水产动物疾病诊断技术

现代生物技术在水产动物疾病诊断上的应用

生命科学与技术学院水产养殖06-4班安海燕 0601101401

随着养殖规模的不断扩大，集约化程度的不断提高，一方面推动了养殖业的迅速发，增加了经济效益；另一方面也带来一个不容忽视的问题－疾病滋生，有严重困扰着养殖业的步伐。如何寻求一种有效的途径来缓解疾病给养殖业带来的危害与损失，一直是人们所关注的主题。近些年来，生物技术的蓬勃发展，给水产养殖业带来了新的挈机。国内外诸多学者将这一新兴科技用于病害防治，取得了不少成果，并显示出良好的发展前景。水产动物疾病诊断技术的发展与相应的病原研究的深入程度密切相关，近20年来，用现代生物学技术检测病毒、细菌性病害的发展迅速，主要有荧光抗体技术、免疫酶技术、单克隆抗体技术、核酸杂交技术、聚合酶链反应(PCR)技术等。由于上述检测技术的灵敏度高、特异性强、实用性好等特点，在国内外已成为多种水产动物病毒、细菌等病害的常规诊断方法。对鲑鳟鱼、对虾等的主要病毒和细菌病原的相应免疫学或分子生物学病原检测技术多数都开发成了商品化的试剂盒。

近年来,根据目前国内外研究的动向, 随着分子生物学技术在水产领域的广泛应用，分子生物学技术已经体现出极高的应用价值和经济价值。它对解决水产业的技术难题、开创新的领域、改造产业的传统模式起着十分重要的作用。包括我国在内的许多国家都在大力研发与水产业有关的分子生物学技术，并着力于开发新的优良养殖种类、培育高产抗逆的良种以及探寻检测和防治病害的新技术、新方法等。因此应用分子生物学技术进行水产养殖品种的疾病诊断领域具有强大的发展潜力。目前生物技术在水产养殖病原体检测上的应用，我国水产养殖业尤其是虾类、贝类、鱼类受到病原微生物的侵扰十分严重，如何对水产动物疾病进行快速、准确的预报与诊断，是摆在养殖业面前的第一道门坎。近些年来，生物技术的发展已为病原体的检测提供了快速、高效、灵敏的技术手段。

同时，免疫学快速诊断技术是一项特异、敏感和简便的技术，广泛应用于许多领域，尤其在生物医学的理论研究和临床诊断方面更是发挥了不可替代的作用。其主要包括血清凝集试验，免疫荧光抗体和免疫酶标技术在水产动物疾病诊断上的应用具有灵敏度高、特异性强、定位准确和应用广泛等优点。现代生物技术结合免疫学对免疫检测技术、核酸检测技术、核酸技术与免疫学相结合方法等

进行了研究与应用。

单克隆抗体

单克隆抗体是由单个细胞传代所产生的高纯度、高特异性的抗体。它与常规血清抗体相比，具有更强的特异性与针对性，且制备简单，因而在病原检测中得以广泛应用。80年代后期，已成功研制出传染性胰腺坏死病毒、出血病毒等单克隆抗体，并用于鱼类多种疾病的诊断。近年来。有学者已成功制备了抗鳗弧菌的单抗和抗嗜水气单胞菌的单抗。我国在单克隆抗体技术中，将其应用于检测草鱼出血病毒和对虾白斑病毒，均获得了较为

酶联免疫吸附

酶联免疫吸附检测(ELISA)是将抗原或抗体吸附在载体表面，通过酶与底物显色来检测特异性抗原或抗体的技术。该技术具有反应迅速、特异性强、灵敏度高等特点。目前，ELISA在鱼类病原体检测上的应用较广，国内诸多学者将此技术用于疾病检测上，如李焕荣等(1997)应用Dot－ELISA快速检测出了嗜水气单胞菌的致病因子胞外蛋白酶AhECPase54；黄?(1995)应用单克隆抗体酶联免疫技术检测到了对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒；陈怀青等(1993)应用Dot－ELISA检测到了鱼类致病性嗜水气单胞菌hec毒素。国外对此项技术的研究较国内早，广泛用于对疖疮病、红嘴病、细菌性肾脏病以及爱德华菌病等的快速检测与诊断。此外，Noel等将ELISA用于菲律宾哈上，成功检测出了弧菌PI满意的效果。

核酸探针

核酸探针是指利用特定标记的DNA或RNA探针与病原生物中的与探针互补的靶核苷酸序列进行杂交，以此来确定宿主是否携带病毒的一类分子生物学技术。该方法以其灵敏度高、特异性强、简便快速等特点，在病原检测中倍受青睐。Futo，Hiney(1992)将此技术应用诊断细菌性鱼病，Comps等(1996)采用地高辛标记的RNA探针检测FEV病毒在鱼类中的表达，Bruce等(1994)利用DNA探针检测对虾杆状病毒。日本学者也采用地高辛标记的DNA探针进行菌落杂交，用于鳗弧菌的鉴定。我国学者对导致我国对虾大规模死亡的病原－皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)，已成功研制出核酸探针试剂盒，用于虾病的诊断。该法简便快捷，操作性强，已获国家专利。

聚合酶链反应

酶链反应(PCR)技术是指在引物的指导下，体外酶促反应，迅速扩增DN**段的一种方法。该法反应十分迅速，几小时内便可扩增到108－10倍，因而PCR 技术具有高度的灵敏性。目前PCR在水产动物病原的操作中，已成功应用于毛蛤甲肝病毒，对虾桃拉病毒、的检测白斑病毒等，并研制出了诊断白斑病毒的检测试剂盒，可用于幼虾、成虾以及亲虾的带毒检测，同时还可对养殖环境中的宿主、底质、饵料等进行检测。另外有学者也报道了应用PCR技术检测贝类肠道

病毒以及周围水体内的病菌等。

PCR与其他技术的联用

PCR不仅自身可以用来检测病原体,也可以与其他技术相结合充分发挥其优点。例如Sukhum-sirichart等(2002)通过在反应体系中加入地高辛标记的dUTP,采用将PCR和酶联免疫吸附试验相结合(Polymerase Chain Reaction-Enzyme-Linked-Immuno-sorbent Assay,PCR-ELISA)从虾中检测出了对虾肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic Par-vovirus,HPV),通过比较实验,说明其灵敏度是southern杂交(Southern hybridization)的10倍,是常规PCR的20倍。该法避免了PCR中使用溴化乙锭的缺点,但是它也有实验成本较高的缺点。Schwab等采用一种从嗜热菌Thermus thermophilus中提取出的耐热性的同时具有反转录酶和聚合酶活性的酶rTth,与RT-PCR结合建立了DEIA(DNAenzyme immunoassay)法检测出了诺沃克样病毒(Nor-walk-like viruses,NLVs),由于该法的结果是用数字表示的,这样也避免了电泳和Southern杂交时人的主观判断。del Cerro等等利用基于TaqMan探针的PCR检测了病原F.psychrophilum.。Heath 等等利用竞争PCR扩增鱼类的一种病原体Piscirick-ettsia salmonis的核糖体RNA基因间(Internal Tran-scribed Spacer,ITS)的部分序列,并用DGGE(变性梯度凝胶电泳)检测到了结果。

16S rRNA技术

16S rRNA是核糖体RNA的一种，具有分子量适中、所含的遗传信息丰富等特点。在结构上分为保守区（Conserved domain）和可变区（Variable domain）。保守区能反映生物物种的亲缘关系，可变区能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适细菌系统发育和分类鉴定的指标。目前16S rRNA序列分析已广泛用于水产动物病原菌的鉴定。Ragnhild等（1995）通过对分离于大西洋鲑鱼、虹鳟鱼、大菱鲆和鳕鱼中的致病弧菌的16S rRNA序列进行比对，对鱼类致病弧菌进行分类。Carlos等（1999）通过对26株不同来源的鱼病菌的16S rRNA基因序列的分析，确定了鱼出血性败血病血症病原美人鱼发光杆菌的分类地位，并建

立了基于16S rRNA基因的巢式PCR病原检测方法。Cerda等（2001）利用一种特异的16SrRNA基因探针对V.vulnificus 病毒进行检测。邹玉霞等（2004）通过对大菱鲆出血症病原菌的16S rRNA 基因进行系统发育学分析，确定了该病原菌为鳗弧菌。耿毅等（2006）从发生急性流行性传染病的斑点叉尾鱼回肝脏、肾脏分离到一高致病性的菌株，经16S rRNA序列分析，鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌。

细胞培养

当前，动物细胞培养也作为一类技术用于水产动物病原体的检测。如Lu等(1995)应用对虾淋巴器官原代培养细胞检测对虾黄头杆状病毒(YBV)。此外，水产动物细胞培养也可用于筛选抗菌药物、培育新型品种以及生产各类疫苗和免疫制剂等。

限制性酶酶切检测

限制性酶可识别DNA上较短的序列，在识别位点上切开DNA，单个核苷酸变化即可导致限制性酶切位点的增加或缺失。因此，酶切后产生的片段数目发生了改变，即所谓的限制性片段长度多态性(RFLP)。根据酶切后的DNA片段在凝胶电泳上进行分离，染色后即可观察各个不同大小的片段，进行遗传变异的分析。这种诊断对于病原微生物是相当有效而直接的方法。如Katja Einer-Jensen等通过RFLP技术分析鱼体棒状病毒血红素败血病病毒的基因型。

荧光抗体技术

荧光抗体技术是根据抗原抗体具有高度特异性的反应，把荧光素作为抗原标记物，在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原复合物及其存在部位，在水产动物病原体的检测上得到了一定的应用。鄢庆枇等应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的弧菌。

近半个世纪以来，随着水产动物疾病研究广泛地与其它先进技术手段相结合，尤其与分子生物学技术的结合，为水产动物疾病快速诊断技术的研发带来了福音。快速准确的病原体检测手段，高效免疫疫苗的制备都在很大程度上缓解了病害所带来的严重损失。然而目前许多快速诊断技术都处实验室研究阶段，将这些快诊技术应用于生产，还有待于条件方法的优化以及仪器设备成本的降低。随着研究的深化，水产动物疾病的快速诊断技术也在不断向前发展，基因芯片（又

称DNA芯片）技术的研发也渐有突破。日本水产综合研究中心已经成功开发出利用DNA晶片快速诊断鱼类细菌性疾病的新技术，利用DNA晶片的诊断法与过去只能检出特定病原菌的PCR法或培养法相比，不但在检察时间或步骤上缩短许多，在成本上也比较便宜。利用该技术，以往被归为不明原因的细菌性疾病也能在一次的诊断中检测出来。应用基因芯片技术快速诊断技术确实是一种敏感性强、精确度高的有效检测手段。

国际上正在着手建立水产病害检疫网络和规范，其相关的病原快速检测技术将得到不断完善并规范化。现代免疫学、分子生物学和生物化学等高新生物技术，如核酸探针、PCR、荧光抗体检测技术、酶联免疫技术等在疾病诊断和病原生物检测中将得到广泛应用，技术的商品化程度将大大提高。对病原生物核酸序列的掌握为核酸探针和PCR引物的人工合成提供越来越多的便利。借助上述手段，检测技术将能精细到对病原分类分型鉴定和致病因子的测定。

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