的效果。 7. 透射光用的滤光片选择按钮（push buttons for filter magazine）透射光显微 镜检方法所需用的一组滤光片已安装在显微镜的底座内，通过底座外的按钮就可以根据不 同的需要来选择适用的一块或一组滤光片。通常的滤光片配套有： (1) 蓝色色温转换滤光片：用来把光源的色温由3200K转换成日光型彩色底片所需 的5500K色温； (2) 绿色滤光片：用来增强相差观察方法中成像的反差，或者以黑白底片作显微照相时，可以提高片成像的反差； 显微镜的原理和使用方法-装片的制作 显微镜的结构和使用 （2）显微镜的成像 ①光源（天然光或人工光源）→反光镜→光圈→物体→物镜（凸透镜）→在镜筒形成物体放大的实像→目镜→把经物镜形成放大的实像进一步放大 ②显微镜放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数 （3）高倍显微镜的使用 ①用低倍显微镜观察 取镜与安放： a. 右手握镜臂，左手托镜座。 b. 显微镜放在实验台的前方稍偏左。 对光： a. 转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。 b. 选一较大的光圈对准通光孔，左眼注视目境，转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒，通过目镜，可能看到自亮的视野。 低倍镜观察： a. 把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。 b. 转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（此时实验者的眼睛应当看物镜镜头与标本之间，以免物镜与标本相撞）。 c. 左眼看目镜，同时反向缓缓转动粗准焦螺旋，使镜筒上升，直到看到物像为止，再稍稍转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 ②高倍镜观察 a. 移动装片，在低倍镜下使需要放大观察的部分移动到视野中央。 b. 转动转换器，移走低倍物镜，转换为高倍物镜。 c. 调节光圈，使视野亮度适宜。 d. 缓缓调节细准焦螺旋，使物像清晰 ③注意事项 a. 使用显微镜一定要严格按照取镜→安放→对光→压片→观察的程序进行。 b. 下降镜筒时，一定要用双眼从侧面注视物镜，使之接近装片，但又要防止镜头触及装片。否则会压碎装片和损坏物镜（l0x物镜的工作距离为0. 5-1 cm）。 c. 有必要使用高倍物镜时，必须先在低倍物镜下将目标移到视野的中心，然后换用高倍物镜。因为在低倍物镜下看到的物像放大倍数小，但看到的标本实际面积大，容易找到目标；与低倍物镜相比，高倍物镜下看到的物像人，同样的视野面积看到的标本的实际面积小，在装片不动的情况下，高倍物镜看到的只是低倍物镜视野的中心部分。 d. 换高倍物镜时，千万不可将镜筒升高，正确的做法是直接转动转换器，换上高倍物镜即可。 e. 使用高倍物镜之后，透镜与装片之间的距离很近，使用粗准焦螺旋容易压碎玻片和损坏透镜，或者由于物像一闪而过，找不到要观察的目标．因此，必须用细准焦螺旋调焦，细准焦螺旋只在调节图像清晰度时使用。 ④原理说明 1. 识别镜头：（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。放大倍数越大镜筒越短。（2）物镜：装在镜筒下端的转换器上，一般有2-3个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，放大倍数越大镜筒越长 2. 放大倍数：显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。放大的是物体的直线长度和宽度而不是面积。 3. 工作距离：是指显微镜处于工作状态（物象调节清楚）时物镜的下表面与盖玻片（盖玻片的厚度一般为0.17mm）上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。如物镜是10×的工作距离比物镜是40×的工作距离大。 4. 明暗程度：（1）显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。（2）反光镜它有平、凹两面，再经通光孔照至标本。可向任意方向转动，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱时使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。（3）光圈或遮光器在通光孔下方，光圈由十几金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节进光量；遮光器由几个直径大小不同的孔组成，选择某一孔以确定进光量。 5. 物像：镜下见到的是完全的倒像，即标本位于玻片右上角时在镜下的左下角位置出现，移动的规律是物象在镜下的左下角时将玻片向左下角移动可以将物象移到视野的中央来。但是物体的运动方向不变，即标本中细胞质是顺时针方向流动的，镜下仍为顺时针流动。 6. 污物的位置：在视野中常看到污物，要明确污物不会在反光镜上，因为反光镜的作用是将光源光线反射到玻片标本上；确定污物的位置首先移动玻片如污物随之移动即污物在玻片上；如污物不动，再转动目镜污物也随之转动即污物在目镜上；否则在物镜上。 7. 普通光学显微镜下可以见到的细胞结构有：细胞壁、细胞核、液泡、叶绿体、线粒体、核仁，在质壁分离时可见到细胞膜，有丝分裂时可见到染色体。 8. 玻片标本：必须是透明的，要使光线能透过标本部。常用的种类有切片（洋葱根尖纵切片）；装片（洋葱表皮临时装片）；压片（洋葱根尖临时压片观察有丝分裂）；涂片（血涂片、自生固氮菌的临时涂片）。 ⑤相关原理例析 显微镜的使用实验教案 一、教学内容分析 《练习使用显微镜》这一节内容，可以说是高中第一次带领学生接触实验仪器，走进生物学微观的世界。生命科学是一门实验科学，显微镜是生物学研究中最常用、最基本的观察工具，显微镜的使用作为本册教材中第一个技能性实验，就显得尤其重要了。在实验过程中应由教师引导，以学生为中心；教师及时解决学生遇到的困难，督促学生养成良好的实验习惯，培养学生的观察、实验和思维能力。 二、教学对象分析 学生在初中已经初步接触过显微镜，但对显微镜的结构和原理相关知识会淡忘，对显微镜的使用缺乏规范和熟练，并且没有养成良好的实验习惯。青少年好奇心盛，对于动手实验有很浓厚的兴趣。利用这种好奇心组织教学，会收到比较好的效果。 三、教学重点和难点 1、教学重点 （1）显微镜的原理 （2）显微镜的使用方法 （3）临时装片的制作方法 2、教学难点 （1）规范使用显微镜，观察到清晰的物象 （2）制作出色的易于观察的临时装片 四、教学目标 1、知识目标 （1）识别显微镜的结构和各部分功能 （2）能依据显微镜的操作规范，熟练操作显微镜，并掌握显微镜的保养措施 （3）认识植物细胞的构造 2、能力目标 掌握一般的显微镜制片方法 3、情感目标 （1）通过显微镜的使用训练，培养认真细致的工作作风，养成遵守实验室纪律的行为习惯，养成科学实验的良好习惯 （2）在实验中体验严谨求实的科学态度和敢于探索、质疑的科学精神，养成实事求是的科学态度 五、实验准备 1、材料 各种切片，洋葱鳞叶；碘液，清水。 显微镜，擦镜纸，镊子，小剪，载玻片，盖玻片，解剖针，表面皿，吸水纸。 六、教学过程 七、教学反思 这节实验课设计的教学过程能达到既定的教学目标，让学生既习得一种技能，又获得一种体验。对于实验材料，如果有充分的时间和条件准备的话，可以多选择几种作为制作临时装片的备选材料，供有余力的同学观察，最好同时有动物材料和植物材料，以作比较。在实验过程中可能会出现一些突发状况，教师应保持清醒的头脑，冷静的解决，尤其应注意实验室安全。 八、板书设计 实验一、显微镜的使用 一、显微镜的原理 显微镜的原理和使用方法 Prepared on 22 November 2020 显微镜的原理和使用方法-装片的制作 显微镜的结构和使用 （2）显微镜的成像 ①光源（天然光或人工光源）→反光镜→光圈→物体→物镜（凸透镜）→在镜筒内形成物体放大的实像→目镜→把经物镜形成放大的实像进一步放大 ②显微镜放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数 （3）高倍显微镜的使用 ①用低倍显微镜观察 取镜与安放： a.右手握镜臂，左手托镜座。 b.显微镜放在实验台的前方稍偏左。 对光： a.转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。 b.选一较大的光圈对准通光孔，左眼注视目境，转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内，通过目镜，可能看到自亮的视野。 低倍镜观察： a.把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。 b.转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（此时实验者的眼睛应当看物镜镜头与标本之间，以免物镜与标本相撞）。 c.左眼看目镜内，同时反向缓缓转动粗准焦螺旋，使镜筒上升，直到看到物像为止，再稍稍转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 ②高倍镜观察 a.移动装片，在低倍镜下使需要放大观察的部分移动到视野中央。 b.转动转换器，移走低倍物镜，转换为高倍物镜。 c.调节光圈，使视野亮度适宜。 d.缓缓调节细准焦螺旋，使物像清晰 ③注意事项 a.使用显微镜一定要严格按照取镜→安放→对光→压片→观察的程序进行。 b.下降镜筒时，一定要用双眼从侧面注视物镜，使之接近装片，但又要防止镜头触及装片。否则会压碎装片和损坏物镜（l0x物镜的工作距离为-1 cm）。 c.有必要使用高倍物镜时，必须先在低倍物镜下将目标移到视野的中心，然后换用高倍物镜。因为在低倍物镜下看到的物像放大倍数小，但看到的标本实际面积大，容易找到目标；与低倍物镜相比，高倍物镜下看到的物像人，同样的视野面积看到的标本的实际面积小，在装片不动的情况下，高倍物镜看到的只是低倍物镜视野的中心部分。 d.换高倍物镜时，千万不可将镜筒升高，正确的做法是直接转动转换器，换上高倍物镜即可。 5.2 金相显微镜的基本原理、构造及使用 金相显微镜可用来鉴别和分析各种金属和合金的组织结构，广泛应用在工厂或实验室进行铸件质量的鉴定、原材料的检验或对材料处理后金相组织的研究分析等工作。还可用于半导体检测、电路封装、精密模具、生物材料等检验与测量。 【实验目的】 1.了解金相显微镜的基本原理、基本结构和使用方法。 2.掌握仔细阅读显微镜使用说明书并进行正确操作的方法。 【实验原理】 显微镜的基本放大作用由焦距很短的物镜和焦距较大的目镜来完成的，物体位于物镜的前焦点外但很靠近焦点位置，物体经过物镜形成倒立的放大实像，这个像位于目镜的物方焦距内但很靠近焦点位置，作为目镜的物体，目镜将物镜放大的实像再放大成虚像，位于观察者的明视距离（距人眼250mm）处，供眼睛观察。光路图见“2.4光学基本仪器”中的图2-？ 为了减少球面像差、色像差和像域弯曲等像差，金相显微镜的物镜和目镜都是由透镜组构成的复杂光学系统。显微镜的成像质量在很大程度上取决于物镜的质量，因此物镜的构造尤为复杂，根据对各种像差的校正程度不同，物镜可分为消色差物镜、复消色差物镜和平视场物镜等三大类。近年来，由于采用计算机技术，物镜的设计和制造都有了很大改进。 实际上，一方面，金相显微镜所观察的显微组织，往往几何尺寸很小，小至可与光波波长相比较，此时不能再近似地把光线看成直线传播，而要考虑衍射的影响。另一方面，显微镜中的光线总是部分相干的，因此显微镜的成像过程是个比较复杂的衍射相干过程。此外，由于衍射等因素的影响，显微镜的分辨能力和放大能力都受到一定限制，目前金相显微镜可观察的最小尺寸一般是0.2μm左右，有效放大倍数最大为1500~1600倍。 金相显微镜总的放大倍数为物镜与目镜放大倍数的乘积。放大倍数用符号“Х”表示，例如物镜放大倍数为20Х，目镜放大倍数为10Х，则显微镜的放大倍数为200Х。通常物镜、目镜的放大倍数都刻在镜体上，在使用显微镜观察试样时，应根据其组织的粗细情况，选择适当的放大倍数，以细节部分能观察得清晰为准。 金相显微镜最常见的有正置、倒置和卧式三大类。本实验使用的是正置金相显微镜为例，光学系统结构图如图5-2-1所示。 显微镜的使用实验报告 班级：姓名：小组其他成员： 实验地点：实验时间：年月日一、实验名称： 显微镜的使用 二、实验目的: 练习使用显微镜 三、实验器材: 显微镜(J2702)、装片或切片，擦镜纸、纱布。 四、实验步骤: 1.检查实验器材是否完备。 2.取镜和安放。 ⑴取镜：右手握住镜臂,左手托住镜座 ⑵安放：把显微镜轻轻地放在实验桌上略偏左、离实验桌边缘7厘米处。 ⑶用手转动粗准焦螺旋，使镜筒升高，安装好物镜和目镜 3.对光。 ⑴转动转换器,使低倍物镜正对通光孔(镜端与孔保持2厘米距离)。 ⑵转动遮光器，使大的光圈对准通光孔。 ⑶左眼注视目镜内，右眼睁开，同时，用手转动反光镜对向光源，直到目镜里看到白亮的视野(图3-3)。 4.观察： ⑴安放装片。把要观察的装片放在载物台上，有标本的一面向上，使标本正对通光孔的中心，然后用压片夹压住。 ⑵下降镜筒。侧目注视物镜头，用手旋转粗准焦螺旋，直到物镜头接近装片为止 ⑶上升镜筒。左眼注视目镜内，用手旋转粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到从目镜内看清物像为止。再轻微来回转动细焦螺旋，使物像更清晰 5.整理实验器材： ⑴把装片取下放回原处。 ⑵把显微镜外表擦拭干净。转动转换器。使两物镜偏到通光孔两侧，再把镜筒降低到最低位置最后把显微镜装进镜箱，送回原处。 五、思考与讨论： 1、使用显微镜时，为什么在下降镜筒时眼睛要从旁边注视物镜？ 2、在显微镜下看到写在透明玻片上的“F“字，看到的像是什么字？ 3、玻片标本移动方向跟像移动方向是相同还是相反？ 六、教师评语：签名：成绩： 检测练习： 1.小明在显微镜的视野中看到一个“P”字，请问透明纸上写的是什么字？（） A.p B.q C.d D.b 2.如果显微镜目镜的放大倍数是10倍，物镜的放大倍数是45倍，那么观察到的物像放大了（） A．10倍 B．45倍 C．55倍 D．450倍 3．某同学用显微镜观察洋葱鳞片叶的表皮细胞，看到的物像如图中①所示，若要观察的物像达到图1中②所示效果，他应将装片向______移动。( ) A．右下方 B．左下方 C．右上方D．左上方 4.用下列四台显微镜观察洋葱表皮细胞，视野中细胞数目最多的是（） A．目镜5X 物镜8X B．目镜10X 物镜40X C．目镜15X 物镜10 D．目镜20X 物镜45X 显微镜的原理和使用方法Newly compiled on November 23, 2020 显微镜的原理和使用方法-装片的制作 显微镜的结构和使用 （2）显微镜的成像 ①光源（天然光或人工光源）→反光镜→光圈→物体→物镜（凸透镜）→在镜筒内形成物体放大的实像→目镜→把经物镜形成放大的实像进一步放大 ②显微镜放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数 （3）高倍显微镜的使用 ①用低倍显微镜观察 取镜与安放： a. 右手握镜臂，左手托镜座。 b. 显微镜放在实验台的前方稍偏左。 对光： a. 转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。 b. 选一较大的光圈对准通光孔，左眼注视目境，转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内，通过目镜，可能看到自亮的视野。 低倍镜观察： a. 把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。 b. 转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（此时实验者的眼睛应当看物镜镜头与标本之间，以免物镜与标本相撞）。 c. 左眼看目镜内，同时反向缓缓转动粗准焦螺旋，使镜筒上升，直到看到物像为止，再稍稍转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 ②高倍镜观察 a. 移动装片，在低倍镜下使需要放大观察的部分移动到视野中央。 b. 转动转换器，移走低倍物镜，转换为高倍物镜。 c. 调节光圈，使视野亮度适宜。 d. 缓缓调节细准焦螺旋，使物像清晰 ③注意事项 a. 使用显微镜一定要严格按照取镜→安放→对光→压片→观察的程序进行。 b. 下降镜筒时，一定要用双眼从侧面注视物镜，使之接近装片，但又要防止镜头触及装片。否则会压碎装片和损坏物镜（l0x物镜的工作距离为0. 5-1 cm）。 c. 有必要使用高倍物镜时，必须先在低倍物镜下将目标移到视野的中心，然后换用高倍物镜。因为在低倍物镜下看到的物像放大倍数小，但看到的标本实际面积大，容易找到目标；与低倍物镜相比，高倍物镜下看到的物像人，同样的视野面积看到的标本的实际面积小，在装片不动的情况下，高倍物镜看到的只是低倍物镜视野的中心部分。 d. 换高倍物镜时，千万不可将镜筒升高，正确的做法是直接转动转换器，换上高倍物镜即可。 e. 使用高倍物镜之后，透镜与装片之间的距离很近，使用粗准焦螺旋容易压碎玻片和损坏透镜，或者由于物像一闪而过，找不到要观察的目标．因此，必须用细准焦螺旋调焦，细准焦螺旋只在调节图像清晰度时使用。 ④原理说明透射电子显微镜的原理及应用
实验1 显微镜的使用实验报告
显微镜的结构和使用
实验一显微镜的构造及使用方法
电子显微技术在纳米科学研究中的作用
实验一 光学显微镜的使用与微生物观察
高中生物实验：普通光学显微镜的使用方法
光学显微镜的原理及构造
显微镜的原理和
中药粉末显微鉴别技术
透射电子显微镜的原理
显微镜原理与构造
显微镜的原理和使用方法
显微镜的使用实验教案
显微镜的原理和使用方法
(完整版)金相显微镜的基本原理、构造及使用
显微镜的使用方法实验报告
显微镜的原理和使用方法