科研论文格式与范文1

科研论文格式与范文1

自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究发表时间：2009-6-5 14:45:50 浏览次数：174 来源：中国创新医学网推荐

蔡文君，谭长强，李玉瑾，黄和，李霜

南京医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科暨耳鼻咽喉科学研究室，江苏南京 210029；南京工业大学生物

化学中心，江苏南京 210009

【摘要】目的：研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的Fas配体（Fas Ligand，即FasL）基因和白细胞介素10（即IL10）基因治疗实验性自身免疫性感音神经性聋。方法：采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型28只，按配对设计将其分为4组，通过鼓阶微量注射的方式，A组注入携带FasL基因的腺病毒（Ad FasL），B组注入携带IL10基因的腺病毒（Ad IL10），C 组单纯注入腺病毒（携带绿色荧光蛋白，即Ad GFP），D组注入等量的磷酸盐缓冲液。基因导入7 d后行听觉脑干诱发电位（ABR）测试，后取颞骨制作石蜡切片并行HE染色和光镜观察，每组各取两耳行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察。每组各取3只（6耳）行免疫荧光和酶免疫组织化学试验，以检测基因产物表达和腺病毒转染情况。结果：免疫组织化学显示携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞，并产生相应的蛋白产物（IL10和FasL）。ABRⅢ波阈值的均值对比结果显示，A组和B组明显低于C组和D组。内耳组织的免疫炎性反应亦明显较C组减轻。结论：重组复制缺陷型腺病毒可以携带目的基因转导入内耳，并在内耳表达基因产物，其抑制炎症反应的作用可有效地减轻自身免疫性感音神经性聋的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍，有望成为治疗自身免疫性感音神经性聋新的方法和途径。

【关键词】基因治疗；自身免疫性感音神经性聋；豚鼠

1979年McCabe依据其临床发现，即18例听力障碍患者经过免疫抑制治疗后听力有明显改善，提出了自身免疫性感音神经性聋(autoimmune sensorineural hearing loss，ASNHL)的概念。之后的进一步研究发现，自身免疫性损害不仅可累及耳蜗，还可波及前庭，故又提出了自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease，AIED）［12］概念。目前ASNHL的病因和发病机制尚不十分清楚，临床缺乏特异性诊断方法，对于ASNHL患者的治疗亦存在着一些问题，主要是采用皮质激素或免疫抑制剂治疗，虽然疗效较快、较好，但该类药物毒副作用多，而且还存在停药后复发率较高等问题。

近年来随着分子生物学研究的深入和基因工程技术的进展，基因治疗已成为许多相关疾病治疗研究方面的热点和新希望。基因治疗是根据特定的治疗目的基因将DNA导入到宿主细胞中并在其中表达。1996年Lalwani等［34］报道了将基因导入动物内耳，以后关于内耳的基因治疗成为一个热点，并在载体选择、导入方法和安全性评估等方面取得了很大的进步。基因工程技术已能构建特异性载体，可携带治疗基因导入动物耳内，在动物内耳获得高效表达［4］，产生具有高度生物活性的稳定的基因产物，并且不产生病毒相关的耳毒性反应，这为基因治疗感音神经性聋提供了生物学证据。

目前因为复制缺陷性腺病毒载体具有病毒滴度高、转染效率高（100%）、宿主细胞范围广、外源基因容量大、稳定和无插入突变危险等特点，已经成为基因转导研究中应用最多的载体之一。Yagi等［5］将腺病毒携带的GDNF基因从圆窗膜注射入鼓阶，GDNF基因在蜗内得到表达并发挥作用。

基于上述研究状况和现有研究工作基础，本项目组拟将利用基因治疗的独特性和内耳可行局部治疗的独特解剖特点，对自身免疫性感音神经性聋模型动物进行内耳免疫抑制或调节基因的试验性治疗研究，以探讨其治疗效果和可能发生的副反应情况。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康成熟豚鼠，白色红目，体重300 g左右，耳廓反应正常，耳镜检查排除中耳疾患，所有动物均由片后常规脱蜡至水，在倒置荧光显微镜下观察和摄片。

1.9.3 酶免疫组织化学试验按上述方法获得切片，用胰酶（0.2%）修复抗原，余具体步骤：正常山羊血清封闭10 min,加PBS稀释的第一抗体（A组加入兔抗鼠FASL，B组加入兔抗鼠IL10，C、D组加入兔抗鼠FASL和兔抗鼠IL10两种抗体），4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次，加入HRP标记的SPA作为二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，DAB染色，封片剂封片，光学显微镜观察摄片。以上试剂均购买自武汉博士德生物工程有限公司。

1.10 内耳透射电镜观察

各组听觉试验后各取1只豚鼠，麻醉后断头，迅速取出颞骨，经固定后取出全内耳膜迷路（螺旋韧带、血管纹），后固定、脱水、浸透、树脂定向包埋，聚合后修整包埋块，超薄切片，染色后透射电镜观察摄片。

2 结果

2.1 特异性免疫反应试验结果

见表1。结果显示：与免疫前相比，各实验组和对照组免疫后抗体水平均明显升高，差异有显著性（配对t检验，P＜0.05）。免疫前和免疫后的各组间对比，未显示有显著性差异（配对t检验，P＞0.05）。表1 各组血清中针对CIEAgs特异性抗体水平

2.2 听觉功能

以ARB的Ⅲ波反应阈作为评定听力水平的指标，结果见表2。与免疫前相比，免疫后各组ABR平均阈值升高，差异均有显著性（t检验，P＜0.05）。与内耳抗原免疫后相比，A组和B组内耳局部基因治疗后ABR 平均阈值降低，差异亦均有显著性（t检验，P＜0.05）；A组平均阈值降低更为明显，但与B组相比差异无显著性（t检验，P﹥0.05）。C组和D组内耳局部给药前后对比，差异无显著性。各组内同期左右耳对比差异均无显著性（t检验，P﹥0.05）。A组和B组分别以其免疫后的ABR平均阈值减2倍标准差作为判断治疗后听觉功能改善标准，A组有3只（5耳）、B组有2只（3耳）经局部基因治疗后听觉功能明显提高，治疗有效率分别为35.71%（5耳/14耳）和23.08%（3耳/13耳），B组1耳并发感染不计。同样分别以C组和D组免疫后的ABR平均阈值减2倍标准差作为判断治疗后听觉功能改善标准，内耳局部给药后，未发现有明显听力功能提高耳。表2 各组ABR测试结果

2.3 内耳光镜观察结果

见图1。C组和D组出现较为显著的内耳组织炎症反应，包括：出现Rosenthal管中炎症细胞（以单个细胞为主）浸润，螺旋神经节细胞变少，耳蜗顶回骨壁内及血管纹有散在的黄色含铁血黄素颗粒，部分动物蜗管或鼓阶内可见絮状物沉积，蜗管内出现“漂浮细胞”。Corti器和血管纹未见明显异常。A组和B组的炎症反应明显较C组和D组为轻，尤其是听觉功能改善耳，仅在蜗轴血管周围有部分单个核细胞浸润，但螺旋神经节细胞数基本正常，Corti器和血管纹未见明显异常。鼓阶内见部分絮状物，但未见“漂浮细胞”。

2.4 免疫组织化学试验

2.4.1 免疫荧光试验见图2。结果显示：C组见明显荧光显示的部位主要分布于耳蜗骨壁、骨螺旋板的蜗管内唇部、螺旋韧带和血管纹等部位。

2.4.2 酶免疫组织化学见图3。结果显示：A组主要显色反应（即FASL表达）部位包括螺旋神经节、Corti器、血管纹、蜗轴小血管周围、耳蜗骨壁以及壶腹嵴等。B组主要显色反应（即IL10表达）部位包括血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节以及耳蜗的骨壁。C组和D组仅在螺旋神经节和耳蜗骨壁有较弱的显色。

2.5 透射电镜摄片结果

各组显示均未出现特殊的细胞和细胞内结构的病理变化，仅见C组的1耳血管纹上皮细胞内部分线粒体肿胀（图4）。

3 讨论

目前ASNHL的发病机制尚不完全清楚，但对许多自身免疫性疾病的发生和病理变化研究中发现，部分细胞因子起着重要作用。已有实验表明,IL10等免疫调节分子在自身免疫性疾病的预防和类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎及自身免疫性眼葡萄膜炎等动物模型的基因治疗中取得了良好的效果［78］。我们已成功构建了ASNHL的动物模型［9］，本项实验研究采用豚鼠的同种内耳抗原免疫后，成功地造成部分实验动物出现感音神经性聋和血清特异性抗体水平升高，即制成了ASNHL动物模型。再将重组腺病毒携带免疫调节分子基因（即抗炎症分子的基因Ad IL10）和干扰自身免疫反应信号传递过程并可导致细胞程序性死亡的分子基因（即调控细胞凋亡分子的基因Ad FasL）采用鼓阶注射的方法导入豚鼠内耳，并于导入后7 d测试实验动物的听觉功能、内耳组织中病毒转染和导入基因产物的表达情况。结果显示ASNHL 实验动物经内耳局部注射携带免疫调节基因的重组腺病毒后，部分实验动物的听觉功能明显提高，即ABRⅢ

波阈值降低，组间阈值的均值对比，均较对照组有显著性差异。耳蜗病理组织形态学观察发现两个实验组动物的内耳免疫炎性反应亦较对照组动物为轻，仅见部分实验动物出现蜗管内絮状物，未出现螺旋神经节细胞数量变化，Corti器和血管纹形态基本正常，从而提示内耳局部的免疫调节基因治疗具有较好的效果，即调节和抑制了由于自身免疫所造成的内耳炎性反应和损伤，进而逆转和提高了听觉功能。

内耳免疫组织化学试验结果显示，重组腺病毒可以成功转染豚鼠内耳，主要分布于耳蜗骨壁、骨螺旋板的蜗管内唇部、螺旋韧带和血管纹等部位。FasL基因表达产物主要分布于螺旋神经节、Corti器、血管纹、蜗轴小血管周围、耳蜗骨壁以及壶腹嵴等部位。IL10基因产物主要分布于血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节以及耳蜗的骨壁。基因产物表达于壳子、耳蜗血管纹、螺旋韧带、Corti器、小血管周围。单一鼓阶内的一点注射可以较为广泛地分布于内耳各部位组织中，依据内耳解剖学和组织学特点，我们推测可能有3个途径使腺病毒从鼓阶分布到蜗管：（1）通过骨螺旋板下层中的小孔与鼓阶的外淋巴液相交通；（2）通过蜗神经纤维穿过的细孔与鼓阶的外淋巴液相交通；（3）鼓阶和前庭阶在顶回以蜗孔相交通，蜗管中的内淋巴液通过前庭膜与外淋巴液相交通。具体实际情况有待进一步研究和探明。

另一有趣的现象是两个实验治疗组的动物免疫组织化学试验结果显示，在耳蜗的骨壁均有显著的病毒转染和免疫调节基因产物的表达，具体机制尚不清楚。依据本组在以往实验研究中的发现，即同种内耳组织抗原免疫豚鼠后，部分实验动物的耳蜗骨壁内出现明显的炎性病灶［10］（与骨硬化症的病变极为相似，从而支持该病的自身免疫性病因学假说），此次基因治疗的方法对于自身免疫性耳硬化症是否能发挥一定的治疗效果，有待进一步研究证实。

此次实验研究中，我们对于一组ASNHL的实验动物鼓阶内单纯注射腺病毒后，结果显示听觉功能无显著变化，内耳病理形态学改变与内耳局部注射缓冲液的对照组相似，即提示腺病毒对于ASNHL治疗无显著效果，但亦未造成进一步损伤。

【参考文献】

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