H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书
H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒
（PCR-荧光探针法）说明书
【产品名称】通用名称：H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
英文名称：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)
【包装规格】大包装，48反应/盒
【预期用途】
流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（NA）的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9流感病毒既可以感染禽类，也可以感染人。人感染H7N9禽流感会出现严重肺炎，症状包括发烧、咳嗽、呼吸困难等。
本试剂盒适用于检测呼吸道样本、血清、肺组织等样本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。检测结果仅供研究，不用于临床诊断。
【检验原理】
本试剂盒基于实时荧光PCR技术，分别选取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，通过一步法实时荧光PCR体系扩增对H7N9禽流感病毒进行定性检测。反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外，还配以对应的PCR反应Buffer、逆转录酶、
Hot-Start Taq酶、核苷酸单体（dNTPs）、Mg2+等成分，可实现对H7N9禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。
【主要组成成分】
【储存条件及有效期】保存于-20〒5℃，反复冻融次数＜5次，有效期9个月。
【适用仪器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR 仪。
【样本要求】
1 适用样本类型：呼吸道样本、血清、肺组织。
2 样品采集、保存与运送。
标本采集、保存、运送请遵循《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。
【检验方法】
1.核酸提取
建议取200μl液态样本进行核酸提取；组织样本可以研磨液进行提取操作。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每200μl样本中加入4μl内标溶液后进行核酸提取。
本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；AIV H7N9阳性质控品不参与提取，用于PCR检测试剂的质控。
2.PCR扩增（ABI 7500仪器操作为例，ABI 7300、LC480等仪器参照此操作及仪器操作手册）
2.1分别配制AIV H7 RT-PCR反应体系和AIV N9 RT-PCR反应体系
2.1.1 AIV H7 RT-PCR反应体系配制
取适量PCR反应管（按AIV H7反应体系计算）；每管加入AIV H7 PCR 反应液A 17μl、AIV H7N9 PCR反应液B 3μl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20μl于单个PCR反应管中）。
2.1.2 AIV N9 RT-PCR反应体系配制
取适量PCR反应管（按AIV N9反应体系计算）；每管加入AIV N9 PCR 反应液A 17μl、AIV H7N9 PCR反应液B 3μl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20μl于单个PCR反应管中）。
2.2 于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、AIV H7N9阳性质控品、待测标本核酸各5μl，8,000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。
2.3探针检测模式设臵为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反应条件设臵为：50℃ 15min，1个循环；95℃ 15分钟，1个循环；94℃15秒→58℃ 45秒（收集荧光），45个循环。保存文件，运行。
3.结果分析
3.1 反应结束后保存检测数据文件。
3.2 分析条件设臵：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop 值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
【质量控制】
阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期；
阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线 Ct值≤32；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【结果判定】
1.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系FAM检测通道均无扩增曲线或Ct值＞40，且在VIC检测通道均有对数增长期，可判样品为H7N9禽流感病毒阴性；
2.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM,VIC 检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤40；可判样品为H7N9禽流感病毒阳性；
3.如果检测样品的AIV H7或N9 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；若重复检测结果为H7及N9均阳性，则判H7N9禽流感病毒阳性；若重复检测结果仍为H7（或N9）阳性，则只能判禽流感病毒H7（或N9）亚型阳性，并建议以其他方法做进一步确认。
【检测方法的局限性】
1.样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关。
2.样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
3.病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果。
4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取试剂进行样本处理时核酸提取效率存在一定差异，本试剂盒推荐使用本公司生产的核酸提取试剂盒（离心柱法），用户可根据具体要求进行选择确认。
5.本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段.
【产品性能指标】
根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的分析灵敏度为 1.0〓103copies/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体（甲型流感病毒H3亚型、甲型流感病毒H1亚型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亚型病毒、禽流感H9亚型病毒等）无交叉反应。
【注意事项】
1.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
2.为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
3.试剂使用前要完全解冻，8,000rpm离心数秒后使用；
4.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
5.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器；
6.本试剂盒内阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
【生产企业】企业名称：中山大学达安基因股份有限公司
生产地址：广州市高新技术产业开发区香山路19号；广州市高新技术产业开发区荔枝山路6号
邮编：510665
电话：020-********、8008304008
传真：020-********
网址：https://www.sodocs.net/doc/d7867464.html,
【医疗器械生产企业许可证编号】粤食药监械生产许20040999号
附件2
人感染H7N9禽流感病毒核酸检测
实验室生物安全保障基本要求
为加强人感染H7N9禽流感病毒核酸检测规范化管理，做好实验室生物安全管理工作，根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424号令，以下简称《管理条例》）、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部45号令，以下简称《管理规定》）等有关要求，制定本标准。供医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测时参考使用。
一、样本采集
（一）进行人感染H7N9禽流感病毒相关样本（以下简称“样本”）采集的操作人员必须经过生物安全培训合格，并具备相应的操作技能。
（二）样本采集过程中，操作人员要加强防护，应当穿戴防护服、眼罩、N95及以上水平的医用防护口罩、双层医用乳胶手套、帽子等个体防护装备。
（三）用于样本采集的主容器必须采用优质塑料材质，且大小适合、带螺旋盖、内有垫圈、无菌、耐冷冻的密闭容器。样本采集后，主容器盖必须盖严、拧紧，表面应当擦拭消毒。
（四）对诊疗过程中采集的各种临床样本，医疗机构应当加强生物安全管理，在进行动态风险沟通与评估基础上，采取样本登记造册、专库存放、专人负责以及必要的消毒处理等较严格的安全及安保管理措施。
（五）样本采集过程中产生的医疗废物要分类收集，应当在产生地点进行压力蒸汽灭菌或可靠的化学消毒，然后按感染性、损伤性等医疗废物收集处臵。
二、样本包装和运输
（一）负责样本包装和运输的人员应当经过感染性物质包装、运输相关的生物安全培训，并取得相应资格。
（二）运输样本必须采取三层包装系统，由内到外分别为主容器、辅助容器和外包装。
病毒培养物按照A类感染性物质进行包装运输，其他感染性物质按照B类感染性物质进行包装运输。
容器或包装材料应当达到国际民航组织《危险物品航空安全运输技术细则》相应包装标准，符合防水、防破损、防外泄、耐高温、耐高压的要求。
（三）样本包装过程中，操作人员要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款的相关要求采取加强防护。
（四）操作人员应当规范包装检测样本：
1.应当在实验室核心操作区内对装有样本的主容器外表面进行仔细检查并擦拭消毒，确保无泄漏、表面无残留物，并在外表面标明样本编号、种类、姓名及采样日期等信息。用足够的吸收材料包裹主容器，然后放入辅助容器，拧紧（A类）或封严（B类）辅助容器，必要时消毒辅助容器外表面。若多个主容器装入同一个辅助容器时，必须分别包裹，防止彼此接触，并在多个主容器外面衬以足够的吸收材料。
2.应在实验室清洁区采用适当的衬垫材料将辅助容器固定在贴有统一标识的外包装箱内，冰排或制冷器件应放在辅助容器和外包装之间。样本送检单、样本接收证明、准运证书、运送人员资质证明、发送和接收人员信息等相关文件材料应当放入防水的塑料袋中，臵于外包装箱内上方。
（五）样本运输前应当联系接收机构实验室，告知样本送检目的、样本种类、数量和预计送达的时间等。
（六）负责运输样本的医疗卫生机构，应当按照《管理规定》有关要求，向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心申请办理《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。在每次运输结束后，运输单位须将运输情况向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心书面报告。
（七）包装合格的样本（三层包装系统）可通过航空或陆路运输。陆路运输应专车运输，并由2名或以上经培训合格的人员护送。运输途中样本主容器应始终保持直立，运输车辆内应携带具备清单及有效物品的应急处臵箱（包），其中包括个体防护装备、感染性材料溢洒处臵器具、皮肤及创口处臵器具、医疗废物收集器具以及“生物危险”、“禁止通过”等警示标识。有关单位或者个人不得通过公共电（汽）车和城市铁路运输相关样本。
三、样本接收和包装开启
（一）负责样本接收与包装开启的操作人员应具备相应的操作技能，通过生物安全培训并取得相应资质。
（二）样本包装的开启应在生物安全二级及以上级别的实验室进行。样本送检单、准运证书、人员上岗证等相关文件材料的核查、登记，以及相关风险沟通/评估和开具样本接收证明等工作应在实验室清洁区内进行。
（三）包装开启过程中，操作者要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款相关要求适时加强防护。
（四）实验室操作人员应规范接收检测样本、开启包装：
1.操作人员应当在生物安全柜内开启三层包装系统的第二层辅助容器，并仔细检查主容器表面有否破损、泄漏或残留物，发现异常情况应当立即执行实验室应急处臵程序，同时登记并报告实验室负责人。
2.操作者应当在生物安全柜内消毒主容器表面，核对样本信息，进行下一步的实验室检测活动，或转移至指定的保存/保藏地点及位臵。
（五）包装开启和样本核查结束后，应当在实验室清洁区完成交接手续，开具样本接收证明，交还外包装和辅助容器等。实验室操作人员应对所有异常情况进行详细记录，运输和接受样本的双方人员签字确认。
四、样本分装和检测
（一）负责样本分装、检测的操作人员应当具备人感染H7N9禽流感病毒相应的实验操作能力，经过生物安全培训，并取得培训合格资质。
（二）实验室用于人感染H7N9禽流感病毒检测的设备、设施必须运行良好，生物安全柜和压力蒸汽灭菌器应当年检合格。
（三）在生物安全二级实验室从事相关实验活动时，操作人员应当配戴眼罩、N95及以上水平的医学防护口罩，穿戴防护服、双层乳胶手套等个体防护装备。
（四）实验室生物安全等级要求：
1.疑似病例未经培养的临床样本应当在生物安全二级实验室的生物安全柜内分装、灭活和核酸提取。
2.人感染H7N9禽流感病毒的分离培养应当在生物安全三级实验室进行。
3.动物感染实验应当在动物生物安全三级实验室进行。
（五）开展人感染H7N9禽流感病毒相关实验活动时，应当有２名以上的操作人员共同进行。
（六）实验过程中产生的医疗废物要分类收集，应在产生地点进行消毒灭菌，然后按医疗废物收集处臵。
五、样本保存和销毁
（一）各医疗机构应当将阳性样本按照要求集中专库保存。
（二）阳性样本、分离物的保存及销毁应当按照《管理条例》等法规和规范性文件有关要求执行。
核酸检验基本技术
第六章核酸检验基本技术 第一节分子生物学基本知识 一、DNA和RNA DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。 DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。 在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。 DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。 它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。 因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。 在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。 DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。 RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。 RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。 二、DNA的复制和修复 细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。 DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。 在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。 DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。 在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。 在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。 在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。 该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SⅠ核酸酶。 逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。 三、转录 在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。 它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。 合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其σ亚基有启动子作用。 四、翻译 再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。 构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。 4种核苷酸排列组成遗传信息，很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序，遗传信息的这种转换称为翻译。 3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。 元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。 在核糖体上，有2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用 输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。 1. NAT在血液筛检中的必要性 酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV 的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。 NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。 2. NAT检测的技术方法 1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT 的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。 2.1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。 目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,
核酸探针技术在食品检测中的应用
科目：食品生物技术导论 学院：化学生物与材料科学学院专业：生物技术 班级：090551 学号：09055106 姓名：黄菁
核酸探针技术在食品检测中的应用 摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备方法以及在食品检测中的应用及发展方向。 关键词：食品检测核酸探针基因工程 The nucleic acid probe of the application of the technique in food testing Abstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of introduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in food testing and development direction. Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering 正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义 食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。 生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。 生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。 二、核酸探针技术 化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互
核酸探针技术 - 副本
核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。 (一) 核酸探针的种类 1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。 将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用 2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。 目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。 (二) 核酸探针的标记 1.放射性同位素标记法常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。 切口平移法(nick translation)是利用大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下： (1) 取1?g DNA溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液( 0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL 牛血清白蛋白)，加入除标记物(如?-32 p-dATP)外的其它三种dNTP(如dCTP，dGTP，dTTP)溶液，20mmol/L溶液各1?l。 (2) 加入100?ci(10?l)标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l,混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l(约5单位)E.coli DNA polymerase I，混
核酸探针技术在病原微生物检测中的
简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用 核酸探针技术及在病原细菌检测中的应用 随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于病原微生物的检测。 核酸探针是将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子就称为核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA 探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli。选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。 1 核酸探针的特点： 1.1探针的特异性核酸探针检测技术的最大特点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。检测这种物质受多种因素影响。比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。而核酸探针检测的基因本身，它能识别基因本身的变异，不受基因表达产物的影响。常规免疫学方法检测抗原、抗体，他们都是蛋白质，这些蛋白质由氨基酸组成，而氨基酸由核苷酸序列确定，一旦这种序列受外界影响发生变异，就会导致其产物的变化，影响抗原抗体间的反应，使检测特异性下降。检测病毒主要通过组织培养后，检测病毒相关的蛋白质囊膜，即使采用超低温保存，有时也会引起编码蛋白质囊膜基因的变化，而采取DNA探针检测病毒则不用改变其蛋白质结构，而只需检测是否有相应特异性的编码蛋白质囊膜的病毒靶DNA 序列。另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管看来形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（100℃）、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏作用，所以用比提取蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然RNA探针除外，因为RNA不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用RNA。核酸探针的特异性取决于探针的碱基序列和使用条件，如在不严格条件下（低温高盐）探针与靶DNA误交结合力比严格条件下稳定。探针长度也会影响反应的特异性，一般加Formamide增加反应特异性。 1.2 探针的敏感性研制核酸探针是为了检测出单个病毒和细菌。DNA探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32P标记物通常可检出10－8摩尔特异DNA片段，相当于0.5pg，1000个碱基对的靶系列，相当于1000－10000个细菌。用亲和素标记探针检测1小时培养物DNA含量在110pg，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到1ng的水平。延长培
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用 基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。 一、核酸探针技术的原理 DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。 核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。 二、核酸探针技术的基本方法 被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。探针亦可用3H标记，最后用液闪计数器计致。还可用生物素，抗生物素等标记，最后用酶标法显色，均能得到满意效果。 1 核酸探针的制备 核酸探针可分为DNA探针、CDNA探针、RNA探针和寡糖核苷酸探针，因其种类不同制备方法也不同。 1．1 DNA探针 DNA探针可分为基因探针和基因片段探针。全基因组基因探针的制备最简单，只要将染色体DNA分离纯化，然后进行标记即可。基因片段探针则需要将染色体DNA用限制性内切酶酶解，得到许多随机片段，然后与质粒重组，转化大肠杆菌(E·coli)，筛选含特异目的基因片段的克隆株进行扩增，再提取基因片段作探针。 1．2 CDNA探针 通过提取纯度较高的相应mRNA或正链RNA病毒的RNA，反转录成CDNA作为探针。也可以进一步克隆在大肠杆菌中进行无性繁殖，再从重组质粒中提取CDNA作探针。 1．3 RNA探针 有些双链RNA病毒的基因组在标记后，可直接用作探针。另一种是从CDNA 衍生而来的
核酸杂交检测技术
核酸杂交检测技术 核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一,近年来正逐渐用于病毒病的特异、敏感和快速诊断。杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号, 则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。待测的病毒核酸可以从病料中提取,也可以从纯化的病毒粒子提取。提取后可在膜上与探针杂交(固相杂交)。或直接在试管的杂交液中杂交(液相杂交),此外, 也可直接在组织切片或细胞涂片上对细胞中的病毒核酸进行杂交(原位杂交)。下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病毒诊断的几种杂交方法。(一) 建立杂交体系核酸杂交是多种环境因素与二条互补核酸链综合作用的结果,它有较高的技术要求。了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系,获得理想结果的基础。1、温度杂交反应中,双链核酸的变性与复性主要是温度控制的。选择适当的杂交和洗膜温度是实验成败最关键的因素之一。杂交反应通常在低于解链温度(T m值)15～25℃的条件下进行。T m值受核酸链组成 (G+C) 、溶液的离子强度、pH值及反应体系是否含变性剂等的影响。在杂交体系不含变性剂的情况下,DNA 之间的杂交反应通常在68℃进行,当含50%变性剂甲酰胺, 则在42℃进行。2、pH值杂交体系的pH在5～9的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在pH6 5 ～ 75之间进行。较高的pH值产生更严格的杂交条件。 3、盐离子浓度体系中往往加入单价离子的盐,因为单价阳离子与核酸链上的磷酸基团发生静电反应,所以能降低核酸链之间的静电排斥,维持双链DNA的稳定性。盐浓度增加,稳定性提高。杂交体系中通常采用6倍SSC(1倍SSC为015 mol/L NaCl和0015mol/L柠檬酸钠，pH70)缓冲液。 4、变性剂杂交体系中加入变性剂可降低T m值,所以杂交可在更低的温度下进行。常用变性剂是甲酰胺。 5、DNA浓度浓度愈高,复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针,还应尽量减少杂交体积,一般每百cm2滤膜用25ml杂交液。 6、探针长度溶液中DNA复性率与片段长度的平方根成正比。所以用长的探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针,以减少探针进入细胞并扩散到靶核酸的阻力。 7、硫酸葡聚糖在水溶液中,此化合物表面可吸附DNA 探针分子,从而浓缩探针,促进二条核酸链间的缔合。其10%的浓度可提高杂交速度10～100倍。使用硫酸葡聚糖可能导致背景加深,所以一般在探针浓度过低的情况下才使用。 8、杂交时间它受探针的长度与浓度、反应体积等因素的影响,较短的探针、较高的探针浓度和较小的杂交体积,需要较短的杂交时间。一般来说,杂交时间通常在2～16小时。 9、预杂交在杂交前进行预杂交,封闭非特异的DNA结合位点,降低非特异杂交,是杂交的
基于CRISPR的核酸检测技术SHERLOCK
基于CRISPR的核酸检测技术——SHERLOCK CRISPR/Cas技术以出众的基因编辑能力闻名于世，但显然这技术应用范围绝不仅限于基因编辑。CRISPR/Cas技术的大牛Jennifer Doudna教授早在2016年就将该技术应用于RNA检测，只是由于灵敏度太低而缺乏应用价值。随后张锋利用Cas13蛋白的天然RNase活性将其改进，使之有了实际应用价值，并将其取名为SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），并且开发了升级版的SHERLOCK v2。后来Jennifer Doudna的实验室利用Cas12a的非特异性ssDNA降解能力开发出另一种称为DETECTR的方法。 SHERLOCK的原理 SHERLOCK的核心是一种叫做Cas13的CRISPR相关蛋白。Cas13包含四个不同的家族成员（Cas13a-d），是一种RNA引导的RNase，靶向RNA的单链区域，在具有特定碱基的靶RNA区域产生多个切割位点。Cas13表现出靶依赖性的混杂RNA酶活性，导致旁观RNA分子的反式切割，这种效应被称为“collateral activity （附带活性）”。研究人员利用这一“脱靶缺陷”，加入一种可淬灭的荧光RNA，当荧光RNA被切开时，会发出荧光信号而显示检测结果。最近发现其它类型CRISPR-Cas系统的Cas酶也显示collateral activity ，如Cas12的亚家族。尽管Cas13具有称为原间隔物侧翼位点（PFS）的PAM样序列基序，仅对某些目标位点有活性，但是许多非常活跃的Cas13直系同源物，例如LwaCas13a，不显示PFS。
核酸检验基本技术
第六章 第一节分子生物学基本知识 一、DNA禾口RNA DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。 DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。 在动植物、细菌和真菌中都含有DNA,但在病毒中不一定含DNA DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。 它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后0D值会升高。 因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。 在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。 DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。 RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递 作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。 RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。 二、DNA的复制和修复 细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。 DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。 在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。 DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。
在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。 在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。 在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶I,而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶II。 该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括S I 核酸酶。 逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。 三、转录 在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。 它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。 合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其°亚基有启动子作用。 四、翻译 再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。 构成核糖体骨架的是rRNA而mRNA直接决定蛋白质的结构。 4 种核苷酸排列组成遗传信息,很撑蛋白质时转换成20 种氨基酸的排列顺序,遗传信息的这种转换称为翻译。 3 个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一 种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位