内质网应激中线粒体的作用
内质网应激中线粒体的作用
发表时间：2016-06-14T11:52:46.683Z 来源：《健康前沿》2016年3月作者：李爱云刘保林黄芳（通讯作者）[导读] 内质网是细胞内分布最广泛、维持细胞功能重要的细胞器。
（中国药科大学中药药理教研室江苏南京 211198）
摘要内质网和线粒体为细胞中关系密切的细胞器，细胞应激可引发内质网应激（ER Stress），线粒体功能在ER Stress中发挥重要作用，通过线粒体相关的内质网膜（MAMs）传递信号影响ER Stress的发生与发展。
关键词 ER Stress MAMs 线粒体
内质网是细胞内分布最广泛、维持细胞功能重要的细胞器，其功能包括蛋白质的折叠，Ca2+的存储，脂质、碳水化合物的代谢及信号传导。细胞应激如Ca2+失调，氧化还原失衡，蛋白质糖基化异常及蛋白折叠缺陷均可导致未折叠或错折叠蛋白在内质网腔中积聚，引发ER Stress。细胞内存在一个完善的恢复细胞稳态或促进细胞死亡的信号通路，包括未折叠蛋白反应，内质网相关的蛋白降解途径（ERAD），自噬，缺氧信号及线粒体生物合成，统称为ER Stress反应[1]。非折叠蛋白反应是体内一系列适应性级联反应，通过调节内质网的三个膜感应蛋白而激活特定的下游转录程序：ATF4（PERK），剪切的ATF6（ATF6），拼接型XBP1（IRE1α），这些转录因子可直
接激活分子伴侣蛋白的转录[2]，促进内质网中蛋白质的折叠能力而减轻ER Stress，保护内质网功能。
线粒体是细胞内的具有双层膜结构的细胞器，之前研究认为线粒体为细胞质中独立存在并完成特定细胞和代谢功能的细胞器，近年来，越来越多的研究表明线粒体与内质网不仅在生理功能上相互联系，在病理条件下也存在信号传导，影响彼此的功能，导致细胞死亡及慢性疾病的发生[3]。
线粒体通过MAMs与内质网紧密相连，MAMs对于内质网与线粒体间的Ca2+信号传导、脂质转运及能量代谢至关重要[4]。线粒体Ca2+的摄取有利于调节线粒体代谢和内质网稳态，内质网与线粒体间Ca2+转运障碍导致细胞质中游离的钙离子增加，可通过激活p38丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）而引发ER Stress[5]。细胞内的ROS主要来源于线粒体，线粒体功能紊乱引起细胞内ROS异常升高引发氧化应激。此外，线粒体与内质网毗邻可保证内质网ATP的需求。
内质网与线粒体不仅在结构和功能上相互影响，线粒体应激与ER Stress也密切相关，共同参与疾病的发生与发展。线粒体应激在ER Stress中发挥重要作用，应激信号从内质网传导至线粒体，根据细胞应激的程度，引起线粒体促生存或促凋亡的适应性变化。在ER Stress 的适应性早期，促进细胞器间的Ca2+转运，促进线粒体氧化呼吸链活性，促进线粒体ATP的合成；而持续的ER Stress通过抑制线粒体氧化呼吸链、降低细胞内ATP的水平而损害细胞代谢，引起细胞凋亡或程序性细胞死亡[6]。因此，线粒体稳态对于改善ER Stress、维持内质网稳态有重要作用。
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线粒体氧化应激及其线粒体营养素干预机制
线粒体氧化应激及其线粒体营养素干预机制 摘要：线粒体在生物氧化和能量转换的过程中会产生活性氧，当活性氧的生成与机体抗氧化防御系统之间存在不平衡时，线粒体就会发生氧化应激。线粒体氧化应激导致线粒体能量代谢失调，进一步损伤线粒体，从而促进神经退行性疾病的发生，发展。研究表明，线粒体营养素既可以增强抗氧化防御系统功能，又能够减少线粒体活性氧的生成，从而修复线粒体的氧化损伤，进而改善线粒体的结构和功能。本文将从线粒体氧化应激和线粒体营养素干预机制两方面做以综述。关键词：线粒体氧化应激活性氧烟酸硫辛酸硫辛酰胺 线粒体是真核动物细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，细胞生命活动所需能量的80%是由线粒体提供的，因此，有人将线粒体称为细胞的“动力工厂”。线粒体生物氧化和能量转换的过程中伴随着活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生。过量的ROS会引起线粒体损伤，促进神经退行性疾病的发生，发展。 由氧化应激引起的线粒体损伤是衰老及神经退行性病变的主要原因，并且严重影响运动能力。线粒体损伤可导致关键的线粒体酶功能障碍。酶的功能障碍主要是由于底物和辅酶的结合不足，而这种结合不足在补充足够的底物或辅酶及其前体后可以得到改善，长期补充线粒体营养素(mt-nutrients)可以有效地保护线粒体功能的完整，修复线粒体的损伤。Liu[1]等把线粒体营养的功能定义为：①可以提高线粒体酶底物和辅酶的水平；②诱导二相酶增强细胞内的抗氧化防御能力；③清除自由基及防止氧化剂的生成；④修复线粒体膜损伤。现就线粒体氧化应激和线粒体营养素对其干预机制两方面做简要综述。 1 线粒体氧化应激 氧化应激是指活性氧生成与抗氧化防御系统之间的不平衡状态，氧化应激可在活性氧生成超过抗氧化防御系统时或者在抗氧化剂活性降低时发生。众所周知，线粒体是真核动物细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，但在线粒体生物氧化和能量转化的过程中会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，由于活性氧的活性非常高，过量的活性氧会进攻线粒体DNA及线粒体内蛋白质，脂类等生物大分子物质，从而损伤线粒体使其能量合成受到障碍，最终导致线粒体功能下降，线粒体氧化应激导致线粒体能量代谢失调，进一步损伤线粒体，从而促进神经退行性疾病的发生，发展。 1.1 线粒体活性氧的产生 线粒体具有有氧呼吸的特殊功能，在正常情况下，绝大多数的氧是通过与线粒内膜上的电子传递链传来的电子结合，
内质网应激
内质网应激 庄娟（江苏省淮阴师范学院生命科学学院淮安223300） 摘要内质网是真核细胞内蛋白质合成的重要场所，只有正确折叠的蛋白质才能够在内质网驻留或转运至高尔基体。如果蛋白质合成过多或不能正确折叠与运输，内质网内就会累积大量蛋白质，造成内质网应激，引发未折叠蛋白质反应。未折叠蛋白质反应主要与内质网感受器蛋白介导的信号通路有关。 关键词内质网应激未折叠蛋白质反应内质网感受器 内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞内蛋白质合成、脂质生成和钙离子贮存的主要场所。多种蛋白需要在内质网中折叠、组装、加工、包装及向高尔基体转运，这是一个需要细胞精确调控的过程。ER 含有一种免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin－bind-ing protein，BIP）和蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI），可以帮助与促进蛋白质的正确折叠。不能正确折叠的畸形肽链或未组装成寡聚体的蛋白质亚单位，无论是在内质网腔内还是在内质网膜上，一般不能进入高尔基体，主要通过泛素依赖性降解途径被蛋白酶体所降解。当内质网中未折叠或错误折叠蛋白累积，就会造成内质网应激，引发未折叠蛋白质反应（unfolded protein response，UPR）。 1内质网应激 内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指细胞受到内外因素的刺激时，内质网形态、功能的平衡状态受到破坏后发生分子生化的改变，蛋白质加工运输受阻，内质网内累积大量未折叠或错误折叠的蛋白质，细胞会采取相应的应答措施，缓解内质网压力，促进内质网正常功能的恢复［1］。引发ERS的因素很多，缺血低氧、葡萄糖或营养物匮乏、钙离子紊乱等可造成急性应激损伤；而病毒感染、分子伴侣或其底物的基因突变等能引发慢性应激损伤。 根据诱发原因，可将ERS分为以下3种类型：①未折叠或者错误折叠蛋白质在内质网腔内蓄积引发的UPR；②正确折叠的蛋白质在内质网腔内过度蓄积激活细胞核因子κB（NF－κB）引发的内质网过度负荷反应（ER over－load response，EOR）；③胆固醇缺乏引发的固醇调节元件结合蛋白质（sterol regulatory element binding protein，SREBP）通路调节的反应。 ERS是细胞对内质网蛋白累积的一种适应性应答方式，细胞通过减少蛋白质合成，促进蛋白质降解，增加帮助蛋白质折叠的分子伴侣等方式缓解内质网压力［2］。但ERS过强或持续时间过长，超过细胞自身的调节能力，就会伤害细胞，引起细胞代谢紊乱［3］和凋亡［1］等。 2未折叠蛋白质反应 目前对UPR的机制研究较为深入。如果新合成的蛋白质在N末端糖基化、二硫键形成以及蛋白质由内质网向高尔基体转运等过程受阻时，未折叠或错误折叠的新合成蛋白质就会在内质网中大量堆积，细胞就会启动UPR［2］。UPR与内质网膜上的跨膜蛋白PERK（PKR－like ER1kinase）、IRE1（inositol requiring enzyme1）和ATF6（activating transcription factor－6）介导的信号通路有关［4，5］，这三种膜蛋白也被称为内质网感受器（ER stress sensors）［2］。 2．1内质网感受器蛋白的激活BIP（immunoglobulin －binding protein）是ER腔内的一种分子伴侣，为热休克蛋白70（heat shock protein of70kDa，HSP70）家族成员，又称为葡萄糖调节蛋白78（glucose－regulated pro-tein of78kDa，GRP78），由N端的ATP酶结构域和C 端的待折叠蛋白结合结构域组成，从酵母到高等哺乳动物高度保守。BIP能结合未折叠蛋白质富含疏水氨基酸区域，利用ATP水解释放能量帮助蛋白质折叠，并阻止未折叠、错误折叠的蛋白质聚集。非应激状态时GRP78/BIP与PERK、IRE1及ATF6这三种感受器的ER腔部分结合在一起，此情况下感受器蛋白没有活性。当ER内蛋白聚集，内质网处于应激状态时，与未折叠蛋白结合能力较强的BIP就解离释放到ER腔内，执行蛋白质折叠功能。此时内质网感受器被激活，产生PERK－eIF2α、IRE1－XBP1s和ATF6－ERSE三条主要的信号通路，进行UPR［2，6］。内质网应激条件下，BIP/GRP78表达上调明显，因而BIP/GRP78的诱导表达可作为ERS和UPR的激活标志［7］。 2．2信号通路PERK－eIF2α的应答反应PERK是内质网单次跨膜蛋白，胞质区有激酶结构域。内质网应激时，与BIP/GRP78解偶联的PERK蛋白形成同源二聚体，胞质区结构域自身磷酸化被激活，与真核生物起始因子2（eukaryotic initiation factor2，eIF2）的α亚单位（eIF2α）结合并促使eIF2α上的N端第51位丝氨酸磷酸化。磷酸化的eIF2a蛋白能抑制翻译起始复合物中GDP与GTP的交换，阻断了翻译起始复合物eIF2－GTP－tRNAMet的组装，从而抑制蛋白质的翻译与合成，减少新生蛋白质向内质网的内流，减少未折叠蛋
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成人围手术期营养支持指南 中华医学会肠外肠内营养学分会 自2006年中华医学会肠外肠内营养学分会制定《临床诊疗指南：肠内肠外营养 学分册》至今已有10年，为了更好地规范我国的临床营养实践，我们按照当今 国际上指南制定的标准流程，根据发表的文献，参考各国和国际性营养学会的相 关指南，综合专家意见和临床经验进行回顾和分析，并广泛征求意见，多次组织 讨论和修改，最终形成本指南。 指南制定方法学 本指南主要采用德国医学科学委员会、苏格兰学院指南协作网及牛津大学循证医 学中心所提供的分级系统，并根据GRADE系统对证据质量和推荐强度做出评定[1]。 证据级别主要由研究的数量和类型决定，用来评判相关证据的质量和效果的确定 性，等级从“高”到“极低”，最高证据质量来源于多项随机对照试验 (randomized controlled trial，RCT)所产生的一致结果和Meta分析结果(表 1)[2]。 表1《成人围手术期营养支持指南》采用的证据分级 证据级 别 定义研究类型 高我们非常确信真实的效应值接近效应估计无限制、一致性好、精确、可直接应用、无发表偏倚的 RCT；效应量很大的观察性研究 中对效应估计值我们有中等程度信心：真实值有可能接近估计值，但仍存在二者大不相同 的可能性有严重限制、结果严重不一致、精确度严重不足、部分不能直接应用、可能存在发表偏倚的RCT；有剂量反应、效应量大的观察性研究 低我们对效应估值的确信程度有限：真实值可有极其严重限制、结果极其严重不一致、精确度极其严
能与估计值大不相同重不足、大部分不能直接应用、很有可能存在发表偏倚 的RCT；观察性研究 极低我们对效应估计值几乎没有信心：真实值很可能与估计值大不相同有非常严重限制、结果非常严重不一致的RCT；结果不一致的观察性研究；非系统的观察性研究(病例系列研究、病例报告) 注：RCT为随机对照试验 根据PICO系统构建合适的临床问题，通过相应的关键词进行系统文献检索，文献搜索资源中，一级文献数据库包括MEDLINE、PubMed、EmBase、中国生物医学文献数据库，二级文献数据库包括 Cochrane Database of Systemic Reviews、 the National Guideline Clearinghouse，再利用Google学术搜索进行搜索(含电子出版物)，搜索时间截至2016年3月29日。所有文献由2～3名工作人员采用提取数据形式的方法进行数据验证和研究方法质量评估，每篇文献生成一个共识评估。采用Review Manager 5.2软件对数据进行处理，采用GRADE Pro 软件对分析后的数据就干预措施和其结果的证据主体质量进行评估并生成森林图。如就某个问题，观察性研究是唯一可用的证据时，采用GRADE系统进行证据质量评估；如无RCT或观察性研究能直接回答相关问题时，由相关专家对最佳临床实践意见进行协商，推荐意见归为“专家协商意见”。 确定推荐强度时，通过评价推荐意见的效益比、回顾支持性证据等方法进行综合协商，采用Delphi法进行群体决定和投票后达成一致；每个特定推荐需获得75%的参与专家同意方可成立。强烈推荐指确定针对特定群体或患者的临床决策或干
内质网应激与心血管疾病
内质网应激与心血管疾病 摘要：应激是心血管疾病发生的机理之一，内质网应激是亚细胞器水平的应激。内质网内钙稳态失衡，错误折叠蛋白质聚集等都可引起内质网应激。研究发现内 质网应激参与动脉粥样硬化的形成；同时还介导组织缺血再灌注时的细胞损伤和 细胞死亡；预先诱发内质网应激可以通过改善再灌注损伤时细胞钙超载保护心肌 细胞。 关键词：内质网应激；细胞凋亡；心血管疾病 前言：内质网（endoplasmicreticulum，ER）是真核细胞蛋白质合成折叠、脂质合成以及 细胞内钙储存的亚细胞器，也是调节细胞应激与凋亡的重要场所。很多病理生理刺激，如氧 化应激、缺血缺氧、钙稳态紊乱及病毒感染等，能够引起内质网腔内未折叠与错误折叠蛋白 蓄积以及Ca2+平衡紊乱，称为内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。适度的ERS 是一种保护性细胞机制，可通过促进内质网处理未折叠及错误折叠蛋白等降低损伤；持久或 严重的ERS可引起细胞凋亡。根据诱发ERS的原因不同，ERS可分为3种类型：未折叠/误折 叠蛋白在内质网内蓄积激发的未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR），过多表达 的蛋白质经ER膜转运（如病毒感染产生大量病毒糖蛋白）激发的内质网过负荷反应，以及 ER膜上固醇剥夺激活的固醇级联反应。UPR是介导ERS的最重要的信号机制。ERS与很多心 血管疾病如动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌肥大及心力衰竭等有关。 一、内质网应激反应的途径 内质网是一个动态的膜性细胞器，具有多种功能，包括：蛋白质的合成、修饰、折叠和 亚基的组合；类固醇合成；脂质合成；糖原合成；钙的储存以及钙稳态的维持等。感染性因素，环境中的毒性物质，不利的代谢条件以及蛋白质糖基化障碍、二硫键生成减少，蛋白质 从内质网到高尔基体的转运障碍，错误折叠蛋白的表达，内质网腔内的钙损耗等都可以干扰 内质网的功能，破坏内质网稳态，引发内质网应激。细胞为了生存产生针对内质网应激的反应，称内质网应激反应，迄今为止，至少已发现了四种功能上相互独立的反应途径。 1.1蛋白质生物合成的早期暂时性减缓： 蛋白质的不正确折叠引发的内质网应激反应称未折叠蛋白反应（unfoldedprote in response，UPR），在哺乳动物细胞中由三种内质网感应蛋白介导，即IRE-1 （type-I ER transmembrane prote in kinase），ATF-6 （activating transcription factor 6）和PERK（panc reatic eIF-2 kinase，pancreatic ER kinase）。此三种感应蛋白在未发生应激时都以无活性的状 态与GPR78 （glucose-regu-lated prote in78）/ B iP （immunoglobulin-binding prote in）结合。 未折叠蛋白的积聚使GRP78 / B ip与三种感应蛋白分离，引起它们的激活。其中PERK 自身聚合、自我磷酸化激活，将e IF-2α（α subunit of eukaryotic translation initiation factor 2）的 Ser51磷酸化，使之不能结合GTP，阻止了起始蛋氨酸..RNA与核糖体的结合，无法进行翻译 起始。这种保护性机制很快阻止了新生蛋白向内质网腔的转运，抑制了内质网的负荷过重。 2 某些基因的活化： 编码参与内质网蛋白质的折叠、转运、分泌、降解的基因在内质网应激时诱导表达，其 中包括内质网应激反应的标志性蛋白GRP78 / B ip。GRP78 / B ip是热休克蛋白家族H SP70的 成员之一，主要参与内质网中蛋白质的重新折叠和装配。 研究发现：内质网应激时诱导基因表达的通路有3条。 IRE-1是应激激活的有内切酶活性的内质网跨膜蛋白激酶，作为核酸内切酶对XBP-1 （X-box binding prote in 1）mR-NA进行选择性剪接，去除26bp的内含子序列，导致蛋白翻译移码，产生XBP..1 蛋白，转录活化含有上游ERSE （ERstress response e lement or the unfolded prote in response e lement（UPRE ））元件的基因。[1] ATF-6在内质网应激发生后，从内质网膜转移到高尔基体，其反式激活结构域被特异蛋白 酶（specific proteases ）S1P和S2P从膜上水解下来，转移到胞核中，与ERSE 相互作用，激 活许多内质网应激反应蛋白的转录，包括GRP78 / B ip，CHOP（C /EBP homologous prote in）/ GADD153 （grow tharrestand DNA-dam ag e-induc ib le gene 153），XBP-1，ERp72 （ERprote in72）和H erp （H cy-induced ER prote in）。S1P和S2P同时识别、裂解、激活SREBPs
内质网应激
2.2 内质网应激 2.2.1 内质网及内质网应激概述 内质网（endoplasmic reticulum，ER）是哺乳动物细胞中一种重要的细胞器，其膜结构占细胞内膜的二分之一，是细胞内其它膜性细胞器的重要来源，在内膜系统中占有中心地位。ER 的功能包括：①ER 是细胞的钙储存库，内质网的钙离子浓度高达 5.0mmol/L，而胞浆中为 0.1ummol/L。并能调节维持细胞内钙平衡。②ER 是分泌性蛋白和膜蛋白的合成、折叠、运输以及修饰的场所。ER 通过内部质量调控机制筛选出正确折叠的蛋白质，并将其运至高尔基体，将未折叠或错误折叠的蛋白质扣留以进一步完成折叠或进行降解处理。③ER 还参与固醇激素的合成及糖类和脂类代谢，内质网膜上含有固醇调节元件结合蛋白，对固醇和脂质合成起调节作用。 ER对影响细胞内能量水平、氧化状态或钙离子浓度异常的应激极度敏感。当细胞受到某些打击（如缺氧、药物毒性等）后，内质网腔内氧化环境被破坏，钙代谢失调，ER功能发生紊乱，突变蛋白质产生或者蛋白质二硫键不能形成，引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内积聚以及钙平衡失调的状态，即内质网应激（endoplasmic reticulumstress，ERS）。内质网巨大的膜结构为细胞内活性物质的反应提供了一个广阔的平台，在许多信号调控中起到关键作用。最近的研究表明，内质网是细胞凋亡调节中的重要环节[39]。ERS可以介导与死亡受体和线粒体途径不同的一条新的凋亡通路。当细胞遭到毒性药物、感染、缺氧等刺激时，内质网腔未折叠蛋白增多和细胞内钙离子超载，引起caspase 12活化，继而激活下游的caspase，导致细胞凋亡。早期的ERS是机体自身代偿的 过程，对细胞具有保护作用；如果这种失衡超过了机体自身调节的能力，最终的结局将是细胞的死亡。ERS的确切机制目前尚不明确。深入研究ER及ERS，对于完善细胞损伤和凋亡理博具有重要意义，有助于进一步认识疾病发生发展的机制，为临床疾病预防和治疗提供新的理博依据。 2.2.2 内质网应激的信号通路 ER 内环境的稳态一旦被打破，将激活一系列的级联反应通路，包括PERK/eIF2α通路、IRE1/XBP1 通路及 ATF6 介导的通路。内质网应激激活的信号通路主要有[40]：①未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）；
内质网应激的信号通路及其与细胞凋亡相关疾病关系的研究进展
山东医药2019年第59卷第17期 内质网应激的信号通路及其与细胞凋亡 相关疾病关系的研究进展 叶勇1，赵海霞2,张长城2 （1三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌443000；2三峡大学医学院） 摘要:细胞凋亡是指生理性或者病理性因素触发细胞内预存的死亡程序，内质网应激（ERS）在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。氧化应激、Ca"稳态失衡及缺氧等可引起蛋白质在内质网内的折叠受到抑制,促使未折叠蛋白聚集，引起ERS,激活未折叠蛋白反应，若此反应持续存在，则可诱发细胞凋亡。ERS包括PERK、IRE1、ATF6三条经典的信号通路，由PERK介导的信号通路能快速减少蛋白质的合成，减轻内质网的负荷；IRE1和ATF6介导的信号通路能增加内质网分子伴侣蛋白的合成，增加内质网蛋白的折叠、转运和降解的能力，减轻内质网的负荷。 ERS参与了心肌缺血再灌注损伤、衰老、骨质疏松、肝硬化、肿瘤等疾病的发生发展男十对ERS进行干预有望成为治疗凋亡相关疾病的重要靶点。 关键词：内质网应激;细胞凋亡;凋亡相关疾病 doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2019.17.028 中图分类号:R329.2文献标志码:A文章编号：1002-266X（2019）174098-04 细胞凋亡又称为程序性死亡，是指生理性或者病理性因素触发细胞内预存的死亡程序,导致细胞自主有序的死亡。与坏死不同，凋亡是主动过程，涉及一系列信号通路的激活与调控，与细胞增殖共同 维持体内细胞数量的动态平衡。研究表明，内质网 应激（ERS）、线粒体通路、死亡受体通路及氧化应激等均参与了细胞凋亡的发生发展，其中ERS是目前的研究热点［1>2］o内质网是由细胞内膜构成的封闭网状管道系统，是真核细胞内重要的细胞器,主要负 通信作者：张长城(E-mail:greatwall@https://www.sodocs.net/doc/bc5958922.html,) [21]Su V,Lau AF.Connexins:Mechanisms regulating protein levels and intercellular communication[J].FEBS Lett,2014,88(8): 1212-1220. [22]Liu P,Xia L,Zhang WL,et al.Identification of serum microR- NAs as diagnostic and prognostic biomarkers for acute pancreatitis [J].Pancreatology,2014,14(3)：159-166. [23]Bi Y,Wang G,Liu X,et al.Low-after-high glucose down-regula- ted Cx43in H9c2cells by autophagy activation via cross-regulation by the PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK(1/2)signal pathways [J].Endocrine,2017,56(2)：336-345. [24]李靖华，张涛，张胜逆，等.水通道蛋白-1及核因子k B在大鼠 重症急性胰腺炎肺损伤中的表达及意义[J].中华消化外科杂 志,2016,15(8)：830-835. [25]刘多谋，黄鹤光,周武汉，等.白细胞介素-1|3对人脐静脉内皮 细胞结构及水通道蛋白-1的影响[].中华肝胆外科杂志， 2014,20(2)：142-145.责分泌型蛋白和膜蛋白的合成、折叠、修饰及运输,同时也是细胞内Ca2+的主要储存库。在某些生理和病理条件下（如氧化应激、Ca2+稳态失衡及缺氧等）可引起蛋白质在内质网内的折叠受到抑制，促使未折叠蛋白聚集，激活未折叠蛋白反应，引起ERS o ERS包括未折叠蛋白反应、内质网相关性死亡和整合应激反应三个相互联系的动态过程，其中未折叠蛋白反应起重要作用［］。一定程度的ERS 有利于激活细胞的保护性适应机制，而ERS过强或持续时间过长，导致内质网的内稳态严重失衡，无法修复，则引起细胞凋亡［,］。因此，受损细胞往往会 [26]Zhang Z,Chen Z,Song Y,et al.Expression of aquaporin5in- creases proliferation and metastasis potential of lung cancer[J].J Pathol,2010,221(2)：210-220. [27]Cao C,Sun Y,Healey S,et al.EGFR-mediated expression of aquaporin-3is involved in human skin fibroblast migration[J]. Biochem J,2006,400(2)：225-234. [28]Crockett SD,Wani S,Gardner TB,et al.American gastroenter- ological association institute guideline on initial management of a-cute pancreatitis[J].Gastroenterology,2018,154(4):1096-1101. [29]陈康部?乌司他汀治疗急性重症胰腺炎疗效观察[]?中国误 诊学杂志,011,1(30)：7353-7353. [30]Xie Z,Chan E,Long LM,et al.High dose intravenous immuno- globulin therapy of the Systemic Capillary Leak Syndrome( Clark-son disease)J] .Am J Med,2015,128(1)：91-95. (收稿日期：2019-01-21) 98
线粒体损伤的检测方法研究进展
线粒体损伤的检测方法研究进展 发表时间：2018-05-15T15:25:47.567Z 来源：《医师在线》2018年1月下第2期作者：刘全李毅 [导读] 线粒体损伤的基本机制包括线粒体DNA(mtDNA)的损伤和线粒体膜损伤。 （青海大学附属医院烧伤整形科；青海西宁810000） 摘要：线粒体是细胞能量代谢的中心，而在各种致病因素作用下线粒体极易出现各种结构和功能损伤，这在疾病的发生与发展中起着十分重要的影响，文章就线粒体结构和功能损伤及其检测方法作一综述。 关键词：线粒体损伤；检测方法 线粒体位于细胞核外,既能产生能量又能携带遗传信息,它在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。而在外界各种致病因素作用下线粒体极易出现损伤,造成线粒体功能的障碍,进一步导致细胞功能的损伤,引起细胞的自噬、凋亡。这在疾病的发生与发展中起着十分重要的影响，因此寻找特异、敏感的线粒体损伤指标，检测可能的早期损伤，对于机体有着十分重要的意义。 线粒体损伤的基本机制包括线粒体DNA(mtDNA)的损伤和线粒体膜损伤。氧化应激的激活,产生过多的氧自由基,除了引起碱基配对错误、碱基位点的修饰和链的断裂使mtDNA损伤外,还使细胞及线粒体膜脂质过氧化,导致线粒体功能障碍,ATP生成减少,钙泵失活使细胞内钙增多,激活磷脂酶活性,使膜磷脂分解,造成膜通透性改变和跨膜电位的变化,导致蛋白质的释放并造成线粒体自身以及细胞的功能障碍,细胞色素C从线粒体释放到细胞浆,导致细胞凋亡或死亡。 线粒体损伤检测方法: (1)线粒体形态学变化检测方法：20世纪60年代初，Engel 等[1]首先用MGT染色发现线粒体肌病患者肌膜和肌纤维之间呈不规则的红染颗粒改变，称为粗糙红纤维，为线粒体肌病具有特征性的形态学改变。宋东林等[2]曾用电镜观察线粒体肌病时发现在骨骼肌肌膜下线粒体异常增多，并有巨大畸形线粒体出现，线粒体嵴型异常，可呈同心漩涡状、迷宫状或矩形结晶状结构。姚英民等[3]曾用电镜观察轮状病毒感染时线粒体形态变化时发现线粒体外形肿胀，电子密度增高，基质中在大量具有紊乱的峭和晶状物，峭模糊不清，基质凝集。此外还可以采用分光光度法和钙离子荧光探针FLUO-2/AM及荧光分光光度法测定线粒体肿胀及游离钙离子的含量。 (2)mtDNA缺失突变的检测方法:实时荧光PCR技术是目前最准确、重现性最好并得到国际公认的核酸分子定量检测的标准方法。它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、无污染、自动化程度高、能实现多重反应、具实时性和准确性等优点，适于快速分析要求的大样本。进行mtDNA缺失片段和对照DNA片段的定量分析时，一般采用相对定量，最后计算出发生缺失的 mtDNA占总mtDNA的比例。常用的检测模式有TaqMan探针和SYBR Green I检测模式。 (3)线粒体渗透转换孔（mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)）[4]是线粒体渗透转换功能的结构基础，MPTP 对细胞内多种离子浓度变化非常敏感[5]，特别是对Ca2+浓度变化敏感。MPTP 的大量开启能引起膜电位的崩解并导致包括细胞的凋亡。因此测定MPTP 在线粒体的研究中至关重要。有关对MPTP 的检测方法有：活性物质标记测定、膜片钳法等[6]。标记法需要对物质进行标记且测定繁琐，需要特殊的检测方法；膜片钳法需要特殊的电极，工艺复杂，需要较高的技术；分光光度法简单易用，只需对反应体系的吸光度进行时间扫描，就可获得线粒体渗透转换能力的时相变化，间接反映了MPTP的能力. (4)膜电位的检测方法:Chu等[7]刮曾用激光共聚焦检测大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位变化，该法采用线粒体跨膜电位检测试剂盒JC-1。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位Δψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡鼍线粒体去极化的比例。Lim等[8]用四苯膦等脂溶性阳离子渗透入线粒体膜基质，然后通过检测四苯膦的浓度来确定膜电位，需要注意的是此法在检测过程中对溶液pH值的稳定性要求较高，否则将影响实测值。膜片钳技术是一种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多个离子通道活动的技术，其反映的电流特征可以用来评价线粒体功能。全自动膜片钳技术效率高，是传统膜片钳技术的20～300倍，操作技术简单；缺点是仅适用于悬浮细胞的检测[9]。线粒体膜是线粒体与周围环境联系、反应的桥梁，膜磷脂含量与流动性的改变与疾病的发生、发展密切相关。脂质过氧化作用可以导致膜磷脂的减少，线粒体膜磷脂的检测对判断线粒体功能具有重要意义[10]。 (5)胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）可破坏线粒体的酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，进入恶性循环状态。同时 ROS 还可攻击线粒体 DNA 产生氧化损伤，导致线粒体 ATP 合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化，因此 ROS 增多也是线粒体功能障碍的表现之一[11，12]。 ROS 可采用荧光探针 DCHFDA 染料测定；用荧光探针 MitoSOX 检测线粒体活性氧。胞内ROS测定还包括化学发光法、电子自旋共振和分光光度法。 总结与展望 综上所述，线粒体是细胞能量的主要来源，对维持细胞正常生理功能起着重要作用。线粒体功能的改变往往先于临床症状出现。对线粒体结构及功能的检测可以及时察觉细胞功能的改变并做相应的处理，可以阻止或延缓疾病的发生、发展。虽然现在有多种方法可以用来检测线粒体的功能，但是由于多方面条件的限制，目前绝大多数方法仅局限于科研，距离真正的临床实际应用仍然有很长的路要走。参考文献 [1] Engel W K, Cunningham G G. RAPID EXAMINATION OF MUSCLE TISSUE. AN IMPROVED TRICHROME METHOD FOR FRESH-FROZEN BIOPSY SECTIONS[J]. Neurology, 1963, 13(13):919-923 [2] 宋东林, 吕强, 陈晋文,等. 线粒体肌病和线粒体脑肌病组织化学及电镜的研究[J]. 中国神经精神疾病杂志, 1994(1):143-145. [3] 姚英民, 欧巧群, 陈瑶. 人类轮状病毒感染新生小鼠肠道外组织超微结构的变化[J]. 南方医科大学学报, 2006, 26(9):1334-1336. [4]Zoratti M.Szabo I.The mitochondrial permeability transition[J] Biochim Biophys Acta, 1995,141:139—176. [5] Scorrano L, Petronilli V, Bernardi P. On the voltage dependence of the mitochondrial permeability transition pore. A critical
二甲双胍对大鼠脊髓损伤后内质网应激和细胞凋亡的影响
— 161 —CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.42 No.2 2019 解剖学杂志 2019年第42卷第2期二甲双胍对大鼠脊髓损伤后内质网应激和细胞凋亡的影响* 郭卫东1，2 李 刚3 范仲凯1△ （1 锦州医科大学附属第一医院骨科， 锦州 121001；2 空军军医大学唐都医院骨科， 西安 710000； 3 同济大学附属上海第十人民医院骨科， 上海 200072） 摘要 目的：研究二甲双胍（MET ）对大鼠脊髓损伤（SCI ）后内质网应激（ERS ）和细胞凋亡的影响，探讨二 甲双胍对SCI 的保护作用及机制。方法： 成年雌性SD 大鼠随机分为3组，分别是假手术组（Sham 组）、单纯脊髓损伤组（SCI 组）和二甲双胍干预组（MET 组）。采用Allen 方法制备大鼠SCI 模型，MET 组和SCI 组大鼠建模后，立即腹腔注射MET （50 mg ·kg -1·d -1）或等量生理盐水，连续处理7天后，取脊髓组织，用实时定量PCR 检测各组脊髓组织中葡萄糖调节蛋白78 （ GRP78），CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP ） 和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（caspase-12）的mRNA 水平，免疫印迹检测各组脊髓组织中GRP78、CHOP 、caspase-12和active caspase-3的蛋白水平，免疫荧光染色检测各组脊髓组织中GRP78、CHOP 和caspase-12的蛋白水平，TUNEL 染色法检测各组脊髓组织中细胞凋亡水平，BBB 评分检测大鼠SCI 后运动功能情况。结果：与Sham 组相比，SCI 组中GRP78、CHOP 和caspase-12的mRNA 和蛋白水平明显升高，active caspase-3蛋白表达和细胞凋亡数目明显增加，BBB 评分明显降低；与SCI 组相比，MET 组中GRP78、CHOP 和caspase-12的mRNA 和蛋白水平明显降低，active caspase-3蛋白表达和细胞凋亡数目明显减少，BBB 运动评分明显升高。结论：二甲双胍可以抑制大鼠SCI 后细胞凋亡，促进后肢运动功能恢复，其机制可能与抑制ERS 有关。 关键词 脊髓损伤；二甲双胍；内质网应激；细胞凋亡；大鼠 Effects of metformin on endoplasmic reticulum stress and apoptosis after spinal cord injury in rats * Guo Weidong 1， 2， Li Gang 3， Fan Zhongkai 1△ （1. Department of Orthopedics ， First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical College ， Jinzhou 121001； 2. Department of Orthopedics ， Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University ， Xi'an 710000； 3. Department of Orthopedic ， No.10 Affiliated Shanghai People's Hospital of Tongji University ， Shanghai 200072， China ）Abstract Objective ： To detect the effects of metformin (MET) on ER stress and apoptosis after spinal cord injury (SCI) in rats. Methods ：Adult female SD rats were randomly divided into three groups ： sham group (Sham group)， spinal cord injury group (SCI group) and MET intervention group (50 mg/kg/day). SCI rat model was established at T10 section by Allen's weight drop method. Spinal cord tissues were harvested 7 days after spinal cord injury. Real-time quantitative PCR was used to detect the expressions of GRP78， CHOP ， and caspase-12 mRNA. The expression of GRP78， CHOP ， caspase-12， and active caspase-3 was detected by Western blotting and immunofluorescence labeling technique. The fluorescent TUNEL staining was used to detect apoptosis. The BBB score was used to detect the recovery of hindlimb motor function in rats. Results ：Compared with sham group ， the mRNA and protein levels of GRP78， CHOP ， and caspase-12 were significantly increased and so were the protein levels of active caspase-3 and the number of apoptosic cells ， while the BBB scores were decreased significantly in SCI group. Compared with SCI group ， the mRNA and protein levels GRP78， CHOP ， and caspase-12， and the protein levels of active caspase-3 were significantly reduced ， and the apoptosis had the same trend ； however ， BBB scores were increased significantly in MET group. Conclusion ： Metformin may inhibit the apoptosis ， and promote the recovery of hindlimb motor function by inhibiting endoplasmic reticulum stress after spinal cord injury in rats. Key words spinal cord injury ； metformin ； endoplasmic reticulum stress ； apoptosis ； rat * 辽宁省自然科学基金（201602277）；辽宁省高等学校优秀人才支持计 划项目（LJQ2014091） 第1作者 E-mail ：guoweidonggwd@https://www.sodocs.net/doc/bc5958922.html, △ 通信作者，E-mail ：fanzk_ln@https://www.sodocs.net/doc/bc5958922.html, 收稿日期：2018-10-08；修回日期：2019-01-12doi ： 10.3969/j.issn.1001-1633.2019.02.012·论?著· 脊髓损伤（spinal cord injury ，SCI ） 是脊柱外科常见疾病，由于人们尚未透彻地认识到SCI 的机 制，导致至今仍未发现治疗SCI 的特效药物。大量
术前护理访视对减轻手术患者围手术生期应激反应的研究
术前护理访视对减轻手术患者围手术生期应激反应的研究 目的分析术前护理访视对减轻手术患者围手术期应激反应的影响。方法选取医院2014年3月到2015年3月在我院接受手術治疗的患者44例为研究对象，将其按照随机数字法分为实验组与常规组。常规组给予常规的术前介绍，实验组在常规组基础上采用术前护理访视。对比两组患者围术期的应激反应状况。结果实验组患者的焦虑值、血压、心率均显著优于常规组，三项数据差异有统计学意义（P＜0.05）。结论术前护理访视对减轻手术患者围手术期应激反应的影响显著，借助术前护理访视可以有效改善患者应激反应，从而改善疗效，值得临床推广。 标签：术前护理访视；围手术期；应激反应 术前护理访视是手术室护理工作中的基本任务之一，同时也是护理人员在日常手术护理内容中的重要内容，开展术前护理访视可以有效的缓解患者的紧张、焦虑、恐惧等心理情绪，同时对于手术信任度、康复信心也有一定的优化改进作用[1]。对此，为了更好的明确术前护理访视的重要性，本文以我院患者为例进行研究分析，现报道如下。 1 资料和方法 1.1 一般资料 选取医院2014年3月到2015年3月在我院接受手术治疗的患者44例为研究对象，将其按照随机数字法分为实验组与常规组，每组22例。常规组男13例，女9例，年龄12到65岁，平均年龄（35.5±3.1）；实验组男12例，女10例，年龄11到66岁，平均年龄（37.7±3.3）岁。两组患者的年龄、性别等一般资料差异无统计学意义（P>0.05）。 1.2 方法 常规组给予常规的术前介绍，主要是介绍手术的方法、手术过程等。 实验组在常规组基础上采用术前护理访视。在手术之前1小时对患者进行术前护理评估以及健康引导，并做好细致的记录。具体方式如下。 1.2.1 护理评估 查阅患者的基本病历情况，例如患者的姓名、年龄、体重、药物过敏史、各项手术术前常规检查结果以及特殊检查结果、手术名称、麻醉方式等。观察患者的精神状态、测量生命体征、检查营养情况、听诊患者双肺呼吸音以及评估心功能等。和患者及其家属进行沟通交流，掌握患者的饮食习惯，尤其是对于一些年龄较小的患者，需要掌握患者的个人喜好、大小便习惯等。和病区主管医生进行
DTT诱导线粒体应激引起胶质瘤细胞凋亡的机制研究
中国实验诊断学2019年3月第23卷第3期515 human and murine squamous cell carcinoma[JJ Clin Invest, 2011,121(2):809. [9]Hatakeyama H,Cheng H,Wirth P,et al.Regulation of heparin binding EGF-Like growth factor by miR212and acquired cetux-imab resistance in head and neck squamous cell carcinoma[J]. PLos One,2010,5(9)：12702 [10]An X,Sarmiento C?Tan T,et al.Regulation of multidrug resist- ance by microRNAs in anti-cancer therapy[J].Acta Pharm Sin B,2017,7(1)：38. [11]Kang L.Mao J,Tao Y,et al.MicroRNA-34a suppresses the breast cancer stem cell-like characteristics by downregulating Notchl pathway]J].Cancer Sci?2015,106(6):700. [12]Alhasan L.MiR-126Modulates Angiogenesis in Breast Cancer by Targeting VEGF-A-mRNA[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2019,20(1):193. [13]Zhang Y?Yan J.Wang L.et al.HIF-la Promotes Breast Cancer Cell MCF-7Proliferation and Invasion Through Regulating miR-210[J].Cancer Biot h er Radiopharm,2017,32(8):297. [14]Zuo J,Wen M,Lei M,et al.MiR-210links hypoxia with cell pro- liferation regulation in human Laryngocarcinoma cancer[J].J Cell Biochem,2015,116(6)：1039. [15]王苹，刘照轩，于红，等.抑制miRNA-210表达降低缺氧所 致喉癌Hep-2细胞放疗耐受的实验研究[J].中华临床医师杂志，2015,9(7):1174. (收稿日期:2018-11-30) 文章编号：1007-4287(2019)03-0515-04 DTT诱导线粒体应激引起胶质瘤 细胞凋亡的机制研究 周子荐」，沈璐妍2,刘远达彳，全成实" (1.吉林大学临床医学院，吉林长春130021；2.吉林大学基础医学院病理生理学系； 3.吉林大学第二医院胃肠营养及疝外科) 研究表明，胶质瘤细胞对化疗药的敏感性与其细胞内部发生的内质网应激有着十分密切的关联在化疗药物的作用下，肿瘤细胞内质网稳态受到破坏，蛋白质无法折叠或错误折叠.引起内质网应激図。DTT(二硫苏糖醇)是一种内质网应激诱导剂，可阻止蛋白质中的半胱氨酸残基的氧化，干扰PDI(二硫键异构酶)在蛋白质二硫键形成中的催化作用，导致错误折叠的蛋白大量堆集⑶，从而诱发内质网应激。因此，本实验选用DTT诱导脑胶质瘤细胞系SHG44产生内质网应激，并进行线粒体应激相关指标、线粒体ROS水平和细胞凋亡蛋白检测。 1材料与方法 1.1细胞、主要试剂与仪器人脑胶质瘤细胞系SHG44,购于上海子实生物公司。二硫苏糖醇(DTT)购自北京coolaber公司,Caspase-3活性检测试剂盒购自上海碧云天公司。GRP78蛋白抗体购自proteintech公司；CHOP购自abeam公司；(3-actin、PDI、HSP10、HSP60、ClpP、LON、Htr A2/ ()mi抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG~抗和HRP *通讯作者标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司。 1.2实验方法 1.2.1细胞培养及处理细胞培养：使用10%胎牛血清的低糖DMEM培养基置于37'C,5%CQ细胞培养箱中培养，保持饱和湿度。细胞培养每3天进行一次传代，细胞使用0.01M PBS冲洗一次，0.25%胰酶细胞消化，并按照1:3的比例进行传代。药物处理：取对数期生长细胞，设置空白对照组和实验组，实验组采用DTT(5“mol/ml)分别处理3h,6h,12h及24h。 1.2.2MTT比色法检测96孔板接种为1.0X 104细胞/孔，细胞用含10%小牛血清的正常培养液混匀，每孔终体积为100“1,5%CO2、37C培养箱孵育过夜。设置3个阴性对照组，每个实验组设3个复孔，按实验所需加药物处理，每孔终体积为100以。到作用时间点结束后，再往每孔加入10以MTT,孵育4-6h后弃去培养液，每孔加入1500 DMS()。孔板在平板振荡器上振荡5-10min。酶标仪490nm波长测取吸光度值，记录结果，计算抑制率或存活率。 1.2.3细胞线粒体ROS水平检测细胞接种于6孔板上，分组处理同1.2.1。以1：1000Mito-SOX