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小鼠肝脏淋巴细胞分离

小鼠肝脏淋巴细胞分离
小鼠肝脏淋巴细胞分离

肝脏淋巴细胞分离protocol

1. 腹腔注射100uL/只小鼠麻醉;

2. 用约20mL PBS从下腔静脉处灌洗(肾,肺,肝均变白,肝脏灌注也可);

3. 取10cm细胞培养皿,加入10mL 10% FBS+DMEM,将滤网浸于其中,取出的肝组织置于滤网中;

4. 用1mL注射器的内芯研磨,制备细胞悬液;

5. 从皿中吸取细胞悬液到50mL离心管,补加PBS至30mL;

6. 50g离心3min,上清转移至新管;

7. 1500rpm X 5min离心,2.5mL DMEM重悬细胞。

8. 准备percoll:

6mL 100% percoll + 660uL 10X PBS配成90% percoll

4mL 90% percol + 1.12mL DMEM配成70% percoll

2.5mL细胞重悬液+ 2mL 90% percoll配成40% percoll;

9. 将40% percoll细胞悬液沿管壁缓缓加入70% percoll中;

10. 2000rpm离心20min,brake和accelerate都设为level 1;

11. 吸取中间层细胞,PBS补加到10mL,400g离心10分钟;

12. 弃上清,加1mL红细胞裂解液,裂解2min

13. 补加PBS到10mL,终止裂解,400g离心10分钟

14. 将细胞重悬到合适体积,计数,用于下游分析

淋巴细胞的分离方法

1、淋巴细胞的来源: 人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度,无论采用哪种方法,应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计,根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 2、密度梯度离心法: 外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075~1.092之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 3、实验方法: 1.采血,稀释(外周血:稀释液=1:2) 2.在离心管中加入Ficoll,沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血(Ficoll:稀释血=1:2) 3、20℃,1500r/min,离心30min 从上一次至下 稀释的血浆、血小板 PBMC Ficoll 红细胞、粒细胞 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤,1800 r/min离心10min ,弃上清。 6.重复洗涤一次,1400r/min离心10min,弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞,计数。

分离单个核细胞纯度为95% 淋巴细胞约占90%~95% 4、淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2~3次,常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下,若外周血中血小板数量异常增多,可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 (三)单核细胞和粒细胞的去除 1.粘附去除法 原理:单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点:简便易行,对细胞损伤极少。 缺点:B细胞也有较弱的粘附能力,因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后,大约95%的单个核细胞为淋巴细胞,活性大于95%。 2.羰基铁粉吞噬法 原理:单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力,吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一:经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后,则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二:用磁铁将细胞吸至管底,上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3.苯丙氨酸甲酯去除法 原理:苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质,能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸,导致溶酶体内因渗透压改变而破裂,释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 用该法可溶解含溶酶体的细胞,如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等,B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶,因而不受影响。 该法去除单核细胞后,约99%的单个核细胞为淋巴细胞,活性大于95%。

淋巴细胞分离液说明书

Lonza Walkersville, Inc. https://www.sodocs.net/doc/c56062833.html, biotechserv@https://www.sodocs.net/doc/c56062833.html, Tech Service: 800-521-0390 Document # INST-17-829-1 06/07 Walkersville, MD 21793-0127 USA ? 2007 Lonza Walkersville, Inc. Lymphocyte Separation Medium Instruction For Use 17-829E Introduction Lymphocyte Separation Medium (LSM) is a mixture of Ficoll? and sodium diatrizoate (Hypaque) with density adjusted to 1.077 g/ml. This sterile filtered product is intended for laboratory/manufacturing use, and is not for in vitro diagnostic use. It is commonly used to isolate lymphocytes from human blood. One protocol to accomplish this is presented here. Protocol 1. Anticoagulated blood (citrated or heparinized) should be used. Note: Always treat human and other primate source material as potentially infectious and take safety precautions. 2. Dilute blood 1:1 with calcium-magnesium-free PBS and layer 9 ml onto 6 ml LSM. Use a clear plastic centrifuge tube with a cap. For large volumes use a similar ratio of diluted blood to LSM. 3. Centrifuge at 400xg for 15 minutes. 4. Remove plasma-PBS without disturbing the interface. 5. Collect the interface with a cannula and dilute to 20 ml in serum-free medium, such as RPMI 1640. 6. Centrifuge at 70xg for 10 minutes. 7. Discard supernatant fluid and resuspend pellet in 2-3 ml serum-free medium. 8. Count nucleated cells on a hemocytometer or electronic counting device. 9. Lymphocytes will be concentrated at the interface, along with some platelets and monocytes. Granulocytes will be found mostly in the Lymphocyte Separation Medium and erythrocytes will pellet at the bottom of the tube. References 1. Boyum, A. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89. 2. Boyum, A. 1976. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 5:9-15. 3. Boyum, A. 1977. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology. 10-2:71-6. 4. Boyum, A. 1984. Separation of lymphocytes, granulocytes and monocytes from human blood using iodinated density gradient media. Methods Enzymol. 108:88-102. 5. Boyum, A. et al. 2002. Separation of Human Lymphocytes from Citrated Blood by Density Gradient (NycoPrep) Centrifugation: Monocyte Depletion Depending upon Activation of Membrane Potassium Channels. Scand. J. Immunol. 56-1:76-84. 6. Koistinen, P. 198 7. Human peripheral blood and bone marrow cell separation using density gradient centrifugation on Lymphoprep and Percoll in haematological diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 47-7:709-14. 7. Rola-Pleszczynski, M. and W.H. Churchill. 1978. Purification of human monocytes by continuous gradient sedimentation in ficoll. J. Immunol. Methods. 20:255-62. Product Use Statement THESE PRODUCTS ARE FOR RESEARCH USE ONLY. Not approved for human or veterinary use, for application to humans or animals, or for use in clinical or in vitro procedures. INST-17-829-1 06/07 Ficoll is a trademark of GE Healthcare. All other trademarks herein are marks of Lonza Group or its subsidiaries. 1

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用,试剂内容如下: 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液(赠品)清洗液(赠品)2010C11192010X1118F2013TBD F 液(赠品)说明书 【实验前准备】A .适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B .耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液,制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管,加入与组织单细胞悬液等量的分离液(注:分离液最少不得少于 3ml )。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上,400-500g ,离心20-30min 。(注: 根据组织单细胞悬液量确定离心条件,组织单细胞悬液量越大,离心力越大,离心时间越长,具体离心条件需客户自行摸索,以达到最佳分离效果)。

4.离心后,此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中,向离心管中加入 10ml清洗液(产品编号:2010X1118),混匀细胞。 6.250g,离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液(产品编号:2010X1118)重悬所得细胞。 9.250g,离心10min。 10.重复7、8、9,弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果,最 好在取样2h内进行实验,样品存放时间越长,细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质(如聚苯乙烯)的塑料制品,应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品,因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面,影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时,分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低,请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存,有效期2年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启封后置常温保存。如4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。 【参考值(参考范围)】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例,用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 (4.0-10.0)×109 含量(个/L)(4.0-5.5)×1012(1.0-3.0)×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞

原代小鼠肝细胞制备

细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基:William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L,双抗(GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL)5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松(中国药品生物制品检定所)5mg/L。 D-Hanks’液(CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解,NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存) 0.05%胶原酶Ⅳ溶液((Sigma C5138-1G) D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存)) PBS预灌流溶液(NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌,4℃保存) 鼠尾胶原(GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶)(0.05 mg/ mL)用0.02M 的醋酸稀释,临用现配) 0.02M 的醋酸:115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原(5 mg/ mL)用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel(BD 356237)(用William’s E Medium稀释,视具体批号而定稀释倍数,临用现配) Hanks’液(CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L,三蒸水溶解,NaHCO3调pH 7.2附近,4℃保存) 实验仪器 CO2 恒温培养箱(日本SANYO 公司); Sigma高速离心机; IX-51 型荧光倒置显微镜(日本尼康公司); DHL-A电脑恒流泵(上海青浦沪西仪器厂); 液相-质谱联用分析系统(LC/MS/MS)由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器,系统工作软件为XcaLibur(美国); Sigma5310离心机; ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)。 实验方法 实验准备

小鼠免疫细胞

免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取 一、实验目的 1、明确各免疫器官分布与形态结构,能熟练找到各免疫器官,弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。 2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法,熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。 二、实验原理 脾脏是外周免疫器官之一,是人体最大的淋巴器官。它生在腹腔左上方,质地比较脆,容易外伤。一般来讲,脾脏有三大功能: 首先它是人体的“血库”,当人体休息、安静时,它贮存血液,当处于运动、失血、缺氧等应激状态时,它又将血液排送到血循环中,以增加血容量; 其次,脾脏犹如一台“过滤器”,当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时,脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉; 此外,脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质,发挥免疫作用。脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板。因此,脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。脾脏还有产生淋巴细胞的功能。 我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。 小鼠淋巴细胞的比重为1.088,利用比重为1.088的淋巴细胞分离液,将脾细胞悬液置于分离液上层,通过梯度离心的方法,在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。 三、实验器材 KM种小鼠,PBS缓冲液,淋巴细胞分离液,200目不锈钢网,解剖器械 四、实验步骤 1、杀死老鼠,取出小鼠的脾脏,在pbs缓冲液中冲洗干净。 2、将小鼠脾脏至于200目铜网中,铜网绑定在烧杯上面,剪碎、碾磨,边碾磨边加PBS 冲洗,制得脾细胞悬液。 3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中,1000r/min 5min离心洗涤,倒掉上清,加入5mlPBS再离心洗涤一次。 4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮,缓慢加入淋巴细胞分离液上层,细胞悬液与分离液体体积比为1:1。 5、2000r/min离心30min。 6、小心吸取中间层细胞,1000r/min 5min离心洗涤两次。 7、将制得的淋巴细胞滴于玻片,镜检。

T淋巴细胞提取

淋巴细胞提取 一实验目的:小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象:B/C 小鼠 三实验器材: 1.试剂:淋巴细胞分离液、1640培养基 2.器材:无菌培养皿、200目尼龙网(裁成90mm*90mm正方形,灭菌)、10mL玻璃注射器内活塞(灭菌)、不同规格的镊子、剪刀若干(灭菌)、细胞实验常用器材(离心管、移液管、加样枪、离心机)、75%乙醇、烧杯(无菌)、大头针、超净台 四实验步骤: 1、断头处死小鼠,浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮,用大头针固定,再剪开小鼠腹腔,用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一,在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液(使用前摇匀淋巴细胞分离液)。用镊子固定尼龙网,然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏,使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。(没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内,防止在研磨过程中液体挥发,使得密度与渗透压改变,影响分离效果) 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中,离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟,注意离心设置较慢的加速度和减速度(如果有十档,一般设置在第三档)。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来,在1640覆盖层下面聚集,细胞分层如图二所示

6、析出淋巴细胞层,再加入10mL1640培养基,250g离心10分钟。倾倒上清液,加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬,细胞计数。 五、注意事项: ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基,既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集,又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚,2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠,需要注意两点:其一,每研磨一只小鼠,立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中,注意盖严管盖,切不可敞口放在超净台中。否则,液体挥发,密度与渗透压都会改变,严重影响分离效果。其二,在所有的小鼠脾脏处理完后,统一再加1640覆盖层。如果加早了,两层液体会相互扩散,造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛,以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏,由于镊子夹住脾脏的力度不好控制,易造成细胞死亡。

小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 陈素君 200900140007 实验目的:了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制 及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞,掌握细胞计数。 实验原理:细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体内进行培养,使其不断生长、繁殖,人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点,一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响,二是细胞培养便于人们对细胞内部结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术,但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官,经体外培养后,直到第一次传代为止。这种培养,首先用无菌操作的方法,从动物体内取出所需的组织(或器官),经消化,分散成单个游离的细胞,在人工培养的条件下,使其不断地生长及繁殖。 要细胞能在体外长期生长,必须满足基本要求:一是供给细胞存活所必须的条件,如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 台盘蓝氧化与还原型颜色不同,活细胞由于新陈代谢产生较强还原力,染色后呈无色,死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行,即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上(计菌器),于显微镜下直接观察计数。 细胞浓度(个/ml)=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。 实验用品: 一、器材 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好 倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板 二、试剂 PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝 三、小白鼠 实验方法: 1. 细胞的原代培养 1.1断头法处死小鼠,将血放掉洗净,在酒精中浸泡3min消毒。 1.2在超净工作台无菌操作,将小鼠背朝下放在解剖板上,用镊子提起腹部皮肤,剪开。沿 开口向两侧斜着剪开,翻起皮肤露出腹腔,即可看到白色的胃。提起胃,找到后面条状的脾,用弯头镊子取出脾,将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。 1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴,用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏,用针 头在脾脏上戳几个小孔,顺脾脏轻轻刮,从小孔挤出分散的细胞。 1.4将培养皿倾斜,使大块组织充分沉淀,吸取分散的细胞悬液2mL,1000r/min离心5min。

小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备: 1.采血用品:10ml注射器10个;手套20付;15ml离心管10个;20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把;加样器;70%酒精;5%碘酒; 2.取脾用品:10ml注射器10个;手术器械10套;手套20付,60mm玻璃培养皿10个; 200 目尼龙网,裁成100mm×100mm正方形10块;10mL 玻璃注射器内活塞10个; 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基;鼠淋巴细胞分离液;摄子、剪刀各10 把;70%酒精;5%碘酒;移液器、离心机;刀剪浸泡液(新洁尔灭); 注:红色必须灭菌;蓝色可以不灭菌;绿色需特殊处理;黑色不用灭菌。 二、相关实验: (一)实验名称:分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的:获得小鼠脾脏淋巴细胞,为ELISPOT实验做准备。 实验动物:BABALB/c小鼠;雌性 实验材料: 1.小鼠淋巴细胞分离液, 2.60mm玻璃培养皿 3.10mL 玻璃注射器内活塞,灭菌 4.气管切开包 5.5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6.1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠,浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮,用大头针固定,再剪开小鼠的腹腔,用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基,将小鼠脾脏放入培养皿中,用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液,注入小鼠脾脏,直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。(病毒室离心机) 6.吸出淋巴细胞层,加入5mL 1640培养基洗涤一次,1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液,加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬,细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。

原代细胞培养:原代肝细胞

【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官,也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院(包括协和医院、301医院、北三医院等),采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织,并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件,降低杂细胞(如脂肪细胞、纤维细胞等)的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代,然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测,可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验,嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务: 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外,嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外,嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务,为您的研究提供最新鲜优质的实验材料,提供其他原代细胞相关专业服务(原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等)。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务,是原代细胞分离,原代细胞提供,原代细胞实验课题服务中的佼佼者。

小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 实验背景: 一、细胞培养的基本条件: 1.无菌条件:净化工作室,风淋室,传递窗,高效过滤器,洁净层流罩,生物安全柜,超净工作台,紫外灯,电热干燥箱,滤器,高压灭菌器,抗生素 2.细胞生长条件:纯水蒸馏器,纯水仪,培养板,培养瓶,CO2培养箱,培养基,血清 3.细胞检测条件:倒置显微镜,酶标仪,微孔板震荡器,高速离心机,移液器 4.细胞保存条件:液氮罐 1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒,使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面,使工作台内构成无菌环境。 2.Zeiss滤器:过滤除菌:大多数培养用液,如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱: CO2培养箱设定的条件为37 ℃,5%CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题: ①用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒(90 ℃,14 h)。 ③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度,避免培养液 蒸发。 三、细胞培养用液的配制: 1.水:新鲜配置的三蒸水或去离子水 2.平衡盐溶液:无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS:NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3.消化液: ①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。 ②胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。 ③胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25%。用滤器过滤除菌。 ④胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。 ⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 4.培养基: 培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基: 天然培养基有血清、血浆和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 优点:营养成分丰富,培养效果好 缺点:来源受限,成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污

小鼠脾脏中分离淋巴细胞

小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 1小鼠断颈处死,酒精浸泡5分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏,提起,剪去周围结缔组织,放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 2另取无菌试管,先加入淋巴细胞分离液,然后将试管倾斜,略放平,吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中,一般分离液和细胞悬液的体积比为1:2,要轻要慢,不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟,20分钟。 3离心后取出试管,可以看到不同的分层,一般上面是非细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在另外无菌试管中,因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用,加入PBS 离心洗两遍(PBS1000转/分钟,10分钟)。 4,洗好的细胞加入1640培养液和20%的血清中重悬,缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放37度孵育一小时。一小时后取出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管(我们的柱子是用大号注射器做的),以HANKS液和血清先后缓慢冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到80%到90%,再次冲洗并且用力挤压,这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以1640加血清配制的培养液进一步培

养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分,如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。

2018年淋巴细胞分离

淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理: 外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料: 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液(生理盐水) RPMI1640粉末 实验设备:1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程: 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中,(每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释(外周血:稀释液=1:2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀) 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁,把稀释血缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面(Ficoll:稀释血=1:2) 5.放入离心机1500r/min离心20min(注:缓慢加速1-4档个3分钟)

6.用吸管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上体积的稀释液(生理盐水),1500rpm×10分钟离心,洗涤细胞。 7.重复洗涤一次,1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)= 4个大方格内细胞总数 ────────── × 104×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量,外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数: 实验流程: 1.准备计数板:

B淋巴细胞分离技术

B淋巴细胞分离技术 一、实验原理 膜表面免疫球蛋白(SmIg),是B细胞特有的表面标志,它既是B细胞识别抗原的受体,与相应抗原特异性结合;又是表面抗原,能与相应的抗Ig的抗体结合,故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检,以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg,所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM,以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合,并且这种反应也发生于膜表面的IgG,所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞,凡于FITCSPA结合的细胞,在荧光显微镜下,可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体,即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下: 二、实验材料 1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂,用时按要求稀释。 2 pH值72 Hank s液,含5%小牛血清。 3 淋巴细胞分层液,20℃时比重为1077±0002 4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片 三、实验步骤 1、取肝素抗凝血2ml,用Hank s液稀释1~2倍,轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中,2000~2500 r/min水平离心20~25min,获取淋巴细胞。 2、用pH值7.2Hanks液洗2次,最终配成细胞数为2~25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂,然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合,充分混匀后,放4℃冰箱30min。

MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书

MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途: 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液,达到特定比重,然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物(大鼠、小鼠等)单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌,即到即用,操作简易,分离出色,性能 稳定,细胞活性保证。 技术背景: 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞,采用Boyum(1968)的离心技术,可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容: 淋巴细胞分离液(200)毫升 产品说明书1份 产品特点: -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格

检测标准: 热源检测结果:<0.5EU∕ml 无菌检测结果:已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞,包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前,室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。(注:上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离,需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1.准备无菌的锥形离心管 2.加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1:1比例(如果全血样本粘稠,可适当增大比例)稀释抗凝过的全血样品。 3.小心沿着管壁,接近分离液层面,非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 (注意:切记不要搅浑淋巴细胞分离液) 4.小心放进台式离心机离心30分钟,速度为400g 5.小心取出离心管,切记不要震动 6.可见,最上层为淡红色透明血浆,其次为薄薄的致密白色环

小鼠肝细胞原代培养、灌注

小鼠肝细胞原代培养+灌注 我把我整理和收集战友的一些资料供你分享: 材料:小鼠 器具:饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器 试剂:DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS 准备:酒精擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。 操作步骤: 1、将小鼠断颈致死,置75%酒精泡2-3秒钟,取肝脏,置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 3、用手术剪将脏器剪成小块(1mm2),玻片研磨,转到离心管,离心1000rpm,5min。 4、视组织或细胞量加入5-6倍(3-5ml)胰酶,37℃中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。 5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。 6、用100目孔径滤网滤过,除去未消化的大组织块。 7、1000rpm,离心5分钟,弃上清液。 8、加入无血清培养液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。 9、加入含血清的培养液l-2 ml(视细胞量),血球计数板计数。 10、将细胞调整到5×105/ml左右,转移至6孔培养板中,37℃下培养。 肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件,现分别介绍如下,首先介绍原代肝细胞的分离。 目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下: 1: 供体肝脏的游离:选择Mercedes手术切口,即人字型切口,进入腹腔,暴露肝脏,分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带(为了便于手术,可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引,并向两侧移动,显露膈下空间),解剖肝十二指肠韧带,确认胆总管,应尽可能靠近远心端结扎(从十二指肠后面进行)。分离肝动脉,确认胃十二指肠动脉,并将其仔细结扎,但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程,直至脾动脉、胃左动脉显露, 结扎离断脾动脉、胃左动脉注射肝素100U。缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支,以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎,并于结扎线间将其离断,这样就可显露脾静脉与肠 远心端离断肝上下腔静脉,准备肝脏灌注。迅速切除肝脏,术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏,最终将肝脏在腹膜后切除,获取肝脏。之后行门静脉插管,准备行肝脏灌注,分离肝细胞。 2:灌注液的配置: Perfusion Solution 1(g/L): NaC L 8.000 NaH2PO4?2H2O 0.078 KC L 0.400 Na2HPO4?12H2O 0.151 NaHCO3 0.350 EDT A 0.190 HEPES 2.380 Gluc ose 0.900 磁力搅拌器使固体成分充分溶解,用1M HCL或1M NaOH调定pH 7.2~7.4(使用pH计),0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌,4℃保存,使用时液体温度维持在37℃(应用水浴箱)。 Perfusion Solution 2(g/L): NaC L 8.000

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术,为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA抗凝剂 常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂,能与血液中的钙离子结合成螯合物,而是钙离子失去凝血作用,从而阻止血液凝固 3.PBS缓冲液 PBS缓冲液一般作为溶剂,起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同,为中时作用的巴比妥类催眠药,作用时间可维持3~6小时,显效较快。用作催眠和麻醉前给药,亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。 5.其他实验材料:健康的小白鼠一只、注射器(1ml,10ml)1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管(5ml,10ml) 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异,利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心,使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带,从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层

图1 小鼠外周血离心前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂,使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛,将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中,取足1ml新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1) 4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓(一定要慢)加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中(稀释血液:分离液=1:1),沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上,并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心(1500r/min)15分钟,小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞,用PBS溶液洗涤两次,每次离心1800r/min,离心10min 7.弃上清液,加入4mlPBS待用

脾淋巴细胞分离

小鼠脾脏单个核细胞的分离 一、实验目的 1.熟悉细胞分离的基本原理 2.掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 3.掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法 二、实验原理 1.台盼蓝染色:正常的活细胞,胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内。丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失,即可认为细胞已经死亡。 2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形,脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞,特别是红细胞和血小板。 三、实验材料 小鼠 手术器械(剪刀、镊子)、酒精喷壶、杀鼠板 平皿,尼龙膜指套、研磨棒、 吸管、试管、EP管、移液器和tips PBS缓冲液、红细胞裂解液(ACK) 细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 8.显微镜 四、实验步骤 (一)取小鼠脾脏 1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头,另一只手抓住鼠尾,用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼,造成脊髓与脑髓断离。 2.取其后右侧卧位,消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。 (二)制备单个核细胞悬液: 1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中,然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使 单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中; 2.吸取平皿中细胞悬液(再次用尼龙指套过滤)置于刻度离心管中,加PBS缓冲液(可冲 洗培养皿)至10mL,以1500rpm离心5min。弃去上清,弹散细胞沉淀,加ACK2ml,轻轻吹打混匀并放置3-4min,以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml,以1500rpm离心5min; 3.弃去上清,弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬 液。(放置冰上) 4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定(建议5倍稀释) 5.以1500rpm离心5min,根据计数结果稀释到合适的浓度 a)注:减少操作的时间,并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力 (三)计算细胞浓度 1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释;(建议5倍稀释)。 2.混匀稀释后,取1滴加至细胞计数板中,计数细胞计数板中4大方格细胞总数; 3.细胞计数:细胞浓度(个/mL)=平均每个大方格中细胞数(4个大方格细胞总数/4)

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