非洲猪瘟检测与诊断技术要点
非洲猪瘟检测与诊断技术要点
中国农业科学院上海兽医研究所
牵头编制
2019年9月
前言
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率和死亡率可达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
1921年，ASF最初发现于肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲流行。2018年8月初我国爆发非洲猪瘟首起疫情以来，该疫病已蔓延全国23个省，给我国生猪养殖业和国民经济带来巨大损失。由于ASFV感染机制复杂，目前世界范围内至今尚无有效预防用非洲猪瘟疫苗，因此早期发现、精准检测是控制该病传播和发生的关键。
本文参考了OIE、农业农村部和中国动物卫生与流行病学中心、中国动物疫病预防控制中心的相关文件和技术手册，结合我们的研究成果，从非洲猪瘟早期发现、现场排查、精准检测三个方面的技术要点编写而成，主要面向从事非洲猪瘟现场排查和检测的一线防疫人员，提供了简明实用的相关操作技术与方法，为非洲猪瘟现场排查与检测等相关工作提供参考。
编者：
牵头团队：上海兽医研究所猪呼吸道传染病团队
负责人：马志永
参加人：魏建超等
参加团队：哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队负责人：仇华吉
参加人：罗玉子等
兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病团队
负责人：刘志杰
参加人：林密等
兰牧药研究所中兽医与临床团队
负责人：李建喜
参加人：崔东安
目录
一、概述 (1)
二、早期发现 (3)
三、现场排查 (5)
（一）准备工作 (6)
1. 人员准备 (6)
2. 车辆准备 (6)
3. 物品准备（生物安全防护及采样所需物品） (6)
（二）进出养殖场要求 (7)
1. 抵达养殖场 (7)
2．穿戴个人防护设备( 在清洁区) (8)
3. 离场前准备 (8)
4. 离场后 (9)
5. 消毒剂的选择 (9)
（二）临床诊断 (9)
1.临床症状 (10)
2. 剖检病变 (11)
3. 鉴别诊断 (12)
4. 发现疑似病例的情况下应立即采取的行动 (14)
（三）样品采集、包装与运输 (14)
1. 采样方法 (14)
2. 样品的记录、保存、包装和运送 (16)
3. 废弃物处理 (18)
四、实验室诊断与确诊 (18)
1．快速精准检测 (18)
2. 疫情确诊 (18)
附件一：非洲猪瘟防治技术规范 (20)
附件二:国家非洲猪瘟参考实验室、专业实验室和区域实验室名单 (24)
一、概述
非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种有囊膜的DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。ASFV粒子直径约为200纳米，呈正20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是基因组DNA、基质层、内膜、核衣壳和外囊膜。ASFV的基因组为线性双链DNA，大小约为170-193kb，含有150-167个开放阅读框(ORFs)，由一个大约125kb的中心保守区和两个含5种多基因家族(MGFs)的变异末端组成。依据编码主要衣壳蛋白p72的基因B646L的部分核苷酸序列，ASFV可以被分为24个基因型。
首次发现的传入我国的ASFV毒株属于基因II型。ASFV不能诱导中和抗体免疫。ASFV的衣壳蛋白p72，膜蛋白p54、p30和p12具有良好的抗原性。在感染猪或康复猪体内，50余种病毒蛋白可诱导抗体应答，可用做血清学诊断的抗原。自然感染条件下，ASF的潜伏期为3-19天，感染猪在潜伏期即可排毒，临床症状出现后可通过分泌物和排泄物大量排毒。
ASFV耐受酸碱的范围较广，pH4-10条件下在无血清的培养基中保持稳定，但在pH值低于4或高于11.5，数分钟内可被灭活。ASFV对环境的抵抗力很强，在尸体中可存活6个月以上，在低温条件下可存活数年；在腐败的血液中可存活近4个月；在冷鲜肉中存活数周至数月；在腌制和熏制的猪肉产品中可长时间存活；在粪便中可保持感染性数周。
ASFV对热的抵抗力较弱，60℃20分钟或56℃70分钟可被灭活。一般的消毒措施均可有效杀灭ASFV。最有效的消毒剂是去污剂、次氯酸盐、碱类及戊二醛。
ASF的自然传播速度慢，高度接触传播，直接接触、采食、蜱虫叮咬、注射等可传播疫病。消化道(口)和呼吸道(鼻)是ASFV的主要感染途径。苍蝇、蚊、鼠等可机械性传播ASFV。
传染源：带非洲猪瘟病毒野猪和发病家猪的分泌物及排泄物、含有病死猪组织或非洲猪瘟病毒污染的泔水、含非洲猪瘟病毒的猪肉及其制品，以及钝缘软蜱。
传播途径：感染猪与健康易感猪的直接接触可传播非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒可通过饲喂污染的泔水、污染的饲料、垫草、车辆、设备、衣物等间接传播。钝缘蜱属的软蜱，特别是O.moubata(非洲)和O.erraticus(欧洲)是非洲猪瘟病毒（ASFV）的宿主和传播媒介。消化道和呼吸道是最主要的感染途径。
易感动物：家猪和野猪。其它哺乳动物包括人类均不感染非洲猪瘟病毒。目前报道的发病猪群主要是饲喂非洲猪瘟病毒污染泔水的猪。不同品种、日龄和性别的猪均对非洲猪瘟病毒易感。
潜伏期：家猪为3天到19 天不等。
非洲猪瘟（ASF）是能引起不同品系、不同年龄家猪和野猪一系列综合征的疾病。急性猪瘟表现为高烧、网状内皮系统出血，死亡率高。ASFV有强毒力、中等毒力和低毒力等三种类型毒株。临床上可分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。
最急性型：发病猪体温达41℃-42℃，呈现厌食、食欲废绝、精神沉郁、皮肤充血等症状，1-4天内死亡。也有无症状死亡的猪。发病率和病死率均可达100%。
急性型：发病猪体温达40℃-42℃，呈现厌食、不愿活动、皮肤发红、呕吐、鼻腔出血、血便、便秘等。妊娠母猪流产。病死率可达90%-100%。
亚急性型：与急性型类似。病猪出现中度发热，食欲下降。皮肤出血和水肿，感染后7-20天死亡，病死率为30%-70%。
慢性型：病猪体重下降、生长不良，呈现间歇热，耳部、腹部和大腿内侧皮肤发生坏死或溃疡，关节肿大，感染猪可出现呼吸道症状。
ASF的实验室诊断分为病原学诊断（包含病毒分离、病毒抗原和基因组DNA的检测）和抗体检测。依据地区或国家的疾病情况及诊断实验室的能力选择合适的诊断方法。
鉴定病原：国家法定实验室诊断必须针对病毒的分离，同时进行猪肺泡巨噬细胞或骨髓培养接种，用荧光抗体试验（FAT）检测组织涂片或冷冻切片中的抗原，用PCR方法检测基因组DNA。PCR是一种优良的、灵敏的、快速的
ASFV检测技术，在很多情况下都是非常有用的。特别是组织不适合病毒分离和抗原检测的情况。
在可疑病例中，病料在猪肺泡巨噬细胞培养物中传代，并重复上述过程。
血清学试验：耐受过ASF自然感染的猪通常在感染后7-10天产生抗ASFV 抗体，这些抗体持续很长一段时间。疾病地方性流行，或者是由低毒力毒株引起的最初的爆发，对于新爆发的研究需要包括对送检的血清中的特殊抗体和组织渗出液进行检测。很多方法，如间接荧光抗体（IFA），酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹试验可用于抗体检测。
二、早期发现
为尽早发现ASF疫情，首先要让猪场全体员工熟悉ASF的临床症状。了解周边三公里范围内的养猪场户、屠宰场点、生猪交易场所、无害化处理场等情况，密切关注周边生猪异常死亡情况，及时发现疫情隐患。
时刻关注本猪场各个环节的猪只异常情况，包括猪只的精神状态、采食情况、体温变化、体表变化和经产母猪表现等。目前我国大多数的ASFV感染病例属于急性-亚急性。通常，ASF急性-亚急性的症状主要包括：发烧、昏睡、厌食、皮肤出血以及循环系统、呼吸系统、消化系统出现问题并伴有神经失调。
精神状态：及时发现栏舍内眼神异常猪只(这时猪只可能还未排毒)、精神沉郁的猪只，并及时采样和送检。猪场要积极发动一线员工关注异常猪只，对于提前发现猪只异常并及时采样经实验室检测阳性的，给予相应奖励。
采食情况：关注群体和个猪只的采食情况，对于采食量稍微减少(排除饲料因素)，要尽快采样送检。采食量明显下降的猪只一般会伴随着体温升高。
体温变化：正常保育猪、育肥猪体温一般在39℃-40℃之间;正常成年基础猪群的体温在38℃-39℃之间(其中母猪发情、分娩前后几天，体温会升到39℃-40℃之间)。如果发现体温超过正常范围的猪只，应及时采样送检。为了防止测量体温时交叉污染，体温计必须一猪一换，须戴手套和穿防护服;可采用远红外体温计测温，尽量不入栏。
体表变化：看到皮肤发红猪只，表明猪只处于发烧状态。另外，有些猪只
打针时出现凝血不良。对于这些异常猪只，要及时采样进行检测。
经产母猪的表现：经产母猪除上述临床表现外，还会出现流产。ASF造成流产有别于其他疫病常见的黑胎或白胎，会出现胎儿均质发红。
一旦发现可疑症状，第一时间采样送检(采样优先顺序：鼻腔拭子>唾液>阴门拭子>肛门拭子)。
三、现场排查
图1. 排查工作流程示意图（中国动物疫病预防控制中心）
（一）准备工作
1.人员准备
了解非洲猪瘟基本知识（基本的生物学特征、流行病学特点、临床表现、剖检病理变化等）。
了解非洲猪瘟感染与传播的高风险因素（饲喂泔水、生物安全水平低、动物贩运、猪肉及其制品流通）。
了解排查工作中需遵守的生物安全操作要求，避免人为造成的传播。
养殖户等相关人员可能面临较大压力，应注意工作方式方法。
2. 车辆准备
车辆必须彻底清洗消毒。
车辆不携带无关物品。
在车内、车的后备箱里铺塑料布防止污染。
3. 物品准备（生物安全防护及采样所需物品）
(1) 进场所需材料清单
胶靴；
一次性生物安全防护服；
口罩；
鞋套或靴套；
一次性乳胶手套；
消毒剂及喷壶（适用于非洲猪瘟病毒的消毒剂）；垃圾袋（包括生物危险品垃圾袋）；自封袋（用来装手机或其他设备）；面部用消毒湿巾；
密封用胶带；
护目镜。
洗涤剂及刷子；
（2) 采样所需材料清单
一般材料
标签和记号笔；
数据记录表、笔、写字板；
盛放针头和刀片的锐器盒；
高压灭菌袋；
用于环境采样的拭子和盛放拭子用的离心管；
样品包装运输所需材料
容器/ 离心管/ 小瓶( 防漏并标示清楚)；
吸水纸；
密封性好的容器或袋子，作为二次包装( 即防漏)、用于储存动物样品的容器和采血
管；
冷藏箱(+4℃)；
便携式-80℃冷冻箱/ 干冰/ 液氮罐( 仅在远离设备齐全的实验室进行取样时才需
要)；
保定动物的材料( 如，套索、木板)；
采血所需材料
消毒剂和脱脂棉（酒精棉）；
不含抗凝剂的无菌采血管(10ml)( 红色盖子)；
含有EDTA的无菌采血管(10ml) ( 紫色盖子)；
根据猪的大小和采样部位( 颈静脉、耳缘静脉) 选取真空采血管或10-20ml 注射器；（二）进出养殖场要求
1. 抵达养殖场
车辆停在养殖场入口附近，不得驶进场内。
在养殖场指定的地点（清洁区），穿戴个人防护设备（如需要，应遵循养
殖场的要求进行个人防护），并进行物资的准备、制备消毒剂等。
进入养殖场生产区域前，脱下和摘掉不必要的衣服和物品( 夹克、领带、
手表等)，清空衣服口袋，按照养殖场进场程序（沐浴洗澡或其他方式）进入生产区域。
电子设备( 移动电话等) 应放置在密封的塑料袋中，以便随后进行清洁和消毒。在养殖场内，只能通过塑料袋使用手机，不要从袋子里拿出。
其他非一次性物品，应在消毒后进场。如需要，应按照养殖场物资进场程序进行消毒后进场。
消毒工作要在清洁干燥的地面进行（最好是混凝土地面），应划分清洁和非清洁区并保证界线清晰。
2．穿戴个人防护设备( 在清洁区)
脱下鞋子，并放在塑料布上。
在遵守养殖场进场要求的前提下，部分场需要脱去全部个人衣服，洗澡后穿戴养殖场内部衣服方可进场。
部分场可以首先穿戴一次性防护服，穿上靴子。戴手套，手套要用胶带封上。
如果需要穿防水服，防水服应套在靴子外层。再戴一层手套，方便中间更换。
靴套至少覆盖胶鞋底部和下部。
进场前，戴口罩并仔细检查物品清单。
3. 离场前准备
在非清洁区域对接触过养殖场的所有物品进行清洗和消毒处理。
对盛放样品容器的表面进行消毒，然后放在清洁区。
脱下鞋套放入非清洁区的垃圾袋中，然后彻底擦洗靴子( 特别是鞋底)。
脱下手套并放入非清洁区的垃圾袋中。
脱下一次性防护服并放入非清洁区的垃圾袋中。
脱下靴子，对靴子进行消毒后放入清洁的袋子里。
手和眼镜也必须进行消毒，并用消毒湿巾清洁脸部。
进入生产区域的人员在指定区域进行沐浴洗澡更衣后方可离开。
非一次性物品（胶靴等）和盛放样品的容器用双层袋盛放并胶带封装。可穿回日常的鞋子。
携带出养殖场的袋子需放在车辆内预先铺好的塑料布上。
进入生产区域的人员在指定区域进行沐浴洗澡更衣后方可离开。
接触过样品或潜在污染的车辆进行重点清洗消毒。
在离开可能受到污染的区域之前，清洁和消毒汽车的轮胎和表面。清除所有可见的污垢。不要忘记清理隐藏的区域，如车轮拱、轮胎板和汽车底部。清除所有污垢后，用消毒剂喷洒表面。
处理车内所有垃圾并清理所有污垢( 应妥善处理垃圾)。
用浸有消毒剂的布擦拭方向盘、变速杆、踏板、手闸等。
4. 离场后
如家中没有饲养生猪，可以回家淋浴并彻底清洗头发。将当天所穿衣服浸泡在消毒剂中30 分钟；如果家中饲养生猪，应在其他地方进行清洗。
如果进入了疑似感染场，确诊前不应前往任何饲养生猪的场所。如果确认该场感染了非洲猪瘟，三天内不应前往任何有猪的场所。
再次对汽车内部和外部进行消毒。清除汽车上的所有塑料布，并妥善处理。
5. 消毒剂的选择
非洲猪瘟病毒对热的抵抗力较弱，一般的消毒措施都可以将病毒杀灭，但是在感染病猪组织以及在低温的条件下病毒存活时间可达6 个月以上乃至数年。
最有效的消毒剂是去污剂、次氯酸盐、碱类及戊二醛。
8/1000的氢氧化钠（30 分钟）、2％-3％次氯酸盐氯（30 分钟）、3/1000 福尔马林（30 分钟）、3％邻苯基苯酚（30 分钟）可灭活病毒。
碱类（氢氧化钠、氢氧化钾等）、氯化物和酚化合物适用于建筑物、木质结构、水泥表面、车辆和相关设施设备消毒，酒精和碘化物适用于人员消毒。
不易消毒的设备放置在阳光下暴晒消毒。
（二）临床诊断
非洲猪瘟病猪主要临床表现差异较大，不易识别，但通常有以下几种或全部典型症状，包括高热、呕吐、腹泻或便秘，有的便血，虚弱、难以站立，体
表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮肤呈红色、紫色或蓝色，有的咳嗽、呼吸困难，母猪流产、产死胎或弱胎。出现上述临床症状后，一般2-10 天内死亡。剖检可见内脏多个器官组织出血，脾脏显著肿大，颜色变暗，质地变脆。部分首次发生非洲猪瘟的养殖场，猪群发病非常急，最急性型不表现任何症状而突然死亡，无特临床表现和剖检病变。
1.临床症状
根据其毒力，ASFV分为三个主要类别：高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力毒株。ASF的临床表现形式从特急性（非常急）到无症状（不明显）。目前我国大多数的ASFV感染病例属于急性-亚急性。非洲猪瘟的特征通常是猪突然死亡、死前呈现体温升高。临床表现从感染7天之内急性死亡，到持续几周或几个月的慢性感染不等（图2）。
图2 急性非洲猪瘟的临床症状
注：参考联合国粮食及农业组织(FAO)《动物生产及动物卫生手册》主要临床症状：
□无症状突然死亡；
□发病率、病死率高；
□高热，体温升高40.5 至42℃；
□耳、四肢、腹背部皮肤有出血点、发绀；
□呕吐，腹泻或便秘，粪便带血；
□虚弱、步态僵直，不愿站立等；
□偶见眼、鼻有黏液脓性分泌物。
其他临床症状：
□精神沉郁、食欲下降；
□呼吸困难，湿咳；
□关节疼痛、肿胀；
□妊娠母猪流产、死胎、弱仔。
2. 剖检病变
非洲猪瘟特征性剖检病变通常是可见多脏器出血。
最明显的剖检病变是:
□淋巴结( 特别是胃肠和肾) 增大、水肿以及整个淋巴结出血，形态类似于血块；
□脾脏显著肿大，一般情况下是正常脾的3-6 倍，颜色变暗，质地变脆；
□肾脏表面瘀点( 斑点状出血)（图3）。
剖检变化还可能包括：
□皮下出血；
□心包积液和体腔积水、腹水；
□心脏表面( 心外膜)、膀胱和肾脏( 皮质和肾盂)的出血点；
□肺可能出现充血和瘀点，气管和支气管有泡沫，严重肺泡和间质性肺水肿；
□瘀点、瘀斑( 较大的出血)，胃、小肠和大肠中过量的凝血；
□肝充血和胆囊出血（图4）。
图3 急性非洲猪瘟的常见剖检病变
注：参考联合国粮食及农业组织(FAO)《动物生产及动物卫生手册》
图4 急性非洲猪瘟的多脏器出血性病变
注：参考联合国粮食及农业组织(FAO)《动物生产及动物卫生手册》
3.鉴别诊断
非洲猪瘟的临床表现多样，严重程度也不一样，ASF临床症状与古典猪瘟
（CSF）、猪丹毒症、沙门氏菌、放线杆菌、其他败血症、猪皮炎肾病综合征（PDNS）
的临床症状非常类似，有时候容易混淆（表1）。
表1 非洲猪瘟鉴别诊断
注：参考联合国粮食及农业组织(FAO)《动物生产及动物卫生手册》和中国动物疫病预防控制
中心《非洲猪瘟现场排查手册》
4. 发现疑似病例的情况下应立即采取的行动
发现疑似病例，应立即按照《非洲猪瘟防治技术规范》和《非洲猪瘟疫情应急预案》要求上报疫情（见附件一）。
（三）样品采集、包装与运输
1.采样方法
ASF样品有效而准确采集是实现ASF快速精准检测的非常关键步骤。当疫情暴发(被动监测)时，应针对患病猪、死亡猪及猪舍环境进行采样;而在常规监测时，应对ASFV易感猪群及环境(如出猪台、场区大门等风险较大的地方)进行采样;如果是针对处于精准清除的群体，采样的数量可以适当加大。采样应注意避免交叉污染，并在采集每头猪只后更换一次性手套。触碰猪只、料槽、栏杆后，及时更换一次性手套。采血时，必须做到每采集1头猪只更换1个新的针头，以免造成ASFV传播。提交到诊断实验室的相关样品应有清晰且保存持久的标签，样品质量良好。所有采样后的防护用品焚烧或高压处理。
样品类型：
将每头猪口、鼻拭子收集于同一采样管中，以便提高检测的准确性和减少工作量。拭子装于Eppendorf管内，建议将样品保存于4℃，立刻送检，没有实验条件的应在24小时内送至有资质的实验室。
全血
采血过程中应保持无菌操作。
采血前，先用酒精棉对采血部位进行局部消毒。
采血完毕，进行局部消毒并用干棉球按压止血。
使用含有抗凝血剂（EDTA-紫色盖）的真空采血管从颈静脉、前腔静脉或耳缘静脉抽取全血。
如果动物已经死亡，可立即从心脏中采血。避免使用含肝素的真空采血管（绿色盖子）。
使用未加抗凝剂（红色盖子）的真空采血管从颈静脉、前腔静脉、耳缘静脉采血，或剖检过程收集血液样品。
静置分离后，收集血清。如果血清是红色，这表明样品发生了溶血。通常已经死亡动物的血液样品易发生溶血。
血清样品在分离后可以立即开展检测，如果需要储存，对于抗体检测，储存在-20℃，但是对于病毒检测，最好储存于-80℃。
可采集脾脏、淋巴结、肝脏、扁桃体、心脏、肺和肾脏样品。脾脏和淋巴结的病毒含量最高。
对于死亡时间较长的动物，可采集骨髓样品，也可采集关节内组织液。
建议将样品保持在4℃，尽快提交给实验室。如无法及时送样，可将样品储存在冷库或液氮中。
样品用10%缓冲福尔马林浸泡30分钟以上，病毒可被灭活，可用于PCR 检测。
样品的最小需求量：血清1mL；全血1mL；组织样品10g。
可多点采集养殖场软蜱等媒介和环境拭子，如粪便、泔水、饲料等。
软蜱等媒介样品：钝缘蜱可以用于检测ASFV。有三种收集技术：手动收集、二氧化碳诱捕和真空吸引捕捉。收集后，应让蜱保持存活或直接储存在液氮中，避免DNA降解。
环境样品：以区块为单位，对风险等级进行区域采样。如猪场内所有墙体、地面、设备等表面进行全覆盖采样。
生产区内：包括各区间猪舍内所有区间单元墙体、地面、风机、地沟、设备、水线、料线等。采样应全覆盖包括死角、料槽底部等不易采集到的位置。
生产区外：对可能的风险区域进行采样，包括出猪台、场区大门、料塔、下水道、员工宿舍、储物间、浴室、办公室、餐厅厨房、车辆、水源等所有可
能受到污染的区域。
建议样品4℃以下保存。
2. 样品的记录、保存、包装和运送
为保证准确诊断，必须在适当温度下、以最快速度，将样品仔细包装、做好标记和相关记录，以最快路线送到最近的农业农村部指定的实验室。样品运输必须遵守农业农村部《高致病性动物病原微生物菌(毒)种运输包装规范》等规定。
采样之前必须致电相关实验室，确保遵循正确的样品提交程序，保证所送样品能在第一时间完成检测及储存。
做好样品运输过程中的安全保障工作，避免在运输途中感染其他动物，避免样品被污染。
运送的样品必须附有足够数量的冷却材料（如冰袋），以防变质。
采样同时，应填写采样单。
采样单应用钢笔或签字笔逐项填写（一式三份）。
样品标签和封条应用签字笔填写。
保温容器外封条应用钢笔或签字笔填写。
小塑料离心管上可用记号笔做标记。
应将采样单和病史资料装在塑料包装袋中，并随样品送实验室，每个样品应能对应到来源动物。
样品信息至少应包括以下内容：
畜主姓名和养殖场地址；
养殖场饲养动物品种及数量；
疑似或被感染动物或易感动物种类及数量；
首发病例和继发病例的日期；
感染动物在畜群中的分布情况；
死亡动物数、出现临床症状的动物数量及年龄；
非洲猪瘟检测实验室
非洲猪瘟检测实验室
非洲猪瘟实验室检测能力比对报名表市
非洲猪瘟实验室检测能力比对方案 为进一步做好非洲猪瘟检测工作，在全省开展非洲猪瘟实验室检测能力比对，具体工作由省动物疫病预防与控制中心组织实施。 一、参加比对实验室范围 报名参加非洲猪瘟检测能力比对的实验室。 二、比对项目和试验方法 非洲猪瘟病毒荧光PCR。 三、比对样品、试剂准备和发放 比对项目设置5份盲样，由省动物疫病预防与控制中心准备、分装和编号和发放。 比对试剂由各参加比对的实验室自行准备。 四、盲样发放 省动物疫病预防与控制中心6月15日前准备好盲样，各参加检测能力比对的实验室6月16日派专人持有效身份证明，第一次参加非洲猪瘟检测能力比对的实验室需同时提供实验室证明材料（CMA 证书或CNAS 证书复印件以及检测能力范围一览表），统一领取样品，并务必于12小时内抵达实验室。 五、结果报告与分析
各实验室在收到样品后2日内完成检测工作，并将检测结果填写在非洲猪瘟检测结果报告单，并加盖公章后扫描电子版6月18日16:00前发送至指定邮箱。同时，各实验室向省动物疫病预防与控制中心出具正式检测报告，并通过特快专递邮寄。 省动物疫病预防与控制中心6月23日完成检测结果比对分析，报省畜牧兽医局。 六、结果反馈 比对工作结束后，省畜牧兽医局通报实验室比对结果，并通报承担非洲猪瘟监测的实验室。 七、联系方式 1、样品领取 山东省动物疫病预防与控制中心 联系人：李玉杰 联系电话： 2、报送检测结果地址（邮箱） 山东省动物疫病预防与控制中心 联系人：孙圣福 电话： 邮箱：
非洲猪瘟检测结果报告单 试剂盒厂家及名称： 荧光定量PCR仪型号： 备注：检测结果填写“阳性”或“阴性” 检验人：校核人： 单位盖章
非洲猪瘟检测与诊断技术要点
非洲猪瘟检测与诊断技术要点 中国农业科学院上海兽医研究所 牵头编制 2019年9月
前言 非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率和死亡率可达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。 1921年，ASF最初发现于肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲流行。2018年8月初我国爆发非洲猪瘟首起疫情以来，该疫病已蔓延全国23个省，给我国生猪养殖业和国民经济带来巨大损失。由于ASFV感染机制复杂，目前世界范围内至今尚无有效预防用非洲猪瘟疫苗，因此早期发现、精准检测是控制该病传播和发生的关键。 本文参考了OIE、农业农村部和中国动物卫生与流行病学中心、中国动物疫病预防控制中心的相关文件和技术手册，结合我们的研究成果，从非洲猪瘟早期发现、现场排查、精准检测三个方面的技术要点编写而成，主要面向从事非洲猪瘟现场排查和检测的一线防疫人员，提供了简明实用的相关操作技术与方法，为非洲猪瘟现场排查与检测等相关工作提供参考。
编者： 牵头团队：上海兽医研究所猪呼吸道传染病团队 负责人：马志永 参加人：魏建超等 参加团队：哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队负责人：仇华吉 参加人：罗玉子等 兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病团队 负责人：刘志杰 参加人：林密等 兰牧药研究所中兽医与临床团队 负责人：李建喜 参加人：崔东安
目录 一、概述 (1) 二、早期发现 (3) 三、现场排查 (5) （一）准备工作 (6) 1. 人员准备 (6) 2. 车辆准备 (6) 3. 物品准备（生物安全防护及采样所需物品） (6) （二）进出养殖场要求 (7) 1. 抵达养殖场 (7) 2．穿戴个人防护设备( 在清洁区) (8) 3. 离场前准备 (8) 4. 离场后 (9) 5. 消毒剂的选择 (9) （二）临床诊断 (9) 1.临床症状 (10) 2. 剖检病变 (11) 3. 鉴别诊断 (12) 4. 发现疑似病例的情况下应立即采取的行动 (14) （三）样品采集、包装与运输 (14) 1. 采样方法 (14) 2. 样品的记录、保存、包装和运送 (16) 3. 废弃物处理 (18) 四、实验室诊断与确诊 (18) 1．快速精准检测 (18) 2. 疫情确诊 (18) 附件一：非洲猪瘟防治技术规范 (20) 附件二:国家非洲猪瘟参考实验室、专业实验室和区域实验室名单 (24)
一、非洲猪瘟现场快速检测实验操作规程
一、非洲猪瘟现场快速检测实验操作规程 本规程推荐的检测程序、仪器设备和试剂等可作为非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的一般性指南，用户可根据实验室需求选择仪器设备型号及耗材，优化最佳的检测程序。 1 样品处理 1.1试验材料：待检样品为采集的猪全血，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（缓冲液B1和缓冲液B2）。 1.2 设备与材料：小型离心机，涡旋振荡器，100μl移液器，吸头，1.5ml离心管。1.3 操作步骤 血液混样操作：可将5份猪全血进行混样，每份血样取10μl于离心管后，涡旋振荡混匀，即为混样。 取10μl单样或混样新鲜抗凝全血加入100μl的缓冲液B1中，室温消化3分钟，涡旋混匀3~5次。 向上述混合液中加入100μl的缓冲液B2（恢复至室温并混匀使用），涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为PCR待检核酸，取2μl PCR待检核酸进行PCR反应。如在2小时内检测则PCR待检核酸置于4℃保存，否则置于﹣20oC以下冰箱保存。 2 PCR反应 2.1 试验材料：待检样品为PCR待检核酸，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（PCR反应液、反应阳性对照和阴性对照） 2.2 设备与材料：荧光定量PCR仪，掌式离心机，20μl移液器，10μl移液器，吸头，荧光定量PCR反应管，乳胶手套，口罩。 2.3 操作步骤 扩增试剂准备：每个反应的体积为20μl。根据检测样品数量每个反应管加入18μl PCR反应液。依次取2μl阴性对照、PCR待检核酸、反应阳性对照到PCR反应管中。 PCR反应：加样后，将PCR管置于荧光定量PCR仪内进行如下反应： 1）95oC预变性20秒；2）95℃变性10秒，58℃延伸20秒，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号。 判定结果的有效性：阳性对照应出现特异性扩增曲线且Ct值＜35，阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值。
27.猪瘟防治技术规范
猪瘟防治技术规范 猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。 为及时、有效地预防、控制和扑灭猪瘟，依据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》和《国家突发重大动物疫情应急预案》及有关法律法规，制定本规范。 1 适用范围 本规范规定了猪瘟的诊断、疫情报告、疫情处置、疫情监测、预防措施、控制和消灭标准等。 本规范适用于中华人民共和国境内一切从事猪（含驯养的野猪）的饲养、经营及其产品生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和个人。 2 诊断 依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，确诊需做病原分离与鉴定。 2.1 流行特点 猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均易感。一年四季均可发生。感染猪在发病前即能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。与感染猪直接接触是本病传播的主要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和泔水等传播，人、其它动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。感染和带毒母猪在怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新生仔
猪发病或产生免疫耐受。 2.2 临床症状 2.2.1 本规范规定本病潜伏期为3-10天，隐性感染可长期带毒。 根据临床症状可将本病分为急性、亚急性、慢性和隐性感染四种类型。 2.2.2 典型症状 2.2.2.1 发病急、死亡率高； 2.2.2.2 体温通常升至41℃以上、厌食、畏寒； 2.2.2.3 先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现； 2.2.2.4 腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点，指压不褪色，眼结膜和口腔黏膜可见出血点。 2.3 病理变化 2.3.1 淋巴结水肿、出血，呈现大理石样变； 2.3.2 肾脏呈土黄色，表面可见针尖状出血点； 2.3.3 全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑，脾脏边缘出现梗死灶； 2.3.4 脾不肿大，边缘有暗紫色突出表面的出血性梗死； 2.3.5 慢性猪瘟在回肠末端、盲肠和结肠常见“钮扣状”溃疡。 2.4 实验室诊断 实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。 2.4.1 病原分离与鉴定 2.4.1.1 病原分离、鉴定可用细胞培养法（见附件1）； 2.4.1.2 病原鉴定也可采用猪瘟荧光抗体染色法，细胞浆出现特异性的荧光（见附件2）； 2.4.1.3 兔体交互免疫试验（附件3）；
非洲猪瘟诊断与检测技术要点
非洲猪瘟检测与诊断 技术要点 中国农业科学院上海兽医研究所 牵头编制 2019年9月
前言 非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率和死亡率可达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。 1921年，ASF最初发现于肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲流行。2018年8月初我国爆发非洲猪瘟首起疫情以来，该疫病已蔓延全国23个省，给我国生猪养殖业和国民经济带来巨大损失。由于ASFV感染机制复杂，目前世界范围内至今尚无有效预防用非洲猪瘟疫苗，因此早期发现、精准检测是控制该病传播和发生的关键。 本文参考了OIE关于非洲猪瘟防控的文件、农业农村部发布相关文件和中国动物卫生与流行病学中心、中国动物疫病预防控制中心的相关技术手册，结合我们的研究成果，从非洲猪瘟早期发现、现场排查、精准检测三个方面的技术要点编写而成，主要面向从事非洲猪瘟现场排查和检测的一线防疫人员，提供了简明实用的相关操作技术与方法，为非洲猪瘟现场排查与检测等相关工作提供参考。
编者 牵头团队：上海兽医研究所猪呼吸道传染病团队 负责人：马志永 参加人：魏建超等 参加团队：哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队负责人：仇华吉 参加人：罗玉子等 兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病团队 负责人：刘志杰 参加人：林密等 兰牧药研究所中兽医与临床团队 负责人：李建喜 参加人：崔东安
目录 一、概述 (1) 二、早期发现 (4) 三、现场排查 (5) （一）准备工作 (6) 1.人员准备 (6) 2.车辆准备 (6) 3.物品准备 (6) （二）进出养殖场要求 (7) 1.抵达养殖场 (7) 2.穿戴个人防护设备（在清洁区） (8) 3.离场前准备 (8) 4.离场后 (9) 5.消毒剂的选择 (9) （三）临床诊断 (9) 1.临床症状 (10) 2.剖检病变 (11) 3.鉴别诊断 (12) 4.发现疑似病例的情况下应立即采取的行动 (13) （四）样品采集、包装与运输 (14) 1.采样方法 (14) 2.样品的记录、保存、包装和运送 (15) 3.废弃物处理 (18) 四、实验室诊断与确诊 (19) 1.快速精准检测 (19) 2.疫情确诊 (19) 附件一：非洲猪瘟防治技术规范 (20) 附件二：国家非洲猪瘟参考实验室、专业实验室和区域实验室名单 (24)
非洲猪瘟临床诊断及防控
非洲猪瘟临床诊断及防控 非洲猪瘟是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100%，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。 世界非洲猪瘟发病情况 本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。 2018年8月2日下午17时，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市沈北新区沈北街道（新城子）五五社区发生疑似非洲猪瘟疫情，并于8月3日上午11时确诊。截至8月3日15时，疫点内913头生猪已经全部扑杀和无害化。 病原发病机理 非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和逗病毒科。病毒粒子的直径为175－215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170－190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。 本病毒能从被感染猪之血液、组织液、内脏，及其他排泄物中证实出来，低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周，加热被感染病毒的血液55℃30分或60℃10分钟，病毒将被破坏，许
多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在呈现明显的刺激反应前，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。 症状 自然感染潜伏期5～9天，往往更短，临床实验感染则为2～5天，发病时体温升高至41度，约持续四天，直到死前四十八小时，体温始下降为其特征，同时临床症状直到体温下降才显示出来，故与猪瘟体温升高时症状出现不同，最初三至四日发热期间，猪只之食欲，显出极度脆弱，猪只躺在舍角，强迫赶起要它走动，则显示出极度累弱，尤其後肢更甚，脉搏动快，咳嗽，呼吸快约三分之一，显呼吸困难，浆液或粘液脓性结膜炎，有些毒株会引起带血之下痢，呕吐，血液变化似猪瘟，从三至五个病例中，显示有50%之白血球数减少现象，淋巴球也同样减少，体温升高时发生白血球性贫血，至第四日白血球数便降至40%才不下降，未成熟中性球数增加也可观察到，往往发热後第七天死亡，或症状出现仅一、二天便死亡。 流行病学易感动物 猪与野猪对本病毒都系自然易感性的，各品种及各不同年龄之猪群同样是易感性，梦特哥马利氏等(Montgomery)于1921年曾设法试验白鼠、天竺鼠、兔、猫、犬、山羊、绵羊、牛、马、鸽等动物，都未被感染成功，但是伟力合(Velho)于1956年报告，他曾盲目通过兔
非洲猪瘟自检实验室建设规范
非洲猪瘟自检实验室建设规范 当前，我国部分养殖和屠宰企业自建的检测实验室存在选址布局不合理、检测操作不规范、交叉污染重、检出结果不准确等问题。为规范养殖和屠宰企业检测实验室建设运行，提升非洲猪瘟检测能力，及时有效管控非洲猪瘟发生传播风险，特制定本规范。 1. 选址布局 1.1 养殖场的检测实验室应建在场区之外，屠宰企业的应建 在生产区之外。 1.2 宜为独立建筑物。与其他区域共用建筑物的，应自成一区，设在建筑物一端或一侧。 1.3 与建筑物其他部分相通时，应设可自动关闭的门。 1.4 排污排水便利，便于集中收集和处理。 1.5 根据所使用的检测方法，确定实验室布局。如需提取核酸，至少将其隔成3间，包括样品处理室（含核酸提取）、 试剂准备室（含体系配制）和扩增室。如不需提取核酸，至少将其隔成2间，包括试剂准备室（含体系配制）和扩增室。 1.6 实验室入口处应有明显的生物安全标识。 2. 室内建设 2.1 室内高度
米。2.6净高一般不应低于 2.2 设施与环境要求 2.2.1 实验室门口处设挂衣装置，个人服装与实验室工作服应分开放置。 2.2.2 样品处理室、扩增室应设洗手池，在靠近出口处，宜安装感应水龙头和干手器。 2.2.3 地面应采用无缝的防滑、耐腐蚀材料铺设，易于清洁消毒。 2.2.4 踢脚板应与墙面齐平，并与地面为一整体。 2.2.5墙面、顶棚的材料应光滑防水，易于清洗消毒、耐消毒剂的侵蚀、耐擦洗、不起尘、不开裂。 2.2.6 排出的下水应收集处理。 2.2.7 围护结构表面的所有缝隙应密封。 2.2.8 如果有可开启的窗户，应设置可防蚊虫的纱窗。 2.2.9 实验台应牢固，高低大小适合工作需要且便于操作和清洁。面应防水、耐腐蚀、耐热。 2.2.10 实验室应安装空调设备，能够控制温湿度。 2.2.11 实验室内应保证适当亮度的工作照明，避免反光和强光。 3. 仪器设备 3.1 病原学检测 离心管，转速可达2mL微量移液器、冰箱、离心机（适合．
生猪屠宰企业非洲猪瘟检测实验室建设及生物安全技术要求
生猪屠宰企业非洲猪瘟检测实验室建设及 生物安全技术要求 一、检测实验室建设要求 （一）实验室布局 远离生产区，处于相对封闭区域。实验室面积需满足工作需要，原则上不低于30平方米，至少包括独立的前处理室和检测室。前处理室面积原则上不低于20平方米，检测室原则上不低于10平方米。前处理室应分为样品处理区、配液区等，严格分区操作。 （二）主要仪器设备及耗材配置 1、前处理室主要仪器设备：配置离心机、高压灭菌锅、涡旋振荡器、水浴锅（金属浴）、移液器及其配套吸头（样品处理区和配液区各一套移液器，不能混用）、移动紫外灯，配备冷藏冷冻冰箱（存放检测试剂、检测样品、灭菌后废弃物）、储物柜（存放EP管、PCR管、枪头等耗材）、垃圾桶2个（1个配黑色垃圾袋，用于盛放普通垃圾；1个配黄色废弃物专用垃圾袋，用于盛放废弃物）。 2、检测室仪器设备：荧光定量PCR仪或其他检测设备。 3、实验耗材：采血器（或注射器）、真空采血管（EDTA抗凝剂）、1.5mLEP 管及其管架、PCR八联管（与荧光PCR仪配套）及其管架、剪刀、镊子、搪瓷托盘、酒精灯等。 4、其他器材：实验台、操作椅、试剂架、器皿橱等。 5、个人防护用品：实验服、一次性乳胶手套、一次性口罩、一次性鞋套。 （三）实验室检测人员 屠宰企业应配备专职检测技术人员，检测人员应接受实验室分子生物学检测技术及生物安全相关知识培训，熟悉非洲猪瘟检测要求。 二、检测实验室操作规范 （一）样品采集 生猪屠宰企业应安排专人负责样品采集，并填好采样记录表（见附表1）。样品为生猪抗凝血（5mL，0.5%EDTA抗凝，不能使用肝素钠作为抗凝剂）或全血样品。
（二）样品保存 样品采集后，按要求进行混血，混血待检样品需在60℃下进行30min的灭活处理，在12h内检测的待检样品应在冰箱冷藏（4℃）保存，超过12h不能检测的样品和留样需冷冻保存。留样应至少保存3个月，以备复查。 样品需转运的，应按农业农村部《高致病性动物病原微生物菌（毒）或者样本运输包装规范》要求进行包装，并由专人将样品送至实验室，禁止使用公共交通工具运送。 （三）样品检测 1．严格按照试剂说明书的操作步骤进行检测。 2．采集的血液样品，可按照生猪批准次（车次）或一定的生猪数量进行混样，具体混样数量根据所使用的检测试剂盒的技术指标科学确定。 3．待检血样必须充分混匀，使用经农业农村部批准或中国动物疫病预防控制中心对比符合要求的检测试剂盒进行检测。 4．熟悉操作，缩短检测过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。 5．所有试剂开盖前都应先瞬时离心，避免液体飞溅；若液体不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并清洁桌面。 6．样品处理、配液、扩增严格分区操作，仪器、耗材等严禁交叉混用。 7．加样时严禁反复吹吸。 8．荧光探针应避光保存，反应液现配现用，加入核酸后应尽快上机。 9．不要在荧光定量PCR管盖的采光部位做任何标记。 （四）原始记录 检测完成后应填写并保存相关检测原始记录（见附表2），检测原始记录、PCR 图至少保存2年。 （五）检测报告 根据《关于全面开展生猪屠宰环节非洲猪瘟检测工作有关具体要求的通知》（川动监[2019]5号）要求，屠宰企业检测结果应规范出具《检测报告》（见附表3），载明对应的检疫合格证明编号、检测方法、检测日期、检测结果。检测报告必须经由报告编制人、驻场官方兽医和批准人（场点负责人）签字确认，加盖屠宰企业公
非洲猪瘟防控调研报告
非洲猪瘟防控调研报告 调研报告 2018非洲猪瘟防控调研报告 一、我区生猪养殖基本情况 第一季度全区生猪养殖户数770户，养殖存栏为36039头；其中规模养殖场数13户，存栏6316头，其中能繁母猪存栏2125头，元旦至今规模养殖场生猪出栏6772头；种猪场3户，存栏2924头，其中能繁母猪存栏1084头；全区生猪散养户780户，存栏约3000头；对比2018年第一季度生猪存栏数42161头，养殖量呈下降趋势。产生原因有二：一是非洲猪瘟传染性强、死亡率高（几乎是100%），目前防控形势依然复杂严峻。规模养殖户唯恐波及致全军覆灭，主动减少养殖数量包括淘汰多年经产母猪和仔猪。二是散养户因为环保要求和我市实施的庭院养猪退养弃养政策以及2018年年底生猪收购价格低于成本而减量存栏甚至收摊弃养。但今春由于价格回升，全国生猪存栏减少，政治经济环境、养殖环节、屠宰、检测检疫环节等众多因素共同影响下，猪肉价格上涨已成必然，又有养殖户开始购进仔猪，增加后备母猪养殖数量。2019春节后生猪养殖数量又持续回升至当前数值。 二、非洲猪瘟防控采取的主要措施 1、非洲猪瘟排查。我区根据非洲猪瘟病毒传播途径制作实施方案，多次下发文件安排部署，多方位、多环节进行缜密排
查。养殖环节：屯留区生猪现存栏约3.6万头，2018年8月至今从养殖环节实施全覆盖排查，多次进行拉网式大排查。尤其进入冬春季节对非洲猪瘟、口蹄疫、高致病禽流感等重大动物疫情进行严格细致排查，排查覆盖全区所有畜禽养殖户、无害化处理场所，特别是要对城郊结合部、工矿厂区等地排查力度，不留死角。规模养殖场户实施封闭管理。现阶段，排查已进行51轮次，累计排查生猪养殖场户3万余个次，生猪206万头次。屠宰环节：每日派出2-3名官方兽医对我区唯一生猪定点屠宰场入场排查检疫。未发现异常猪只。泔水猪排查：全区经入户认真排查及设立公开电话举报，共排查出13个泔水猪养殖户，共存栏1521头，均未发现非洲猪瘟可疑情况。现均已退养完毕，且排查中未再排查出泔水猪。饲料排查：排查全区21个生猪养殖场和3个饲料生产企业，5个饲料经营门市部、均未发现经营或使用猪血成份、血浆蛋白粉、肉骨粉等动物源性饲料喂猪。市场猪肉排查：市场监督管理局持续对市场、冷库等销售环节生猪产品一一进行排查，严查来自疫区省市生猪产品。庭院养猪摸底排查：对矿区、人口密集区及两场周围的庭院养猪情况进行排查摸底，全区有866户庭院养猪户存栏28530头生猪，现由各乡镇依据实施方案逐步进行庭院养猪退养并养工作。现阶段退养弃养85户6354头。流行病学调查：对规模猪场深入开展流行病学调查分析，采集样品开展非洲猪瘟疫情筛查，强化基层动物防疫人员对非洲猪瘟的鉴别诊断能力，及时发现和消除风险隐患。
非洲猪瘟疫情应急预案
非洲猪瘟疫情应急预案 1 总则 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，是我国重点防范的外来动物疫病之一。 1.1 编制目的 及时扑灭突发非洲猪瘟疫情，保障生猪养殖业健康发展。 1.2 编制依据 据《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国进出境动植物检疫法》《重大动物疫情应急条例》《国家突发重大动物疫情应急预案》和《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》，制定本预案。 1.3 工作原则 按照属地管理的原则，实行政府统一领导、部门分工负责，切实落实防控工作责任制，联防联控，形成防控合力。 坚持预防为主，贯彻“加强领导、密切配合、依靠科学、依法防治、群防群控、果断处置”的防控方针。按照“早、快、严、小”的要求，及早发现，快速反应，严格处理，减少损失。 1.4 适用范围 本预案适用于我国突发非洲猪瘟疫情的应急处置工作。 2 组织管理 2.1 应急指挥机构 农业部在国务院统一领导下，负责组织、协调全国非洲猪瘟疫情应急管理工作，并根据突发疫情应急处置工作的需要，向国务院提出启动国务院重大动物疫情应急指挥部应急响应建议。 地方各级人民政府兽医主管部门在本级人民政府统一领导下，负责组织、协调本行政区域内非洲猪瘟疫情应急管理工作，并根据突发疫情应急处置需要，向本级人民政府提出启动地方重大动物疫情应急指挥部应急响应建议。 各级人民政府应急指挥部应明确组成部门，各有关部门要加强协调配合，建立健全多部门共同参与的联防联控协作机制。 2.2 职责分工 农业部负责组织实施突发非洲猪瘟疫情应急管理工作，并进行检查、督导；及时发布突发非洲猪瘟疫情信息，并向有关国际组织、国家和地区通报疫情；紧急组织调拨消毒药品等应急防疫物资；提出启动、停止疫情应急控制措施建议；组织对扑杀及补偿等费用和疫情损失的评估。各地兽医部门要积极配合出入境检
农业农村部办公厅关于做好非洲猪瘟实验室检测工作的通知-国家规范性文件
综合法律门户网站 https://www.sodocs.net/doc/0e7673797.html, 法律家·法律法规大全提供最新法律法规、司法解释、地方法规的查询服务。 法律家https://www.sodocs.net/doc/0e7673797.html, 农业农村部办公厅关于做好非洲猪瘟实验室检测工作的通知 各省、自治区、直辖市及计划单列市畜牧兽医（农牧、农业、农业农村）厅（局、委、办），新疆生产建设兵团畜牧兽医局： 为及时发现非洲猪瘟疑似疫情，进一步做好样品检测工作，现就非洲猪瘟实验室检测有关事项补充通知如下。 一、承担检测任务实验室范围 现承担实验室检测任务的各省级动物疫病预防控制机构根据工作需要，并经省级畜牧兽医部门批准，可选择辖区内具有相应设施设备和专业技术人员，管理体系健全，近三年内未发生任何生物安全事故，具有生物安全二级或以上的实验室分担样品检测任务。受委托实验室可为高等院校、各级动物疫病预防控制机构、第三方检测机构等符合条件的实验室。各省级畜牧兽医部门要对受委托实验室的实验活动和生物安全进行督导。各省级动物疫病预防控制机构要组织协调受委托实验室做好样品检测工作，检测结果应由受委托实验室和省级动物疫病预防控制机构共同负责。 二、严格开展实验室活动 各受委托实验室应严格遵守实验室生物安全操作规范。样品检测前，要在生物安全柜中对样品进行处理和灭活。每批样品检测结束后，要对检测过程中产生的废物、废液等进行消毒和无害化处理；并对相关仪器、工作台面、环境进行严格消毒。检测任务完成后，要对所有剩余样品进行高温高压处理，做好样品销毁记录，不得留样。 三、及时报送检测结果 各受委托实验室一旦发现疑似阳性结果，应立即报告所在地省级动物疫病预防控制机构，并反馈送样单位；省级动物疫病预防控制机构应于1小时内以快报形式报告中国动物疫病预防控制中心，并尽快组织将疑似阳性样品送至中国动物卫生与流行病学中心进行确诊。中国动物卫生与流行病学中心确诊完成后，应于1小时内将结果以快报形式报送中国动物疫病预防控制中心，同时反馈送样单位。 四、其他有关要求 各受委托实验室须通过检测能力比对验证后方可开展检测工作，能力比对实施方案由各省级动物疫病预防控制机构制定并实施。样品检测所用引物、阳性对照品和实验室操作程序由中国动物卫生与流行病学中心统一提供。未经省级畜牧兽医部门批准，任何单位和个人不得采集病料。除我部指定的实验室外，任何单位和个人不得擅自保存病料。未经我部批准，任何单位和个人不得分离病毒，不得进行动物感染实验。 农业农村部办公厅 2018年10月25日 来源: https://www.sodocs.net/doc/0e7673797.html,/fg/detail2089909.html
非洲猪瘟诊断规范2020
附件1 非洲猪瘟诊断规范 一、流行病学 （一）传染源 感染非洲猪瘟病毒的家猪、野猪（包括病猪、康复猪和隐性感染猪）和钝缘软蜱等为主要传染源。 （二）传播途径 主要通过接触非洲猪瘟病毒感染猪或非洲猪瘟病毒污染物（餐厨废弃物、饲料、饮水、圈舍、垫草、衣物、用具、车辆等）传播，消化道和呼吸道是最主要的感染途径；也可经钝缘软蜱等媒介昆虫叮咬传播。 （三）易感动物 家猪和欧亚野猪高度易感，无明显的品种、日龄和性别差异。疣猪和薮猪虽可感染，但不表现明显临床症状。 （四）潜伏期 因毒株、宿主和感染途径的不同，潜伏期有所差异，一般为5至19天，最长可达21天。世界动物卫生组织《陆生动物卫生法典》将潜伏期定为15天。 （五）发病率和病死率 不同毒株致病性有所差异，强毒力毒株可导致感染猪在12至14天内100% 死亡，中等毒力毒株造成的病死率一般
为30%至50% ，低毒力毒株仅引起少量猪死亡。 （六）季节性 该病季节性不明显。 二、临床表现 （一）最急性：无明显临床症状突然死亡。 （二）急性：体温可高达42℃，沉郁，厌食，耳、四肢、腹部皮肤有出血点，可视黏膜潮红、发绀。眼、鼻有黏液脓性分泌物；呕吐；便秘，粪便表面有血液和黏液覆盖；腹泻，粪便带血。共济失调或步态僵直，呼吸困难，病程延长则出现其它神经症状。妊娠母猪流产。病死率可达100% 。病程4至10天。 （三）亚急性：症状与急性相同，但病情较轻，病死率较低。体温波动无规律，一般高于40.5℃。仔猪病死率较高。病程5至30天。 （四）慢性：波状热，呼吸困难，湿咳。消瘦或发育迟缓，体弱，毛色暗淡。关节肿胀，皮肤溃疡。死亡率低。病程2至15个月。 三、病理变化 典型的病理变化包括浆膜表面充血、出血，肾脏、肺脏表面有出血点，心内膜和心外膜有大量出血点，胃、肠道黏膜弥漫性出血；胆囊、膀胱出血；肺脏肿大，切面流出泡沫性液体，气管内有血性泡沫样粘液；脾脏肿大，易碎，呈暗
非洲猪瘟实验室诊断技术
万方数据
非洲猪瘟实验室诊断技术 作者：刘峰 作者单位：安徽省金寨县南溪镇畜牧兽医站,安徽,金寨,237361 刊名： 畜牧与饲料科学 英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY AND FEED SCIENCE 年，卷(期)：2010,31(3) 被引用次数：5次 参考文献(4条) 1.王华;王君玮;徐天刚非洲猪瘟流行病学和诊断方法的研究进展[期刊论文]-中国兽医科学 2008(06) 2.李倩;姚淑霞非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测[期刊论文]-安徽农业科学 2008(18) 3.田金宁;张亮;游进猪常见传染病的诊断[期刊论文]-养殖技术顾问 2010(03) 4.马洁莹非洲猪瘟[期刊论文]-国外畜牧学-猪与禽 2009(01) 本文读者也读过(9条) 1.林荣泉非洲猪瘟与猪瘟的鉴定及防控技术[期刊论文]-肉类工业2001(3) 2.赵刚非洲猪瘟流行动态[期刊论文]-现代畜牧兽医2010(5) 3.叶芬.蔡家利.YE Fen.CAI Jia-li猪瘟诊断方法的研究进展[期刊论文]-四川畜牧兽医2010,37(9) 4.朱红非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立[学位论文]2007 5.王君玮.张维.王华.WangJunwei.Zhang Wei.Wang Hua非洲猪瘟病毒分子流行病学进展[期刊论文]-中国动物检疫2010,27(9) 6.杨林.赵德明.熊永忠猪瘟诊断技术的研究进展[期刊论文]-畜牧兽医科技信息2005(3) 7.钟霞.毛华明.邓卫东.Zhong Xia.Mao Huaming.Deng Weidong18S rRNA/rDNA为主的分子生物学技术在瘤胃原虫分类鉴定中的应用[期刊论文]-饲料工业2007,28(22) 8.朱小甫.李晓成.陈德坤.吴旭锦.张志.洪军.张燕霞猪瘟诊断技术研究进展[期刊论文]-中国动物检疫 2007,24(2) 9.杭军猪瘟的流行现状及其原因分析[期刊论文]-畜牧与饲料科学2010,31(8) 引证文献(5条) 1.冯海勇.薛海霞一起猪瘟诊治的体会[期刊论文]-畜牧与饲料科学 2010(8) 2.温肖会.魏文康.黄忠.吕殿红非洲猪瘟的研究进展[期刊论文]-广东农业科学 2010(10) 3.黄福军.李可启非洲猪瘟的研究进展[期刊论文]-中国猪业 2013(6) 4.杨小燕.刘建奎.戴爱玲.李晓华猪瘟与高致病性蓝耳病混合感染的诊断及病原特性分析[期刊论文]-安徽农业科学 2010(34) 5.杭军猪瘟的流行现状及其原因分析[期刊论文]-畜牧与饲料科学 2010(8) 本文链接：https://www.sodocs.net/doc/0e7673797.html,/Periodical_nmgxmkx201003092.aspx
非洲猪瘟的症状及鉴别诊断
上海农业科技折悦：非洲猪瘟的症状及鉴别诊断2019(1)：68-69?养殖业? 非洲猪瘟的症状及鉴别诊断 十斤悦（上海市崇明区堡镇农业综合技术推广服务中心202157) 摘要：非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染猪而引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，目前还没找到对该病有效的疫苗或治疗方法。为提高人们对非洲猪瘟的 认识，现对非洲猪瘟的流行病学、临床表现、剖检变化、鉴别诊断等进行介绍，以供养殖户参考。 关键词：非洲猪瘟；流行病学；临床表现；剖检变化；鉴别诊断；防控策略 中图分类号：S858.28 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染猪而引起的一 种急性、烈性、高度接触性传染病，以高热、网状 内皮系统出血和高死亡率（该病强毒力毒株对生猪 致病率高，致死率达100%)为特征，对染疫国家的 生猪产业和相关国际贸易影响巨大。世界动物卫生 组织将非洲猪瘟列为法定报告动物疫病，对我国来 说，非洲猪瘟是烈性外来疫病，现已将其列为一类 动物疫病。为提高人们对非洲猪瘟的认识，笔者将 对非洲猪瘟的流行病学、临床表现、剖检变化、鉴 别诊断、防控策略等进行介绍，以供养殖户参考。1流行病学 1.1传染源 该病的传染源包括：感染非洲猪瘟病毒的家猪、野猪（包括病猪、康复猪和隐形感染猪）的分泌物 和排泄物，含病死猪组织或被非洲猪瘟病毒污染的 泊■水，含非洲猪瘟病毒的猪肉及其制品，钝缘软蜱。 1.2传播途径 主要通过接触非洲猪瘟病毒感染猪或非洲猪瘟 病毒污染物（泔水、饲料、垫草、车辆等）传播，消 化道感染和呼吸道感染是最主要的感染途径，也可 经钝缘软蜱等昆虫叮咬传播。 1. 3易感动物 家猪和欧亚野猪高度易感，且无明显的品种、日龄和性别差异；疣猪和薮猪虽可感染，但不表现出 明显的临床症状；其它哺乳动物（包括人类）均不 感染非洲猪瘟病毒。 1. 4潜伏期 非洲猪瘟病毒潜伏期因毒株、宿主和感染途径 的不同而有所差异，据世界动物卫生组织《陆生动 物卫生法典》规定，家猪感染非洲猪瘟病毒的潜伏 期为15 d。 收稿日期：2018-09-061. 5发病率和病死率 非洲猪瘟病毒不同毒株的致病性有所差异，强 毒力毒株可致使猪在4?10 d内100%死亡，中等毒 力毒株造成的病死率一般为30%?50%，低毒力毒株 仅引起少量猪死亡。 1. 6季节性 该病发生的季节性不明显。 2临床表现 非洲猪瘟病猪的主要临床表现差异较大，不易 识别，但通常有以下几种典型症状：高热，呕吐，腹 泻或便秘，便血，虚弱、难以站立，体表不同部位 (尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮肤呈红色、紫色或 蓝色，咳嗽，呼吸困难，母猪流产、产死胎或弱胎。临床上还有以下多种表现。 2. 1最急性 无明显临床症状，猪突然死亡。 2.2急性 病猪体温可高达42 °C，沉郁，厌食，耳、四肢、腹部皮肤有出血点，可视黏膜潮红、发绀，目I鼻 有黏液脓性分泌物，呕吐，便秘、粪便表面有血液 和黏液覆盖，或腹泻、粪便带血，共济失调或步态 僵直，呼吸困难，病程延长则会出现其他神经症状；妊娠母猪在妊娠的任何阶段均可出现流产症状；病 死率高达100%;病程一般为4?10 d。 2. 3亚急性 临床症状与急性相同，但病情较轻，病死率较 低。病猪体温低温波动无规律，一般高于40.5 °C，呼吸窘迫、湿咳、关节疼痛、肿胀；仔猪病死率较 高；病程一般为5?30 d，有的病例可康复或转为 慢性病例。 2. 4慢性 病猪出现波状热、呼吸困难、湿咳、消痩或发育 迟缓、体弱、毛色暗淡、关节肿胀、局部皮肤溃烂； -68 -
1 猪瘟诊断技术
猪瘟诊断技术 1 范围 本标准规定了猪瘟（CSF）临床诊断、病理学诊断及实验室诊断方法的技术要求。实验室诊断方法主要包括：兔体交互免疫试验、免疫酶染色试验、病毒分离与鉴定试验、直接免疫荧光抗体试验、荧光抗体病毒中和试验、猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和反转录聚合酶链式反应等诊断技术。 本标准适用于猪瘟的诊断。兔体交互免疫试验，免疫酶染色试验，直接免疫荧光抗体试验，反转录聚合酶链式反应和病毒分离与鉴定试验等五种方法主要用于猪瘟病毒和抗原的诊断，以发现带毒猪和自然感染猪；猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和荧光抗体病毒中和试验主要用于猪瘟抗体的监测和免疫效果评估，其中，单抗酶联免疫吸附试验主要用于猪瘟抗体的鉴别诊断，可区别诊断猪瘟自然感染猪，免疫猪，强、弱毒抗体阳性猪及猪瘟抗体阴性猪。 2 临床及病理学诊断 2.1 临床及病理学诊断的作用 感染CSF的猪临床症状和解剖后肉眼所见的病理变化，因病毒株致病力、感染时间和宿主等因不同而有很大差异，同时田间还存在着无临床症状的猪瘟病毒持续性感染和多种病原混合感染的现象，因此，猪瘟的临床诊断和病理学诊断只能作为综合诊断定性的依据之一，不能作为确诊的根据，特别是那些隐性感染的带毒猪，一般不表现临床症状及肉眼可见的病理变化，所以，猪瘟的确诊应依赖于对CSF病毒及抗原的实验室诊断，才能形成最终的结论。 2.2 临床诊断 猪群中被检猪出现下列临床症状时，可作为综合诊断定性的依椐之一： a）体温在40.5℃以上或间歇性的发热； b）精神萎靡、倦怠，畏寒，食欲不振、厌食、甚至废食，呕吐，步态不稳； c）交替便秘与腹泻，产生带粘液和血丝的粪球，结膜充血、出血或有不正常分泌物； d）鼻盘、嘴唇、耳尖、下颌、四肢、腹下及腹股沟等处出现紫红色斑点或斑块； e）公猪包皮积尿或其他疑似CSF的症状； f）怀孕母猪有流产、死胎、木乃伊等现象或所产仔猪有衰弱、震颤、痉挛、发育不良等现象。 出现上述症状时，猪群作为可疑CSF对待，应全群隔离饲养，并作进一步诊断。
非洲猪瘟的病毒检测
由于非洲猪瘟（ASF）缺乏预防用疫苗，为防止疫病的传播，就需要实施严格的卫生和生物安全控制措施，而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。ASF的诊断是指确诊动物正在感染或者曾经感染过非洲猪瘟病毒（ASFV）。因此，适用的诊断技术包括检测和识别ASFV特异性抗原、DNA或抗体的技术，所获取的检测信息也是控制和根除计划的重要保障。在选择诊断技术时，分析疫病感染期非常重要（图1）。由于感染动物所处的感染期不同，因此在疫情和控制/根除计划中，需要同时检测病毒和抗体以确保准确性。根据报道，ASF的自然感染潜伏期为4～19天。在临床症状出现的两天前，ASF感染动物开始散播大量病毒。病毒散播因所感染的ASFV毒株毒力不同而异。感染后约7～9天血清转阳，抗体阳性可持续终生（见图1）。非洲猪瘟的病毒检测 文│中国动物疫病预防控制中心 病原学检测为阳性（即抗原）则表明，所检测的动物在取样时正在发生感染。而抗体检测阳性则表明感染正在或者已经发生，包括感染后已经恢复的动物（且可能终身保持血清阳性）。 自2015年底以来，东欧血清学流行病学调查数据显示血清学阳性动物的检出率显著增加，特别是在发生疫情的欧盟国家的野猪群体中尤为明显。这些结果表明，ASF感染耐过动物可存活超过一个月并可能出现亚临床感染的病例，就像在伊比利亚半岛、美洲和非洲之前所描述的情况。因此，抗体检测技术对 于实施控制和根除计划所需的完整信息而言是必要的。 一、应用聚合酶链式反应（PCR）检测非洲猪瘟病毒基因组PCR已成功应用于猪样品（血液、器官等）和蜱中ASFV基因组的检测。病毒DNA片段通过PCR扩增获得足以检测的量，从而实现检测。所有经过验证的PCR技术均可以在临床症状出现前实现检测。P C R 能在样品到达实验室数小时内，完成ASF的诊断。PCR是可以代替病毒分离鉴定的一种灵敏、特异、快速的ASFV检测技术。同时，相比于抗原检测技术，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和直接荧光抗体测试（FAT），具有更高的敏感性和特异性。需要注意的是，PCR 的高度敏感性使其容易发生交叉污染，应该采取适当的预防措施来减少和控制污染风险的发生。OIE在《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2016年）中推荐使用的常规和实时荧光PCR得到了长期的充分验证，是常规诊断的重要工具。此外，除了OIE推荐的适用于康复动物ASF基因组检测的实时荧光PCR技术外，其他研究者建立的实时荧光PCR已经证实更为敏感。在这些分子技术中使用的引物和探针多以VP72编码区域作为靶基因设计，该基因片段是ASFV基因组中研究清楚，且高度保守的区域。应用这些PCR技术，即使在灭活或降解的样品中也可检测到已知所有22种p72病毒基因型的多个毒株。对于特急性、急性或亚急性ASF 感染病例，PCR是首选的检测技术。此外，由于PCR检测病毒基因组，即使病毒分离鉴定为阴性的，含有无感染性病毒粒子的样品，也可完成检测，这也使其成为用于检测感染低或中等毒力毒株的重要工具。虽然PCR不能提供病毒感染性的信息，但可以提供定量的信息。 ◎图1 伊比利亚半岛及西半球的欧洲家猪中观察到的血液中病毒和抗体随着时间的变化及与ASFV感染不同阶段的关系（1960—1995年）非洲猪瘟防控专栏 African swine fever prevention and control column 73☆2019年第3期
《山东省非洲猪瘟检测实验室建设与管理办法》
附件 山东省非洲猪瘟检测实验室建设 与管理办法 总则 第一条为进一步做好我省非洲猪瘟检测工作，健全完善政府部门、企业、第三方检测机构相互补充、相互配合的监测体系，加快推进设施设备和技术人员配备，推动建立配套衔接、覆盖全面、高效运行的监测机制，根据《农业农村部办公厅关于做好非洲猪瘟实验室检测工作的通知》（农办牧〔2018〕54号）制定本办法。 第二条本办法所称非洲猪瘟检测实验室包括隶属于省、市、县级畜牧兽医主管部门并承担动物疫病诊断、监测和检测等任务的省、市、县级动物疫病预防控制机构（兽医系统实验室），高等院校、第三方检测机构等符合条件的实验室，屠宰场、种猪场、规模化养猪场、猪源性单一饲料生产企业等非洲猪瘟自检实验室。 第三条除企业非洲猪瘟自检实验室外，其他非洲猪瘟检测实验室均应通过省动物疫病预防与控制中心组织的非洲 猪瘟检测能力比对，并经省畜牧兽医局指定，方可在规定范围内从事非洲猪瘟检测活动。检测能力比对有效期为一年。 第一章非洲猪瘟检测实验室建设要求
第四条省动物疫病预防与控制中心的实验室资质、面积、布局、环境与设施、仪器设备配置、工作人员管理、实验室管理、档案管理等应符合国家相关要求，方可从事非洲猪瘟检测。 第五条市、县级动物疫病预防控制机构（兽医系统实验室）的实验室资质、面积、布局、环境与设施、仪器设备配置、工作人员管理、实验室管理、档案管理等应符合附件1所有要求，方可从事非洲猪瘟检测。 第六条高等院校、第三方检测机构等实验室的实验室资质、面积、布局、环境与设施、仪器设备配置、工作人员管理、实验室管理、档案管理等应符合附件2所有要求，方可从事非洲猪瘟检测。 第七条屠宰场、种猪场、规模化养猪场、猪源性单一饲料生产企业等非洲猪瘟自检实验室的面积、布局、环境与设施、仪器设备配置、工作人员管理、实验室管理、档案管理等应当符合附件3所有要求，方可从事非洲猪瘟检测。 第二章职责分工 第八条省畜牧兽医局负责指定符合条件的实验室开展非洲猪瘟检测活动，并对非洲猪瘟检测实验室进行监督管理；负责制定我省非洲猪瘟监测计划。 第九条省动物疫病预防与控制中心负责组织非洲猪瘟检测能力比对，开展非洲猪瘟检测技术培训，并对非洲猪瘟检测实验室进行技术指导和检测结果核查；负责组织实施全