多肽固相合成相关知识-博士精华之作

1. 多肽简介及化学合成多肽原理

蛋白质的基本结构单位是氨基酸，由20种氨基酸组成的各种各样的蛋白质。每个氨基酸分子（脯氨酸除外）alpha碳原子上都结合一个-NH2、一个-COOH、一个氢原子，和一个各不相同的-R。肽键是蛋白质分子中氨基酸间的主要连接方式，是一个alpha-NH2和一个alpha-COOH脱水缩合而成的酰胺键。一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽（peptide），由 2 个氨基酸缩合形成的肽叫二肽，由 3 个氨基酸缩合形成的肽叫三肽，少于10 个氨基酸的肽称为寡肽，由10个以上氨基酸形成的肽叫多肽，如下图。因此蛋白质的结构就是多肽链结构。每个肽在其一端有一自由氨基，称为氨基端或N-末端，在另一端有一自由羧基，称为羧基端或C-末端。

N R

2

n+

1

O

N

R

2

n+

2

O

OQ

1. 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去除氨基的保护基团。

2. 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。

3. 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。

固相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去，即缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合，最后达到所需要合成的肽链长度。

固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。

3.树脂的选择及氨基酸的固定

将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。

用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC 或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。

4.氨基、羧基、侧链的保护及脱除

要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用苄氧羰基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2

或哌啶-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。

固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT 或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。

裂解及合成肽链的纯化。BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，Fmoc 法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和、副反应较少。

5.实例

例如合成H2N-Gly-Gly-Gly-Cys-Ser-Asp-Tyr-Asn-His-His-Trp-Cys-COOH 1、树脂的选择及活化处理

取二氯树脂1.5g 加入到用DCM 浸泡过的反应柱中, 用DCM 15 mL 浸泡30 min 使树脂充分膨胀, 以活化待用。

2、第一个氨基酸的连接

称取Fmoc-Cys(Acm)-OH 0.31 g(依据为: 树脂量×取代度×氨基酸分子量×过量倍数)于DCM 中溶解, 再加入DIEA 0.5 mL, 混合加入反应容器中,吹N2反应2h, 将反应液过滤除去加入MeOH 5mL封闭反应1h后用DCM、DMF 各洗涤树脂3次。

3、脱除氨基保护基

加入约15 mL 20%哌啶的DMF 溶液反应5 min,滤掉, 再加入15 mL 反应20 min 后用DCM洗涤树脂3次、DMF 洗涤树脂3次。

4、肽键的形成

称取0.55 g Fmoc-Trp(boc)-OH, 0.35g TBTU 以DMF 溶解, 与0.6 mL

HOBt (2mol/L), 0.2 mL DIEA混合加入盛有树脂的反应容器中, 吹N2 反应2 h后用DCM洗涤树脂3次、DMF 洗涤树脂3次。重复上述步骤(脱保护和接肽), 按还未成环前的直链肽的序列由羧基端→氨基端的顺序依次连接氨基酸。

5、侧链脱保护及环肽脱离树脂

洗涤、脱除最后一个氨基酸的Fmoc 保护后用N2将肽-树脂复合物吹干, 加入50 mL 小烧瓶中,按10 mL/0.5 mL/0.25 mL/0.5 mL/0.75 g 的比例加入TFA/苯甲硫醚/巯基乙醇/水/苯酚配成的切割试剂。室温磁力搅拌反应3 h 后, 过滤入冰乙醚中, 置冰箱2 h, 离心收集, 沉淀用纯水溶解, 再置冰箱冷冻,后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机, 冻干至恒重即得粗肽。

6.多肽的不稳定性

多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，其原因较多。但对某一个多肽来说引起不稳定的主要原因并不多。详细研究外界条件（如PH、温度、光照、氧浓度等）对多肽稳定性的影响有助于设计合理的制剂配方。尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分清楚，使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选道合适的添加剂。

引起多肽不稳定的原因

1. 脱酰胺反应在脱酰反应中，Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行。在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。

2. 氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。

3. 水解多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。

4. 形成错误的二硫键二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。

5. 消旋除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋应。

6. β-消除β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除，温度和金属离子对其也有影响。

7. 变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。

7.提高多肽稳定性的途径

（1）定点突变

通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。

（2）化学修饰

多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。

（3）添加剂

通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween等能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。

（4）冻干

多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。

关于多肽合成

关于多肽合成 1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc 法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。 从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc 法合成，如图： 具体合成由下列几个循环组成：

多肽合成技术

精心整理 多肽合成技术多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，EmilFischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，FredSanger 发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield 提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，LouCarpino首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。

多肽合成方法

多肽合成中肽键形成的基本原理 一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。 在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。如果羧基组分（A）的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A－B混在一起。所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。 因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚： 第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在； 第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。 第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继??? 续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。 由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。 在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。 在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。 多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。 最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。

合成多肽药物药学研究技术指导原则

附件三 合成多肽药物药学研究技术指导原则

合成多肽药物药学研究技术指导原则 一、前言 多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；与此同时，随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。 采用化学合成方法制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为拮抗剂；此外，新技术的发展，例如以多肽固相合成和组合化学为基础的组合肽库合成技术，使得在短时间内获得大量的多肽化合物成为可能，药物筛选的效率不断提高。因此，将会有越来越多的采用化学合成方法制备的多肽类化合物成为治疗用药物。 合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。这类药物的药学研究同样遵循国家食品药品监督管理局已经发布的相关技术指导原则的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸（包括天然氨基酸和非天然氨基酸）构成，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。本指导原则就是在已有的相关指导原则基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，提出多肽药物药学各项研究的一般性要求。当然，具体品种研究的内容与深度还要取决于品种本身的特性。 本指导原则适用于采用液相或固相合成方法制备的多肽药物。

二、合成多肽药物药学研究的基本考虑 合成多肽药物药学研究的主要内容、研究思路、研究方法及一般性的技术要求与其他类型的化学药物基本一致。但是，由于多肽药物的特点，在进行药学研究时还应注意考虑以下问题。 1、关于多肽（原料药）合成工艺选择的考虑 多肽的化学合成是有机合成的一个非常特殊的分支，目前主要有液相合成和固相合成两种方法。 液相合成是经典的多肽合成方法，一般采用逐步合成或片段缩合方法。逐步合成法通常从链的C'末端氨基酸开始，向不断增加的氨基酸组分中反复添加单个α-氨基保护的氨基酸。片段缩合一般先将目标序列合理分割为片段，再逐步合成各个片段，最后按序列要求将各个片段进行缩合。液相合成的优点是每步中间产物都可以纯化、可以获得中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失，缺点是较为费时、费力等。 固相合成是将目标肽的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体(树脂)相连,再以这一氨基酸的氨基为合成起点,使其与相邻氨基酸（氨基保护）的羧基发生酰化反应,形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基脱保护后与下一个氨基酸的羧基反应,不断重复这一过程,直至目标肽形成为止。其优点是简化了每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。 液相合成和固相合成各有优缺点，应根据合成的实际需要选择适合的工艺。一般而言，液相合成法较适于合成短肽；固相合成法

多肽合成方法

实施例1 本发明多肽的合成 1)实验仪器与材料: 二甲基甲酰胺（DMF），哌啶，树脂，二氯甲烷（DCM），茚三酮反应试剂（茚三酮，维C，苯酚），四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），六氢吡啶（哌啶），三异丙基硅烷TIS,乙二硫醇（EDT），无水乙醚，三氟乙酸（TFA），N-甲基吗啉（NMM），甲醇，各种氨基酸,Fmoc-e-Acp-OH,FITC，多肽固相合成管。 2）溶液配制 脱保护溶剂——六氢吡啶：DMF=1：4 反应液——NMM:DMF=1：24 裂解液——TFA(92.5%)TIS(2.5%)EDT(2.5%) 茚三酮测试液——茚三酮、vc、苯酚各一滴 荧光偶联溶剂——吡啶：DMF：DCM=12:7:5 2)实验步骤: 称量树脂并投入到多肽固相合成管（以下简称反应器）中，加入适量的DMF 溶胀半小时以上。抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，10min于摇床。抽掉去保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂（约5~10mg）于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。分别按照SEQ.1- SEQ.N肽的氨基酸序列顺序取相应氨基酸、HBTU （氨基酸：HBTU=1:1），用反应液溶解，投入到反应器中，搅拌反应。1-2小时后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。抽掉反应器中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到序列号为SEQ ID NO.1 –N+1的肽。反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂2-3次，甲醇洗两次，继续抽干15-20min。反应器中取出合成完的肽树脂，在室温下于裂解液（裂解液先冰浴20min）中裂解两小时。将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，用无水乙醚（冰浴）洗3次。粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90%。所得到的纯肽使用质谱(MS, electrospray)鉴定。 至最后一个肽合成后，取出部分加荧光标记。先将Fmoc-e-Acp-OH按氨基

多肽合成方法

1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。 从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步

多肽合成

多肽合成技术 多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel 化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因

合成多肽药物药学研究技术指导原则

指导原则编号： 【H 】G P H 11 - 1 合成多肽药物药学研究技术指导原则 二00七年九月

目录 一、前言 二、合成多肽药物药学研究的基本考虑 三、合成多肽药物药学研究的主要内容（一）制备工艺研究 （二）结构确证研究 （三）制剂处方工艺研究 （四）质量研究与质量标准 （五）稳定性研究 四、名词解释 五、参考文献 六、著者

合成多肽药物药学研究技术指导原则 一、前言 多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；与此同时，随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。 采用化学合成方法制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为拮抗剂；此外，新技术的发展，例如以多肽固相合成和组合化学为基础的组合肽库合成技术，使得在短时间内获得大量的多肽化合物成为可能，药物筛选的效率不断提高。因此，将会有越来越多的采用化学合成方法制备的多肽类化合物成为治疗用药物。 合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。这类药物的药学研究同样遵循国家食品药品监督管理局已经发布的相关技术指导原则的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸（包括天然氨基酸和非天然氨基酸）构成，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。本指导原则就是在已有的相关指导原则基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，提出多肽药物药学各项研究的一般性要求。当然，具体品种研究

多肽固相合成

发明 英文解释: solid phase peptide synthesis 简写为SPPS 在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由于R.BruceMerrifield在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。下面给出了肽固相合成途径的简单过程（合成一个二肽的过程）。 氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。 重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。 固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。 化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。Merrifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶。1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素。固相合成法的诞生 多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer 首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。

多肽合成详细解说

多肽合成详细解说 1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。 从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc 和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，如图：

多肽合成基础知识大全

----------------------------------------------------------------------------------------- 多肽合成 基础知识汇编 编制: 合成部 ----------------------------------------------------------------------------------------- 一、多肽合成概论 1．多肽化学合成概述： 1963年，［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有

多肽合成方法科普

多肽合成方法 一、基本介绍 多肽是涉及到生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已经发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构域功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要的信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 二、合成方法 多肽的合成主要有两种途径：化学合成和生物合成。化学合成主要通过氨基酸缩合反应来实现。为得到具有特定顺序的合成多肽，当合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体时，应将不需要反应的基团暂时保护起来，然后再进行连接反应，以保证合成的定向进行。多肽的化学合成有固相合成和液相合成，其主要的区别在于是否使用固相载体。多肽液相合成主要有逐步合成和片段组合两种策略，逐步合成简洁迅速，被用于各种生物活性多肽片段的合成；片段组合法为合成含有100个以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路线，并已成功地合成了多种有生物活性的多肽，其最大的特点是易于纯制。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产

素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。1963年，Merrifield创立了固相合成法，为此，Merrifield获得了1984年的诺贝尔化学奖。该方法是将氨基酸的C末端固定在不溶树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸、延长肽链。固相合成法又可分为Boc（叔丁氧羰基）法和Fmoc（9-芴甲氧羰基）法。它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。在传统液相和固相合成多肽方法的基础上，人们又发展了氨基酸的羧内酸酐（NCA）法、液相分段合成法、组合化学法等。在生物合成多肽方面，除了常用的发酵法、酶解法外，随着生物工程技术的发展，DNA重组技术也被应用于多肽合成。 1.液相多肽合成（solution phase synthesis） 液相多肽合成现在仍然被广泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大，合成成本低的显著优点，而且由于是在均相中进行反应，可以选择的反应条件更加丰富，象一些催化氢化，碱性水解等条件，都可以使用，这在固相中，使用却由于反应效率低，以及副反应等原因，无法应用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z两种反应策略。 2.固相多肽合成（Solid-phase peptide synthesis，SPPS） 经过不断的改进和完善，固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末

多肽固相合成的研究进展

科学与财富 多肽固相合成的研究进展 刘立伟 （华北理工大学迁安学院河北唐山064400） 摘要：多肽是一类非常重要的生物活性物质，在治疗某些疾病方面具有独特的疗效，因此其化学合成有着非常重要的意义。文章介绍了多肽固相合成的原理、方法、固相载体的选择、连接分子的种类及肽键的形成等，揭示了固相合成多肽存在的问题并展望了其研究前景。 关键词：多肽固相合成 1多肽的概述 多肽是普遍存在于生物体内由氨基酸组成的生物活性物质，它是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。在生物体内发现的多肽已达数万种，由于其具有广泛的生物活性及良好的安全性，因此已日益受到药物研发工作者的重视。尤其在20世纪90年代以后，随着多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的活性多肽已被开发并广泛应用于医药、食品、化妆品、农业及畜牧业等领域。 合成多肽的方法主要是指化学合成法，其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法，无论是液相法还是固相法都已经很成熟。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成两种途径，它在多肽的工业化生产方面有非常重要的应用。与经典的液相合成多肽方法相比，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。 2多肽的固相合成 1963年Merrifield提出固相多肽合成方法(SPPS，Solid Phase Peptide Synthesis)，为多肽研究开辟了广阔的天地，并极大地推动了分子生物学等领域的发展，为此1984年Merrifield被授予了诺贝尔化学奖。 2.1固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。首先将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链。重复(缩合?洗涤?去保护?中和及洗涤?下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法，α-氨基用Fmoc（9-甲氧羟基合成）保护的称为Fmoc固相合成法。 2.2合成方法 2.2.1Boc合成法 采用三氟乙酸(TFA)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc保护的α-氨基酸共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、偶联下一个氨基酸，最终采用强酸HF法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc合成法中，由于要反复地用酸来脱保护以便进行下一步的偶联，这就引入了一些副反应，如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定并发生副反应。 2.2.2Fmoc合成法 1978年，Meienlofer和Atherton等人发展了以Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基的多肽合成方法—Fmoc法。在Fmoc法中，采用了可被碱脱除的Fmoc作为α-氨基酸的保护基，侧链采用酸脱除的Boc 保护方法。Fmoc作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用TFA等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，侧链用对碱稳的Boc进行保护等。肽段最后用TFA/二氧甲烷(DCM)定量地从树脂上切除，避免了采用强酸。Fmoc法与Boc法相比，由于Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，而被广泛应用于多肽合成中。 2.3固相合成的聚合物载体的选择 将固相合成与其他多肽合成技术分开来的最主要的特征是固相载体，而能被用作多肽固相载体的聚合物必须满足以下条件:①必须包含合适的连接分子(或反应基团)，使肽链能连接在载体上面，并在以后除去。②必须在合成过程中保持稳定并且不与氨基酸分子反应。③必须提供足够的连接点，以满足肽链不断增长的需要。目前用于固相合成的聚合物载体主要有三类:聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇类树脂及衍生物。这些聚合物载体只有引入相应的连接分子，才能与氨基酸进行连接。根据连接分子的不同，树脂又被分为几种类型:氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。 2.4连接分子 一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定，并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子，同时连接分子还需要根据与树脂相连的肽的C端的结构类型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物来选择。固相多肽合成使用过的连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。 2.5肽键的形成 固相中肽键的形成原理与液相中的基本一致，应用的方法主要有缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中选用DCC、HOBT 或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法由于在肽键的形成过程中可以减少副反应并抑制消旋的发生，最终得到的多肽收率高等优点而应用最广。 2.6多肽的切割，沉淀与纯化 按既定的顺序合成完多肽后，就要把目标多肽从树脂上切割下来，并进行进一步的纯化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法两种，因此，它们的切割方法也不完全一样。在Boc法中，主要用TFA＋HF裂解和脱侧链保护。在Fmoc法中直接用TFA进行切割。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。目前应用最多的是高效液相色谱法， 3展望 固相多肽合成已经有50年的历史了，但是，目前人们还只能合成一些相对较短的肽链，而对于相对分子质量较大、肽链较长的蛋白质类物质，固相合成技术还有很大的局限性。同时在合成中要用到大量的有毒试剂，合成费用昂贵，并伴随副反应、消旋化等问题，这些都是不可忽视的问题。而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题。同时，寻找更加绿色、环保的多肽合成技术，对科学家来说也是一个重大的挑战。 参考文献： [1]韩香，顾军.多肽的固相合成。天津药学，2002,14（7）：9. [2]李正超，韩香.多肽合成方法研究进展。武警后勤学院学报.2012，22（2）：153-158. 界,2015,11:191-192. [3]曹华英.浅谈电力市场营销在市场经济条件下的发展创新[J].广东科技,2012,03:97-98. [4]刘淑萍.浅析市场经济下电力市场营销的创新发展[J].科技创新与应用,2012,29:265. [5]孙皓.浅议电力企业市场营销的创新发展[J].科技风,2012,20:269. （上接109页）科学发展 110

多肽合成技术

多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel 化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就 由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常 迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基 团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨 基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 ?多肽化学合成的基本介绍