胰酶的配制

胰酶的配制过程

姓名：李达专业：预防兽医学号：2013022060 导师：汤德元一．胰酶-EDTA的配制

1、专用PBS缓冲液配方：

1000mlPBS: 7.000g NaCl

1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose

0.3700g KCl

0.2g Na2PO4H

3.000g Tris

0.2400g KH2PO4

0.4000g EDTA

超纯水1000ml

所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。

0.0010g 酚红

5ml PS

2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018）2、配制步骤：

1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。

2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。

3）加入5ml双抗（PS）。

4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。

5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。

6）调PH至7.2-7.4。

7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。-20℃保存。

9）不可反复冻存。每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。

3、注意事项：

1）整个分装过程在无菌条件下进行。

2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。低温可防止酶失活。

3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。

4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。

5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。

6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。

二．0.25%胰酶（无EDTA）的配制

1、250ml胰酶配制方法

Tryspin 0.625g

PS 2.5ml

苯酚红0.1g

所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。

2、实验步骤

1）实验之前将所用试剂瓶泡酸12小时自来水清洗至无色后再用超纯水冲洗并进行高压灭菌。

2）按前面要求准确称取所需试剂，在容量瓶中用0.01M PBS定容至250ml。3）调节PH至7.4。

4）将所配制的胰酶在细胞间用0.22um的过滤器过滤并分装。

3、注意事项

1）在溶解、分装和过滤过程中要轻轻混匀，避免产生气泡。否则酶的活性会受到影响。

2）为保持酶的活性，应尽量在低温下操作。

3）胰酶配好后应避免反复冻融。因此在过滤后将其分装到1.5ml离心管中。

三．胶原酶的配制方法

1、50ml体系配方组成

Collagenase（Sigma c5138）100mg

PS 500ul

Hank's平衡培养液49.5ml

2、配制步骤

1）向装有100mg Collagenase的试剂瓶中加入1-2ml配制好的Hank's +PS使胶原酶溶解。反复轻轻颠倒几下，但要注意观察管盖上的粉末是否也充分溶解。2）12000rpm,离心20s，轻轻将其转移到Hank's +PS中。

3）反复洗涤试剂管以保证完全转移。

3、注意事项

1）避免操作过程中产生气泡，防止酶失活。

2）低温操作。

3）避免反复冻融。

胰酶配制

胰酶配制 一、器材与试剂： 干粉型培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。 具体步骤： (1)水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。 (2)PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制）：1、溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2 HPO4 ?H2 O 1.56g，KH2 PO4 0.2g ） 倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 2、移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 (3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1、称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。 2、用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于20℃保存以备使用。

液体配制及实验方法

（一）液体配制 1.完全培养基 DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液） 若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺 2.PBS 1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4 3.胰酶 用之前调节PH值至7.6 4.CaCl2 将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液 每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液（终浓度3μmol/L）用于激活胶原酶的活性 5.双抗 终浓度：青霉素100万U/100ml 链霉素100万U/100ml 青霉素0.6μg为1个单位链霉素 1.2195μg为一个单位 称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml 6.两性霉素B 100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液 每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液，稀释为终浓度2.5μg/ml 7.细胞冻存液 20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS) 8STZ溶液 STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中 称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕. 9油红O 原液：油红O 0.6g溶于异丙醇（99% ）100ml 。 稀释液：油红O 原液20ml ，蒸馏水20ml ，过滤后使用。 10茜素红 称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.

胰酶得配制

查看文章 细胞消化胰酶的配制2008-12-10 12:46适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展细胞培养的实验者 对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin) 配方：100ml PBS,0.25g胰酶 步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O /2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水) 2 称胰酶0.25g 3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜 低速搅拌0.5h冰浴中 4 调PH7.4 5 仍在冰浴中 6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完 tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫， 酶就变性了。低温，防止酶失活 对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%) tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力 问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。急用！多谢！ 答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。 2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。 3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。 4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。 5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。 6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。 7、可配2－3乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。

胰酶的配制

胰酶的配制过程 姓名：李达专业：预防兽医学号：2013022060 导师：汤德元一．胰酶-EDTA的配制 1、专用PBS缓冲液配方： 1000mlPBS: 7.000g NaCl 1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose 0.3700g KCl 0.2g Na2PO4H 3.000g Tris 0.2400g KH2PO4 0.4000g EDTA 超纯水1000ml 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 0.0010g 酚红 5ml PS 2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018）2、配制步骤： 1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。 2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。 3）加入5ml双抗（PS）。 4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。 5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。 6）调PH至7.2-7.4。 7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。 此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。-20℃保存。 9）不可反复冻存。每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。

3、注意事项： 1）整个分装过程在无菌条件下进行。 2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。低温可防止酶失活。 3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。 4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。 5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。 6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。 二．0.25%胰酶（无EDTA）的配制 1、250ml胰酶配制方法 Tryspin 0.625g PS 2.5ml 苯酚红0.1g 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 2、实验步骤 1）实验之前将所用试剂瓶泡酸12小时自来水清洗至无色后再用超纯水冲洗并进行高压灭菌。 2）按前面要求准确称取所需试剂，在容量瓶中用0.01M PBS定容至250ml。3）调节PH至7.4。 4）将所配制的胰酶在细胞间用0.22um的过滤器过滤并分装。 3、注意事项 1）在溶解、分装和过滤过程中要轻轻混匀，避免产生气泡。否则酶的活性会受到影响。 2）为保持酶的活性，应尽量在低温下操作。 3）胰酶配好后应避免反复冻融。因此在过滤后将其分装到1.5ml离心管中。 三．胶原酶的配制方法 1、50ml体系配方组成

胰酶胶原酶的配制

胰酶-EDTA的配制 1、专用PBS缓冲液配方： 1000mlPBS: 7.000g NaCl 1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose 0.3700g KCl 0.2g Na2PO4H 3.000g Tris 0.2400g KH2PO4 0.4000g EDTA 超纯水1000ml 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 0.0010g 酚红 5ml PS 2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018） 2、配制步骤： 1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。 2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。 3）加入5ml双抗（PS）。 4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。 5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。 6）调PH至7.2-7.4。 7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。 此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。-20℃保存。 9）不可反复冻存。每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。

3、注意事项： 1）整个分装过程在无菌条件下进行。 2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。低温可防止酶失活。 3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。 4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。 5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。 6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。 0.25%胰酶（无EDTA）的配制 1、250ml胰酶配制方法 Tryspin 0.625g PS 2.5ml 苯酚红0.1g 所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。 2、实验步骤 1）实验之前将所用试剂瓶泡酸12小时自来水清洗至无色后再用超纯水冲洗并进行高压灭菌。 2）按前面要求准确称取所需试剂，在容量瓶中用0.01M PBS定容至250ml。3）调节PH至7.4。 4）将所配制的胰酶在细胞间用0.22um的过滤器过滤并分装。 3、注意事项 1）在溶解、分装和过滤过程中要轻轻混匀，避免产生气泡。否则酶的活性会受到影响。 2）为保持酶的活性，应尽量在低温下操作。

溶液各种配制

附录：常用试剂配制及应用 一、常用缓冲液、试剂的配制 碳酸盐缓冲液(Carbonate-BicarbonateBuffer) 由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH>9的缓冲液配制（附表1）。 附表1. 0.2mol/L碳酸盐缓冲液（～） 磷酸缓冲液(PhosphateBuffers，PB) 磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa值，所以 用它们配制的缓冲液，pH范围最宽。NaH 2PO4：pKa1＝，pKa2＝；Na 2 HPO4：pKa1 ＝，pKa2＝。 另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸缓冲液的优点为：①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH值变化较小；④离子强度对缓冲液pH影响较小，如L缓冲液稀释10倍其pH变化小于。 磷酸缓冲液的缺点是：①磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些化学反应过程，如对某些酶的催

化活性具有一定程度的抑制作用。 NaH 2PO 4 的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。 Na 2HPO 4 的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。 而pH＝6～8的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH 2PO 4 与Na 2 HPO 4 两种磷 酸盐混合配制（附表2）。 附表2. 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（～） 磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-bufferedsaline,PBS) 磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。 NaCl8g KCl0.2g Na 2HPO 4 1.44g KH 2PO 4 0.24g 在800ml蒸馏水中溶解，用HCl调节溶液的pH值至～加水定容至1L，15psi （1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保存备用。

溶液配制

溶液配制

1.50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量 2.PBS(0.1M，pH 7.4)贮存液配方（10倍浓缩） A.152g NaCl 24g无水NaH2PO4 1600ml水 用NaOH调整pH约6.7 加水至2L 室温保存（至少稳定1个月） 1×溶液pH应当为7.3~7.5.终浓度为130mmol/L NaCl和 10mmol/L磷酸钠 B.NaCl 80g Na2HPO4.12H2O 32.3g NaH2PO4.2H2O 4.5g 加蒸馏水至1000ml C .NaCl 80g Na2HPO4.2H2O 11.5g KH2PO4 2g KCl 2g 加蒸馏水至1000ml 贮存液室温下保存一个月 3.3 M 醋酸钠组份浓度3 M 醋酸钠（pH5.2）,配制量100mL A.配置方法 a. 称取40.8gNaAc?3H2O 置于100～ 200mL 烧杯中，加入约40mL 的去离子 水搅拌溶解。 b. 加入冰乙酸调节pH 值至5.2。 c. 加入去离子水将溶液定容至100mL。 d. 高温高压灭菌后，室温保存。 B. 配置方法:取408g三水合乙酸钠（NaC2H3O2）溶于800ml 水，用3mol/乙酸调至Ph4.8、5.0或5.2（按要求），

加水至1L，高压灭菌。 4.乙酸钾（5mol/L） 5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸（！）11.5 ml 水28.5 ml 所得溶液的钾的浓度为3 mol/L，乙酸浓度为5 mol/L。室温保存。 5. HEPES溶液 A.1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH 调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。 B.500ml 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock solution的配制 119.15 g HEPES 溶解在400ml蒸馏水中，加0.5~1M 的NaOH水溶液调节至少所需pH（HEPES的有效pH 范围是6.8~8.2），然后用蒸馏水定容至500ml，于4摄氏度保存。 C.加少量盐的HEPES Buffer配方（500ml） HEPES 6.5g、NaCl 8.0g、Na2HPO4.7H2O 0.198g、用0.5M NaOH 水溶液调节pH值，最后定容。 D.2×HEPES缓冲盐溶液的配制 将1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucan or dextran)和1g HEPES溶解在90ml的蒸馏水，用0.5M NaOH调节至所需pH值，再用蒸馏水定容至100ml即可 E.HEPES缓冲液，不含（Ca,Mg）(HCMF),PH7.4的配置： 8g NaCl （终浓度0.137mmol/L） 0.4g NaCl （终浓度5.4mmol/L） 0.12g Na2HPO4 （终浓度0.347mmol/L） 1.0g葡萄糖 2.38g N-2羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES,；终浓度10mmol/L） 加水至1L 用孔径0.45μm的滤器过滤，去除所有杂质 4℃可储存数月 F.HEPES缓冲液 1L HCMF 1ml 1mol/L CaCl2

胰酶的配制

胰酶的配制过程 姓名：李达 专业：预防兽医 学号： 2013022060 导师： 汤德元 NaCl Glucose H 2O 或 I.OOOg Glucose KCl Na 2PO 4H Tris KH 2PO 4 EDTA 1OOOml 所有试剂全部为细胞培养专用 sigma 试剂 O.OO1Og 酚红 5ml PS 2.5g 胰酶（ HyClone 胰蛋白酶 1:25O SH3O848.O18） 2、配制步 骤： 1 ）所用容器先泡酸 1 2 小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净， 再用超纯水 洗三遍，最后高压灭菌，烘干。 2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。 3） 加入 5ml 双抗（ PS ）。 4） 以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至 1OOOml 。 5） 转移到1L 的试剂瓶中，加入酚红（O.OOIOg ）。 6） 调 PH 至 7.2-7.4。 7） 低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。 8） 在细胞间里用0.22um 的滤膜过滤，分装入灭菌的 50ml 或1.5ml 离心管中。 此过 程避免产生气泡，否则将损失酶活性。-2O C 保存。 9） 不可反复冻存。每次解冻后4 C 保存，并在短期内用完。 一．胰酶 -EDTA 的配制 1、专用 PBS 缓冲液配方： 1000mlPBS: 7.000g 1.100g 0.3700g 0.2g 3.000g 0.2400g 0.4000g 超纯水

3、注意事项： 1）整个分装过程在无菌条件下进行。 2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。低温可防止酶失活。 3）加入的 EDTA 可以络合细胞外基质中的 Ca 2+ ，增加消化效力。 4）在调节 PH 时一定要注意保护探头，防止损伤电极。 5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。 50ml 离心管装 45ml 左右， 1.5ml 离心管装 1.4ml 左右。 6）分装后的胰酶尽快转移到-20C 冰箱中冻存。 二．0.25%胰酶（无 EDTA ）的配制 1、250ml 胰酶配制方法 2.5ml 苯酚红 所有试剂全部为细胞培养专用 sigma 试剂 2、实验步骤 1） 实验之前将所用试剂瓶泡酸 12小时自来水清洗至无色后再用超纯水冲洗并进 行 高压灭菌。 2） 按前面要求准确称取所需试剂，在容量瓶中用 0.01M PBS 定容至250ml 。 3） 调节PH 至7.4。 4） 将所配制的胰酶在细胞间用0.22um 的过滤器过滤并分装。 3、注意事项 1） 在溶解、分装和过滤过程中要轻轻混匀，避免产生气泡。否则酶的活性会受 到影 响。 2） 为保持酶的活性，应尽量在低温下操作。 3） 胰酶配好后应避免反复冻融。因此在过滤后将其分装到 1.5ml 离心管中。 三．胶原酶的配制方法 1 、50ml 体系配方组成 Tryspin 0.625g PS 0.1g

胰酶、EDTA的使用及注意事项

胰酶(ｐaｎｃｒeaｔｉn）就是一种自猪胰中提取得多种酶得混合物,主要为胰蛋白酶(将蛋白质消化成蛋白胨)、胰淀粉酶（将淀粉消化成糖)与胰脂肪酶(将脂肪消化成甘油与脂肪酸）。其通过在特定位置上降解蛋白,使细胞间结合处蛋白降解,这时细胞由于自身内部细胞骨架得张力作用下成为球形,从而使细胞分开。 不同得组织或者细胞对胰酶得作用反应不一样。胰酶分散细胞得活性还与其浓度、温度与作用时间有关，在pＨ为8、０、温度为37℃时,胰酶溶液得作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度与时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Cａ２+、Mg２＋与血清、蛋白质克降低胰酶得活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2＋、Ｍｇ2+得BSＳ，如：D-Hａnｋs液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞得作用。 胰酶本身就就是消化蛋白得,而细胞膜又富含各种膜蛋白，消化过头会对细胞造成损伤得。 细胞之间就是通过ＣＡM(细胞粘性分子)相连得,而很多粘性分子只有在有+2价金属离子，如Ca２+,Mｇ2+,得存在下才能行使这种功能。在胰酶中加EDTA得作用就是熬合这些二价离子,使细胞被消化成单细胞形态。 EDTA就是乙二胺四乙酸，一种金属螯合剂。一般与胰蛋白酶配合使用。原因在于,钙,镁等金属离子会降低胰酶活力，故在使用胰酶消化液时要配合加入ＥＤTA。它可以螯合这些离子，消除对胰酶得抑

制。 ED TA用得非常多,一般浓度在0、０2%左右。作用于细胞与间质,对细胞间也有一定作用。注意,它能显著影响pＨ值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此,配制时应调节好酸碱度。它不能被中与。因此,消化下来得细胞要拿ＰBS洗一遍。 胰酶 这就是用得最多得,常用浓度在０、25%。作用时间根据细胞种类、作用温度、作用pｈ等因素而变化很大,从几分钟到几十分钟不等。0、25％得胰酶作用于单层贴壁得细胞,在3７度条件下，一般消化１－5分钟就足够了。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁离子得平衡液,否则影响活性。终止就是用血清蛋白,血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂。保存于-20度。 胶原酶。这种方法比较少,一般就是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温与,对细胞损伤较小,价格也较贵,不易保存,使用期限短,中止同样就是用血清蛋白。 胰酶使用注意 1.在使用胰酶细胞消化液得过程中要特别注意避免消化液被细菌、支原体污染。? 2.胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,过长会损伤细胞,导致细胞铺板后生长状况较差。 贴壁细胞得消化?1.吸去培养液,用无菌得PBＳ、Haｎks液或无血清

试剂配制

1xHBS Nacl 8.76g ddw 900ml 1M HEPES 20ml 用NaoH 调PH7.4 定容至1L 0.22um过滤，4度保存 1xPBS Nacl 8.0g Kcl 0.2g Na2HPO4·7H2O 2.16g /Na2HPO4·12H2O 3.4785g KH2PO4 0.2g ddw 定容至1L PH7.4 高压灭菌 RNase配制 RNase 0.1g 加33ul 3M NaAc 再加ddw至9ml，100°C 15min，冷却至室温，再加1M Tris-Hcl（PH7.4）1ml，分装后-20°C保存 细胞消化胰酶的配制（TE Trypsin EDTA ）0.25% Trypsin 0.02% EDTA 100mlPBS 高压灭菌后，趁热加入0.02g EDTA，溶解后，调PH 7.4 ，放在4度冷却，再称取胰酶0.25g加入，用转子溶解混匀，0.22ul过滤 考马斯亮蓝染色液配制（500ml） 甲醇Methenol 225 ml 乙酸Acetic acid 50ml ddw 225ml R-250 1g ，棕色瓶子避光保存 考马斯亮蓝脱色液配制 甲醇Methenol 225 ml 乙酸Acetic acid 50ml ddw 225ml 5%BSA 5gAlbumin Bov（BSA）用TBST定容至100ml 20xTBST配制 TrisBase 48.4g Nacl 160g 20%Tween 20ml 浓Hcl 12M 23.75ml 调PH 7.6 ddw至1L RIPA细胞裂解液 EGTA 1mM ，Na2EDTA 1mM，TrisHCL 25mM,Nacl 150mM，1% NP-40，1% Sodium deoxycholate（脱氧胆酸钠）ddw至1L 还可以加入2.5mM Sodium Pyrophosphate （焦磷酸钠）， 1mM b-glycerophisphate （b磷酸甘油），1mM Na3VO4，1ug/ml Leuptin 1% NP-40 (去垢剂)，0.1% SDS (去垢剂)，2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)，2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)，1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂) 1.5 mM EDTA ( 蛋白酶抑制剂)，1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂) PMSF（苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L(100μg/ml) Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/L(0.7μg/ml) Leupeptin（亮抑制肽）0.5mg/ml Aprotinin（抑蛋白酶肽）0.3μmol/L(1μg /ml)

胰酶

胰酶使用注意及贴壁细胞的消化 1．在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。2．胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。 贴壁细胞的消化： 1．吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清 2．加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同） 3．显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。 4．此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’ 平衡盐溶液配制成0.25%溶液。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。 如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。

1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。 酶消化法。 1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了（根据姨酶效率不同具体把握）。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。 2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。 二、离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，最好要用无酶消化法。 1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要拿PBS洗一遍。 2、商品化的无酶消化液。细胞无酶消化液不含蛋白消化酶，但能可使贴壁细胞与培养瓶皿表面脱离而达到分离细胞目的，特点是1.避免蛋白酶过度消化细胞及降解样品中的目的蛋白，2.收集细胞用于Western Blot，避免目的蛋白降解，3.分离成单细胞悬液的能力确实比较强。

溶液各种配制

附录：常用试剂配制及应用 一、常用缓冲液、试剂的配制 碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer) 由于碳酸盐pH 值偏碱，因此，常用于pH>9的缓冲液配制（附表1）。 附表1. 0.2 mol/L 碳酸盐缓冲液（～） 磷酸缓冲液(Phosphate Buffers ，PB) 磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa 值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。NaH 2PO4：pKa1＝，pKa2＝； Na 2HPO4：pKa1＝，pKa2＝。 另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS ）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS 会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸缓冲液的优点为：①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH 缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH 值变化较小；④离子强度对缓冲液pH 影响较

小，如L缓冲液稀释10倍其pH变化小于。 磷酸缓冲液的缺点是：①磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些生物化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。 NaH 2PO 4 的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。 Na 2HPO 4 的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。 而pH＝6～8的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH 2PO 4 与Na 2 HPO 4 两种磷 酸盐混合配制（附表2）。 附表2. 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（～） 磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS) 磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，

培养基及胰酶的配制

培养基及胰酶的配制 姓名：邓燕玲 学号：201011202912 组别：周二下午第六组 专业：生物科学 指导老师：张伟 同组同学姓名：张丽华、刘丹、郭靖

摘要： 实验目的 实验原理 实验步骤 一、培养基的配制 本实验配制的培养基为Dulbecco's Modified Eagle Media，简称DMEM。本实验用的合成培养基的配方为：high glucose, with L-glutamine, with pyridoxine hydrochloride, without sodium pyruvate, without sodium bicarbonate。 1.加入培养基 全班请一位同学将3包DMEM合成培养基加入3000ml三蒸水中，每包含量为1.2g，共3.6g，用磁力搅拌器搅拌大约45min。同时，再请另一位同学将剩下的1包DMEM合成培养基加入1000ml的三蒸水中，也用磁力搅拌器搅拌大约45分钟。 2.调PH值 全班请两位同学取适量NaHCO3，将橙红色的上述溶液调至樱桃红。 3.过滤 用大滤器将DMEM合成培养液过滤至小瓶中，每瓶85—95ml，每人一瓶，贴好标签，放在4°C冰箱中保存。 二、胰酶的配制 1.研磨 8人为一组，称取胰酶0.5g，在超净台中，将胰酶放入研钵中并加入少量D-Hanks液研磨，每人研磨200次，轮流研磨，直至胰酶变成糊粉状的冰激凌样。 2.转移 向研钵中先加入几毫升D-Hanks液，使胰酶溶解于其中，然后用加样枪将其转移到灭好菌的三角瓶中，不断用D-Hanks液冲洗研钵，使胰酶完全转移到三角瓶中，所用D-Hanks 液的总体积约为200ml。 3.加EDTA 在胰酶溶液中加入EDTA。 4.调PH值 用NaHCO3将胰酶溶液的PH值调至8.0，用PH试纸检测。在磁力搅拌器下搅拌至DETA 完全溶解。 5.过滤

几种溶液的配制方法

几种溶液(PBS、TBS、Citrate buffer、Trypsin、Pepsin、AEC、Blotto A)的配制方法 1、PBS: 取 ZLI-9061 PBS 溶于 1000ml 的蒸馏水中，混匀，测 pH 值应在 7.2~7.4 之间，若偏离此范围，请用 0.1N 的 HCL 或 NaOH 调整。 2、TBS： 2.1 Tris 缓冲液配方：（0.5 M pH7.6） Tris（三羟甲基氨基甲烷） 60.57g 1N HCL 约 420ml 双蒸水加至 1000ml Tris 缓冲液配制方法： 先以少量双蒸水（300~500ml）溶解 Tris，加入 HCl 后，用 HCl（1N）或 NaOH（1N） 将 pH 调至 7.6，最后双蒸水加至 1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。 2.2 TBS 配方： Tris-HCI 缓冲液（0.5M pH7.6） 100ml NaCI 8.5~9g (0.15mol/L) 双蒸水加至 1000ml TBS 配制方法： 先以少量双蒸水溶解 NaCl，再加入 Tris-HCl 缓冲液，最后加双蒸水至 1000ml，充分摇匀。 3、枸橼酸盐缓冲液（Citrate buffer）： 3.1 储存液： A. 0.1M 枸橼酸溶液：称取21.01g 枸橼酸（C6H8O7·H20）溶于 1000ml 蒸馏水中。 B. 0.1M 枸橼酸钠溶液：称取29.41g 枸橼酸钠（C6H5Na3O7·2H20）溶于 1000ml 蒸馏水中。 3.2 工作液： 取 9ml A 液和 41ml B 液加入 450ml 蒸馏水中，溶液 pH 值应为6.0±0.1 4、胰酶（Trypsin）： 4.1 ZLI-9011 胰蛋白酶消化液： 常用浓度为 0.125%，即使用前将一滴试剂 1 胰酶溶液和三滴试剂 2 胰酶稀释液均匀混合（1:3稀释），则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从 0.05%（1:10 稀释）至 0.25%（1:1 稀释）。 4.2 ZLI-9010 胰蛋白酶： 取 0.05g 或 0.1g 胰蛋白酶加入到 100ml 0.05%或0.1% pH7.8 的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。 5、胃酶（Pepsin）： 4%胃蛋白酶，用 0.1mol/L HCL 配制。 6、DAB：6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit： 使用前只需将试剂盒提供的 A、B、C 三种试剂各一滴加至 1ml 双蒸水中，即可获得 1ml DAB工作液，简单易用。 6.1 ZLI-9030 DAB： 6mgDAB 溶于 10mlTBS（0.05M pH7.6），再加入0.1ml 浓度为 3％的 H2O2，过滤掉沉淀物，即可。7、AEC： 4mg AEC 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中，加入 14ml 浓度为 0.1M 的醋酸缓冲液（pH5.2），然后加入0.15ml 3%H2O2，过滤掉沉淀物。 8、RIPA： 1×PBS，1%NP 40，0.5 sodium deoxycholate，0.1% SDS（此液体可长期保存）。以下抑制剂以储存液方式保存，临用前加入 RIPA 中。 8.1 10mg/ml PMSF 异丙醇溶液（用量为 10m l/ml）8.2 Aprotinin（Sigma 产品，用量为 30m l/ml）8.3 1000mM sodium orthovanadate 冷冻液 （用量为 10m l/ml） 9、Blotto A： 常规使用1×PBS，5% milk，0.05% Tween 20。 10、Blotto B： 与 Phosphotyrosine 抗体共用，1×PBS，1% milk，0.05% Tween 20。部分实验中 milk 可完全去除，但可能引起背景增高。

各种液体配制

细胞培养试剂配制：（粗体字部分为我们需要配制的） 一．PBS（ph≈7.0） a.称取：氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 磷酸氢二钠1.56g或十二水磷酸氢二钠 2.9g(实验室所用) 磷酸二氢钾0.2g b.超纯水定容1000m L→1000 mL分装→高压灭菌→4℃保存 注：需1000 m L烧杯一个、10个100m L试剂瓶、1000m L量筒一个 二．RPMI1640(PH7.52) a.1640培养基粉一袋 碳酸氢钠2g 2mmoL谷氨酰胺C5H10N2O3：0.2923 g 10mmoL羟乙基呱嗪乙硫磺酸（HEPES）；2.383 g P.S :100IU/mL b. 超纯水定容1000mL→滤器过滤分装→-20℃保存 注：需留样观察 1000m L烧杯一个、12个100m L试剂瓶、滤器3个、6个10 m L试剂瓶50m L量筒一个 三．P.S: a.青霉素（80万单位） 链霉素（100万单位） b.超纯水（注：需高压灭菌）定容100mL→分装→－20℃保存 注：1个100m L试剂瓶10个10 m L试剂瓶 四．0.25﹪胰蛋白酶(TV)：(PH 7.37) a.胰酶 2.5 g EDTA 1g 1000 mL PBS称取：氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 磷酸氢二钠1.56g或十二水磷酸氢二钠 3.49g 磷酸二氢钾0.2g b.加入适量碳酸氢钠（约2.5g）→4℃过夜→滤器过滤分装→－20℃保存 注：留样观察 五．细胞冻存液100mL： a. RPMI1640培养液60mL 小牛血清30mL DMSO 10mL b. －20℃保存 注：DMSO在使用前需高压灭菌 需2个100m L试剂瓶、 六．加血清P.S的RPMI1640100mL： 小牛血清15mL P.S 1.5 mL RPMI1640 83.5 mL（已配好85ml） 七1000mLDMEM(ph7.42)

细胞培养用液的配制

实验3 、细胞培养用液的配制 【实验目的】 1. 掌握DMEM培养基、胰酶的配制 2. 学习针头滤器的使用方法 【实验原理】 一．细胞培养的基本条件 1. 气体环境 气体是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生能量和合成各种成分。二氧化碳主要维持培养基的pH，并作为碳源。一般用5%的空气和5%CO2来提供动物细胞的气体生长环境。氧分压过大，不利于细胞生长。植物组织或细胞一般不需要额外提供CO2。 2. pH环境 细胞生长的pH环境为：7.2-7.4，不同细胞有所差异。一般细胞耐酸性比耐碱性大些。CO2对培养基pH的影响： CO2是细胞的代谢产物， CO2的释放必然会影响培养基的pH。 CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3- 所以，培养基中要加一些缓冲剂，以保持 pH的稳定，如 NaHCO3 、HEPES等 3. 糖类 葡萄糖------细胞的主要营养物质，为生命活动提供能量 糖类在生物体内的功能不仅仅是提供能量，与蛋白质和脂类共同构过程结构材料和生物活性物质。 体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基中都以葡萄糖作为能源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡萄糖浓度有所不同。植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。 4.氨基酸 所有细胞多需要以下12种氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸另外所有细胞都需要谷氨酰胺，其具有特殊作用—促进氨基酸进入细胞膜，参与核酸合成，也是能源和碳源。5.维生素 在细胞代谢中起调节作用，虽然所需甚微，但为机体正常代谢不可缺少。 6.促生长因子 培养基中除上述营养成分外，还需要促细胞生长因子，已知有许多激素具有促细胞增殖作用。 血清是提供促细胞生长因子和其他细胞所需物质的来源。 二．天然培养基与合成培养基 1.天然培养基

实验室常用溶液配方

常用溶液配方 （细胞培养）PBS配制 一、PBS配方 配1L 25倍PBS NaCl 200g Na2HPO4-2H2O 36g 最难溶最后加或Na2HPO4-12H2O 72.4g NaH2PO4-2H2O 6.5g 或NaH2PO4 5g 搅拌，1000ml定容，调PH值至7.2—7.4 （细胞培养）1倍PBS配方 NaCl 8.0g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g 或者Na2HPO4-12H2O 3.57g KH2PO4 0.24g 加水定容至1L，调PH值7.2-7.4 （细胞培养）10倍PBS配方 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g 或者Na2HPO4-12H2O 35.7g KH2PO4 2.4g （组化用）PBS配方 配1L 10 倍PBS NaHPO4 10.9g 或Na2HPO4-12H2O 27.50g NaCl 90g NaH2PO4 3.2g 或NaH2PO4-2H2O 4.16g 搅拌，1000ml定容，调PH至7.2，分装，常温保存 配1倍PBS（0.01PBS） 1.取50ml 10倍PBS，倒入容量瓶 2.定容至500ml，摇匀，分装 二、胰酶的配制： 0.25%胰酶 1倍PBS 1000ml 胰酶粉（trypsin）2.5g EDTA 0.4g 搅拌后4摄氏度过夜，然后用NaOH调PH值至7.2-7.4；用0.22um滤器（绿色滤器）过滤分装保存。

三、培养基配制 L-DMEM配制 1L培养液： L-DMEM 10g NaHCO3 2.2g 双抗1%（11ml） 胎牛血清110ml 注：国产胎牛血清需要56℃，30min灭活 加完混合后，用0.22um的滤器过滤除菌，4摄氏度保存。 低糖冻存液的保存 冻存液： L—DMEM：血清：DMSO=6：3：1 注：（DMSO要缓慢加入，以防散热不均，下面要垫上冰块，助散热。 配好后用0.22微米滤器过滤，分装，4℃保存 1640培养液配制 1L体系： 1640干粉10.3g/L NaHCO3 2g 双抗1% 100倍谷氨酰胺10ml β-巯基乙醇3.5 uL 胎牛血清10%（灭活） 0.22微米滤器过滤，4℃保存。

0.25%胰酶-EDTA的配制

0.25%胰酶-EDTA的配制 细胞消化胰酶的配制 对一般细胞 0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin) 配方：100ml PBS,0.25g胰酶 步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O /2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水) 2 称胰酶0.25g 3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜 低速搅拌0.5h冰浴中 4 调PH7.4 5 仍在冰浴中 6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完 tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫， 酶就变性了。低温，防止酶失活 对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%) tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力 问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。急用！多谢！ 答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。 2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA 并不是必须的，容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。 3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。 4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。 5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。 6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。