标准革兰氏染色液

标准革兰氏染色液

简介：

革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。

Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。

组成：

自备材料：

1、 接种环或挑取细菌的其他工具

2、 酒精灯

3、 载玻片

4、 光学显微镜

操作步骤(仅供参考)：

1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与

的水混合均匀，涂成一薄层。

编号 名称

DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml

100ml

250ml 500ml

RT 避光

使用说明书

1份

2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。

3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动，温度不宜过

高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。

4、初染：滴加结晶紫染色液染色，清水冲洗去染色液。

5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置，水洗。

6、脱色：滴加脱色液，摇动，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，

终止反应。

7、复染：滴加沙黄染色液染色，水洗。

8、干燥。镜检：置油镜观察。

染色结果：

革兰氏阳性菌蓝色至紫色

革兰氏阴性菌红色

注意事项：

1、涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。

2、取细菌时，应注意自我防护，拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将

接种环在火焰上烧灼灭菌。

3、加热固定涂片时，应注意玻片勿太靠近火焰，一般要求玻片温度不超过60℃，以玻片

背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。

4、革兰氏染色的关键在于严格掌握脱色程度，脱色时间应根据经验判断。脱色过度，阳性

菌可被误染为阴性菌；脱色不够，阴性菌可被误染为阳性菌。

5、待检细菌培养时间会影响染色，阳性菌培养时间过长或已死亡或细菌溶解，常呈阴性。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

相关：

编号名称

DM0007 瑞氏-姬姆萨复合染色液

PS0013 RIPA裂解液(强)

TC1243 甘油三脂(TG)检测试剂盒(单试剂GPO-PAP比色法)

标准菌种确认标准操作规程完整

一目的 建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 二围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。 1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.1. 2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.1. 2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要容

1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 1.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 1.3.1 大肠埃希菌的确认 1.3.1.1 菌落形态 1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。 1.3.1.2 革兰染色、镜检 1.3.1. 2.1 革兰染色

PH1237 标准革兰氏染色液实验与操作方法

PH1237|标准革兰氏染色液 Standard Gramˊs Stain Catalog No：PH1237Size：?4×100mL|?4×250mL Store at RT 简介 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。 细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。 红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组份 名称4×100ml4×250ml Storage 试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光 试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光 试剂(C):脱色液100ml250ml RT 试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光 自备材料 1、接种环或挑取细菌的其他工具 2、酒精灯 3、载玻片 4、光学显微镜 操作步骤 (仅供参考)： 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。 2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每次1s，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、初染：滴加结晶紫染色液染色1~2min，清水冲洗去染色液。 5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置1~2min，水洗。 6、脱色：滴加脱色液，摇动10～30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应。

菌种的确认标准操作规程

1．目的 建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 2．依据 《中国药典》2010版二部 3．范围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 4．责任 质量管理部，质量控制实验室 5．内容 5.1试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 5.1.1标准菌株 5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 5.1.2工作菌株 5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌

株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 5.2菌种确认试验的主要内容 5.2.1菌种的纯度确认 5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2试验内容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2菌种的特性确认 5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 5.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 5.3.1大肠埃希菌的确认 5.3.1.1菌落形态 5.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 5.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

革兰氏染色法的步骤

革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。

革兰氏染色液配制

革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。 2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。

（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项： 1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。 2．玻片通过火焰温度不能太高。 3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。 4．碘液变透明，则不能使用。 5.水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。 革兰氏染色液如果用量少，买现成的比较话算，如果用量大，自己配起来也溶液，就是试剂种类多了点。其配制方法如下： (1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。 (2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。 (3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。 (4)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。

常用染色液配方

实验室常用染色液配方 1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液 A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升 B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。 2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升 B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升 将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。将两者混合即成。 3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升 B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升 将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。两液混合即成。 4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升 先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。 5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升 6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。 7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。 8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升 9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.0 10、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。 11动物组织石蜡切片染色方法 苏木精-伊红(HE)染色：二甲苯Ⅰ, Ⅱ各10 min，依次进入无水乙醇、950 mL/L, 900 mL/L, 800 mL/L及700 mL/L的酒精各5 min，蒸馏水洗；入苏木精染液10 min，盐酸酒精分色4 s，自来水洗10 min；依次入700 mL/L, 800 mL/L及900 mL/L酒精各5 min，入伊红染液染色 10 min；入950 mL/L及无水乙醇Ⅰ, Ⅱ各5 min, 以二甲苯透明，中性树脂封片. 一、常用染色液的配制 ⒈碘-碘化钾（I2-KI）溶液能将淀粉染成蓝紫色，蛋白质染成黄色，也是植物组织化学测定的重要试剂。 配方：碘化钾2g ；蒸馏水300ml ；碘1g 先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300mL，保存在棕色玻璃瓶内。用时可将其稀释2-10倍，这样染色不致过深，效果更佳。 ⒉苏丹Ⅲ（sudanⅢ或Ⅳ）能使木栓化、角质化的细胞壁及脂肪、挥发油、树脂等染成红色或淡红色，是著名的脂肪染色剂。 配方：（1）苏丹III或苏丹Ⅳ干粉0.1g ；95％酒精10ml ；过滤后再加入10ml甘油（2）先将0.1g苏丹III或IV溶解在50ml丙酮中，再加入70%酒精50ml。 （3）苏丹III 70%乙醇的饱和溶液。 ⒊1％醋酸洋红（aceto carmine）酸性染料，适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。

革兰氏染色操作规程

革兰氏染色操作规程
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰 氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 1.原理 该染色法所以能将细菌分为 G+菌和 G—菌， 是由这两类菌的细胞 壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇 溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色 时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复 合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌 细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反 而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜 色 2.步骤 （1）涂片：在一片干净的载玻片，滴上一滴蒸馏水。用接种环挑取可 疑菌落，均匀的涂在载玻片上。 （2）晾干：置通风处晾干。 （3）固定：将载玻片在酒精灯火焰上迅速的来回几次。 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满 细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s 至流出液无 色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断 菌体的革兰氏染色反应性。 3.实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的 油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜 纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干。

标准革兰氏染色液

标准革兰氏染色液 简介： 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 自备材料： 1、 接种环或挑取细菌的其他工具 2、 酒精灯 3、 载玻片 4、 光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 编号 名称 DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 使用说明书 1份

7细菌的革兰氏染色 (1)

微生物实验报告 细菌的革兰氏染色及形态观察 一、目的要求： 1、熟悉光学显微镜的使用方法。 2、掌握革兰氏染色法。 3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征 二、器材和器皿： 1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等 三、实验原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。 四、实验步骤： 1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、复染：滴加蕃红复染约2min，水洗。至此，革兰氏染色结束。

常用染色液的配制

常用染色液的配制 1.吕氏（Loefflev）美蓝染色液 A液：2%美蓝（Methylene blue）95%酒精溶液 B液：10%KOH溶液 取A液30ml、B液0.1ml与100ml蒸馏水混合。 2.石炭酸复红染色液 A液：4%碱性复红（basic fuchsin）95%酒精溶液 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解、 配成A液。 B液：5%石炭酸溶液 取A液10ml、B液90ml混合即可。一般可将此溶液稀释5-10倍使用。 但稀释液易变质失效，一次不宜多配。 3.革兰氏（gram）染色液 （1）草酸铵结晶紫染液： A液：1%结晶紫（Crystal violet）95%酒精溶液 B液：1%草酸铵（Ammonium oxalate）溶液 取A液20mlB液80ml，静置48/小时后使用。 （2）路哥氏（Lugol）碘液： 碘片1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液另，待碘全部 溶解后，加够水即成。 （3）95%酒精溶液 （4）蕃红（沙黄）复染液： 2.5%蕃红（Safranlne O）95%酒精溶液。 取此液10ml与90ml蒸馏水混匀即成。 4.芽孢染色液 （1）5%孔雀绿(Malachite green)溶液。 （2）0.5%蕃红溶液。 （3）苯酚品红溶液 称取11g碱性品红溶于100ml无水酒精中。 再取上述溶液10ml与100ml 5%的苯酚溶液混合，过滤备用。 （4）黑色素(nigrosin)溶液 10%黑色素溶液，置沸水浴中30min后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，

sop微生物检查操作规程

sop微生物检查操作规程 1目的 建立微生物限度检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2 范围 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的固体制剂及物料进行微生物限度的检查。 3 责任 化验员有责任按照本操作规程进行检验、判定,并对检验结果负责。 4 定义 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。 5 内容 5.1 总则： 5.1.1供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的 3倍量。 5.1.2 供试品在检查前不得开启，检查全过程均应严格遵守无菌操作规程，严防 再污染。 5.1.3 控制菌的污染检查应做相应的已知菌对照试验，对照菌株为大肠杆菌 [CMCC（B）44102]，每批试验已知菌加入量为50-100个。 5.1.4 染菌量的检查或控制菌的检查均应做空白对照试验。 5.1.5 供试品稀释成稀释液后应在均匀状态下取样，凡有抑菌成份或防腐剂的供 试品应做特殊处理后进行检验。 5.1.6 供试品稀释后应在1小时内操作完毕。

第2页/共6页 5.1.7 除另有规定外，细菌培养温度为30-35℃，霉菌、酵母菌培养温度为 25-28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。 5.1.8细菌、霉菌检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位；控制菌检验报告 以每1g、每1ml或每10cm2为单位报告“检出”或“未检出”。 5.2仪器、用具 恒温培养箱、隔水式生化培养箱、电子天平，移液管(1ml、10ml)、试管、离心管、双碟、镊子、剪刀、不锈钢吸管筒、酒精灯、取样勺、称量纸、研钵一个、不锈钢双碟筒。 5.2.1用具的包扎 移液管：用纱布包住移液管，然后放入不锈钢灭菌筒内。 试管、双碟：试管在管口塞上纱布棉塞、双碟放入不锈钢双碟筒内。 无菌衣、裤、帽、口罩：用布口袋将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。 5.2.2用具的灭菌 将包扎好的用具，在121±0.5 ℃蒸汽灭菌柜中灭菌30 分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽凝造成负压，易致染菌，应置烘箱烘干。 5.3培养基、试剂 5.3.1营养琼脂培养基 称取本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解后，按需要进行分装，经121℃15分钟灭菌备用。 5.3.2虎红培养基 称本品30克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.3胆盐乳糖培养菌（BL） 称本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.4曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 称本品42克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌116℃20分钟。 5.3.5生理盐水 称取9 g 氯化钠，加水1000 ml 溶解，分装后于121℃±0.5℃湿热灭菌30分钟，供作稀释剂用。 5.3.6 75%酒精棉 量取无水乙醇75ml，加水稀释至100ml，摇匀，将脱脂棉与75%酒精混合即得。

增强革兰氏染色液

增强革兰氏染色液 简介： 在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Enhanced Gram ˊs stain 采用最经典的革兰染色配方进一步改进，使用复红复染液替代沙黄染色液，增强了染色效率，用于极难染色的细菌。临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 2、 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、 固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每 次1s ，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、 初染：滴加结晶紫染色液染色，清水冲洗去染色液。 5、 媒染：滴加Gram 碘液，并覆盖载玻片，室温放置，水洗。 6、 脱色：滴加脱色液，摇动，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液， 终止反应。 7、 复染：滴加复红复染液染色，水洗。 8、 干燥。镜检：置油镜观察。 编号 名称 DM0016 4×10ml DM0016 4×100ml DM0016 4×250ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml RT 试剂(D): 复红复染液 10ml 100ml 250ml RT 避光 使用说明书 1份

革兰氏染色

普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1.学习显微镜的结构、各部分功能和使用方法 2.学习细菌制片方法 3.学习细菌染色原理和方法 4.巩固无菌操作技术 5.学习图像结果的规范表示 【实验原理】 1.显微镜的结构和各部分功能 现代普通光学显微镜 利用目镜和物镜两组透 镜系统来放大成像，故又 常被称为复式显微镜。它 们由机械装置和光学系 统两大部分组成。在显微 镜的光学系统中，物镜的 性能最为关键，它直接影 响着显微镜的分辨率。而 在普通光学显微镜常配 置的几种物镜中，油镜的图1. 显微镜的构造放大倍数最大，对微生

物的研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要有如下两方面的原因：1.1增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100x，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大。而从显微镜的结构看，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头）有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时，会因为射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率为1.52）。 1.2增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率和分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力。最小可分辨距离越小，分辨率越高。从物理学角度来看，光学显微镜的最小可分辨距离受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 最小可分辨距离= λ2NA 式中：λ为光源光波长，NA为物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7μm），而数值孔径值取决于物镜的镜口角和玻片与物镜间介质的折射率，可表示为： NA=n*sin? 式中：?为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距

附录一 染色液的配制 免费

附录一染色液的配制 1、吕氏（Loefflev）美蓝染色液 A液：2%美蓝（Methylene blue）95%酒精溶液 B液：10%KOH溶液 取A液30ml、B液0.1ml与100ml蒸馏水混合。 2、石炭酸复红染色液 A液：4%碱性复红（basic fuchsin）95%酒精溶液 B液：5%石炭酸溶液 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解、配成A液。 取A液10ml、B液90ml混合即可。一般可将此溶液稀释5-10倍使用。但稀释液易变质失效，一次不宜多配。 3、革兰氏（gram）染色液 （1）草酸铵结晶紫染液： A液：1%结晶紫（Crystal violet）95%酒精溶液 B液：1%草酸铵（Ammonium oxalate）溶液 取A液20mlB液80ml，静置48/小时后使用。 （2）路哥氏（Lugol）碘液： 碘片1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液另，待碘全部溶解后，加够水即成。 （3）95%酒精溶液 （4）沙黄（蕃红）复染液： 2.5%沙黄（Safranlne O）95%酒精溶液。 取此液10ml与90ml蒸馏水混匀即成。 4、芽孢染色液 （1）5%孔雀绿(Malachite green)溶液。 （2）0.5%沙黄溶液。 5、荚膜染色液 将黑色素在蒸馏水中煮沸5min，配成5%溶液，然后加入福尔马林（40%甲醛）0.5%(V/V)作防腐剂。 （2）沙黄染色液 与革兰氏染色液中的沙黄复染液相同。

6、鞭毛染色液 A液：单宁酸5.0g、FeC131.5g、蒸馏水100ml，福尔马林（15%）2.0ml、NaOH(1%)1.0ml。 配好后应当日使用，次日即效果差，第三日则不能使用。 B液：2%AgNO3溶液 待AgNO3溶解后，取出10ml备用。向其余的90ml AgNO3中滴入浓NH4OH，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将10ml德用的AgNOa溶液慢慢滴入。此时会出理薄雾，轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3溶液直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染液可使用一周；如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。 7、乳酸石炭酸棉蓝染色液 石炭酸2.0g、甘油40ml、乳酸（密度1.21）20ml、蒸馏水20ml、棉蓝（Cotton blue）0.05g 石炭酸在蒸馏水中加热溶解,然后加入乳酸和甘油,最后加入棉蓝,使其溶解即成。 8、富尔根氏（Feulgen）核染色液 （1）Schiff氏试剂：将1g碱性复红加于200ml煮沸的蒸馏水中，振荡5分钟，冷却至50℃左右过滤。加入1.0NHC120ml，摇匀。待冷至25℃时，加Na2S2O5（偏重亚硫酸钠）3g，摇匀后装在棕色瓶中，用黑纸包好，放于暗处过夜，此时试剂应为淡黄色（如为粉红色则不能用）。再用中性活性炭过滤，其滤液振荡1分钟后再过滤，滤液置于冷暗处备用。注意：过滤需在避光条件下进行。 在整个操作过程中所用的一切器皿都需十分洁净、干燥，以消除还原性物质。 （2）Schandium 固定液 取50ml升汞水溶液加95%酒精25ml。 B液：冰醋酸 取A液9ml加B液1ml，混匀后加热至60℃。 （3）亚硫酸水溶液 10%偏重亚硫酸钢水溶液5ml、1MHC115ml、蒸馏水100ml。 9、Albert氏异染颗粒染色液 A液：甲苯胺蓝0.15g、孔雀绿0.2g、95%酒精2ml、蒸馏水

革兰氏染色镜检的操作规程

革兰氏染色镜检的操作规程 1.目的：鉴定G阳性菌.G阴性菌（球菌、杆菌、真菌）。指导临床用药。 2.原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gtam所创立的，此方法可将所有的细菌分G+和G-两大类，G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染性的颜色。 3.实验器材：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。 4.试剂： 4.1试剂来源：购买，四川迈克。 4.2试剂合组成: R1结晶紫1χ10ml R2碳酸钠1χ10 ml R3碱性碘液 1χ10ml R4丙酮酒精1χ20ml R5碱性复红1χ10ml 5.标本采集与处理： 5.1阴道,子宫等分泌物应由医生采集,收集于无菌试管内送检。 5.2载玻片的预处理: 5.2.1载玻片用前以９５％乙醇擦拭脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片。 5.2.2在玻片背面一端的1/3处注明编号。 5.3涂片： 5.3.1用棉签可直接在玻片上均匀涂抹. 5.3.2菌液涂片时,用接种环沾取菌液,点在玻片上.

,在盐水中涂布。 6.染色方法: 6.1将标本均匀涂布于玻片上,自然干燥,火焰固定。 6.2冷却后加R1、R2各两滴初染30秒后水洗。 6.3用R3媒染30秒.水洗后用R4脱色至无兰色脱落为止(约有5-10秒),水洗。 5.4用R5复染5秒,水洗,待干,镜检。 7.镜检: 7.1取已干燥的涂片,用低倍镜览片,再用高倍,最后用油镜观察,并在已干燥的涂片滴1-2滴香柏油,仔细观察. 7.2判断菌体的革兰氏染色反应性,呈紫色为G+菌,呈红色为G-. 8.报告方式: 检出革兰氏阳性球菌,革兰氏阳性球菌. 检出革兰氏阴性球菌，革兰氏阴性球菌。 9.实验完后的处理: 9.1显微镜头的处理:用擦镜纸将油镜头的油擦去,再用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次,最后用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次.注意向一个方向擦拭. 9.2废弃标本和污物的处理: 9.2.1染色玻片放入5%84消毒液中浸泡30-60分钟,消毒液要每天更换. 9.2.2废弃标本及污物应弃于有盖的污物桶内,由专人收并送焚烧炉内彻底焚化. 10.注意事项: 10.1涂片应均匀,厚薄适度,自然干燥后再加热固定. 10.2脱色要至无兰色脱落为止.

革兰氏染色液配制

革兰氏染色液配制 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。 （2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm?离心10min.，取沉渣涂片染色。

2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。 （4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项：

革兰氏染色法的过程及原理

革兰氏染色法的过程及原理 一，过程 1 ．涂片 将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 二，原理 革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏 多糖的碱性酶，只要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的 B-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分 解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物流 出而使细菌溶解，溶菌酶还可以和带负电荷 的病毒蛋白直接结合，与DNA，RNA，脱辅