实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
1 实验目的
本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。
2 实验原理
研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。
细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。
3 实验材料
3.1实验动物
大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h）
3.2实验器材与试剂
器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等
试剂：1.17% KCl 溶液
Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g；
水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml
4.实验方法
4.1动物处理与匀浆制备
断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆
倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）
的匀浆。
4.2制备线粒体后上清液
将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，
上清液即为线粒体后上清液。温度为0～4℃；离心力10 000～12 500g；时间
15～30min
4.3制备微粒体-超速离心法
取线粒体后上清液8～12mL，置超离心管；离心 100 000g 60min，弃上清
液；微粒体板用0.25mol/L蔗糖液或1.17％KCl液洗1次，以除去污染的血红蛋
白再离心 100 000g 30～60min，弃上清液；微粒体板沉淀物移至离心管，加适
量pH 7.4 Tris-HCl缓冲液重悬，终产物为微粒体悬液制备的肝微粒体每1g含
蛋白一般在20mg左右；最好当天使用。若保存，应加20％（V/V）甘油分装于
塑料管，置-20~-80℃，可保存数周而酶活性不减。
4.4微粒体蛋白浓度测定
1.微量法制定标准曲线取8个1.5ml离心管，分别编号0-7，按下表配制
浓度梯度标准蛋白溶液。
表1 浓度梯度标准蛋白溶液
样品编号0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液
0 25 50 100 200 300 400 500
(μL)
Tris-HCl缓冲
1000 975 950 900 800 700 600 500 液(μL)
标准蛋白浓度
0 0.025 0.050 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
（mg/ml）
考马斯亮蓝试
200
剂(μL)
取上述各浓度蛋白标准稀释液20μL 与考马斯亮蓝染色剂200μL至96孔酶标
板内，各设三个重复孔，混匀，室温静置5-10min，以0号试管为空白对照，于
595nm处比色测定各孔OD值。以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，
在坐标纸上绘制标准曲线。
2.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，分别取肝微粒体悬液100倍和
200倍稀释液20μL，测定OD595nm值，平行测定三次。根据所测定的平均OD595nm
值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓
度(mg/mL)。
4.5细胞色素P-450含量测定
取蛋白含量已知的组织样品用pH7.4 0.1mol/L Tris缓冲液(1.21g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至100ml稀释为每1mL含 10mg微粒体蛋白的悬液；取此液0.3mL，加上述缓冲液5.7mL，混合；分装于2个比色杯（大约3mL），一个作为样品杯，另一个作为参比杯，置双光束紫外分光光度计，扫描400和500nm间的基线；加数mg连二亚硫酸钠，搅拌，样品杯轻轻充CO约1min，再扫描400～500nm的差示光谱。
4.6结果计算
P-450含量＝△OD（450-490）×1000/91×蛋白浓度C × r （mg/ml）×
稀释倍数（ nmol/mgPr）
ΔOD为450nm处光密度值与490nm光密度值之差 91为CYP450的消光系数，单位：cm2／mmol
r为比色杯光径长度，单位：cm
C为微粒体制备物的蛋白浓度，单位：mg／ml
5.实验结果
5.1 标准曲线的绘制
Bradford法测定标准蛋白结果和标准曲线见表2和图1
表2标准蛋白595nm的OD值
标准蛋白浓度
0.025 0.050 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 （mg/mL）
吸光度A0.399 0.477 0.561 0.684 0.763 0.836 0.882 以表2的数据绘制标准曲线如下。
图1标准曲线
5.2．未知样品蛋白质浓度的测定结果
表3 未知样品蛋白质浓度595nm的OD值
溶液测定校正值校正均值稀释100倍0.942 0.951 0.951 0.967
1.013 0.976 0.970
稀释200倍0.807 0.809 0.808 0.814
0.793 0.824 0.841
根据所测定的平均OD595nm校正值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，计算出稀释100倍和200倍的蛋白浓度分别为53.96mg/ml，76.83mg/ml。
因此，未知样品的蛋白浓度: 65.40mg/ml
5.3 细胞色素P-450含量测定
由于实验过程中未充入CO ，因而未能测定细胞色素P-450,但是在420nm 波长下测得细胞色素B5的差值光谱。
图2 双光束紫外分光光度计测得细胞色素B5的差示光谱（0.5mg/ml）
OD值峰值（424nm）：0.0197；谷值（490nm）：0.00547。
6 实验讨论
肝微粒体是肝细胞中内质网的亚细胞组分，含有丰富的药物代谢酶：其中细胞色素P450酶广泛的参与了各种物质的生物合成和代谢；肝S9是肝匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的CYPs等药物代谢酶。因此，微粒体是非常有价值的研究药物代谢和药物相互作用的工具。
实验注意：操作的全过程及所用器械、人；溶液均应维持在0℃～4℃范围内，匀浆器始终应浸在冰水浴中，以避免肝微粒体酶因热变性而失活。制备无菌微粒体，需对所使用的全部器材和溶液进行灭菌处理。
细胞色素P-450含量依组织、动物是否诱导、种属、品种等而定，一般未诱
导的大、小鼠肝细胞色素P-450含量为0.4～1.0nmol/mg微粒体蛋白。为避免血红蛋白破坏，保险粉加入不宜过多。在缓冲液中加20％甘油可减少转化为无活性的细胞色素P-420，一般测定不需加甘油。样品与保险粉混合后应尽快充CO，因细胞色素P-450的还原形式不太稳定；充CO时速度宜慢，以免泡沫太多导致蛋白变性。充CO后如果420nm处吸收峰比较明显，表明有失活的细胞色素P-450，样品不能使用。
本次试验中，在测定蛋白浓度的时候，由于考马斯亮蓝试剂保存时间太长，使得测定的蛋白浓度不准确；在测定P-450含量时，由于外部原因并没有充入CO，因而分光光度计在450nm处并没有出现峰值，而是在424nm处出现峰值，经查是细胞色素B5的峰值。细胞色素B5也存在于肝微粒体中，还原型b5与氰感受因子的酶一起，参与由氧将饱和酰基辅酶A转变成不饱和酰基辅酶A的脂肪酸不饱和化反应。通过测定一系列蛋白浓度浓度的差示光谱，确定了当蛋白浓度为0.5mg/ml时的光谱图效果比较好，该谱在紫外区的吸收杂峰不很明显，并且有着很明显的波峰和波谷，效果理想。
微粒体制备
微粒体制备 一、工作原理 微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,这些小囊泡的直径大约100nm左右, 是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微粒体能够在不同的离心速度之下，从其他的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并分离，而P450、内质网碎片及其他可溶性酵素则保留在上清中。取上清在更快速的100,000g离心旋转之下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状，而可溶性酵素则保留在上清中，将沉淀重悬即可得到微粒体。因此，微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。微粒体含有细胞色素P450 (CYP)，由于P450中的辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常呈现红褐色。肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）中提取的微粒体，加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法. 二、实验准备 以制备肝微粒体为例： 1、器材：匀浆机、大剪刀（断头）、手术剪、眼科剪3个、眼科镊3个、头皮针、注射器20ml、烧杯（500ml）4个、冰盒、冰板、匀浆管（5/10ml）、离心管（生科院借）、冻存管N个、培养皿N个。 2、试剂：冰生理盐水 PBS 缓冲液：1000ml缓冲液中含磷酸钾缓冲盐0.1mol·L-1、KCl 0.15 mol·L-1和1mmol·L-1EDTA,即1000ml超纯水中含K2HPO4 (228.23)18.304g、KH2PO4 (136.09)2.695g、KCl(74.55) 11.2g和EDTA0.372g，分装，4℃保存。 含20%甘油的PBS缓冲液200ml：40ml甘油+160ml上述PBS（存争议）三、实验步骤
线粒体的分离
线粒体的分离
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实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组
肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用
肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用1 Application of Liver-specific Cytochrome P450 Reductase knockout mice in Toxicology 肖瑛，武元峰，薛翔，顾军，任进* Xiao Ying, Wu Yuanfeng, Xue Xiang, Gu Jun, Ren Jin 中国科学院上海药物研究所，新药研究国家重点实验室,上海201203 State Key Laboratory for New Drug Research，Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 201203 关键词: NADPH-细胞色素P450酶还原酶，基因敲除，器官毒性 Key Word: NADPH-P450 Cytochrome Reductase, Knockout, Organ Toxicity 1.引言 微粒体细胞色素P450单加氧酶（P450，CYP）在内源与外源性化合物的生物转化中起着重要的作用。P450酶蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使P450酶系可以催化多种类型的反应，不仅对许多外来物质如杀虫剂及环境有毒物质具有代谢作用，还参与一些起重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸的代谢。P450酶的功能与生物学作用的重要性，使其研究具有广阔的应用前景。通过调控其表达和活性，可望改变生物体内外源性化合物尤其是药物的代谢，对于药物的研究和开发也有重要的意义。由于P450酶系的生物学重要性，自其发现以来，该酶系的研究一直是药理学和毒理学中一个十分引人注目的领域。 P450酶基因的多态性使其有多种亚型且多具有类似的功能和相似的组织分布特征，使在一个特异组织中很难去区别单个P450酶亚型的功能。目前已有多个P450酶亚型敲除（knockout，KO）小鼠模型，这些模型已被广泛用来研究特异性P450酶亚型在外源性化合物的代谢和毒性中的作用[[1]]。然而这些KO模 1基金项目：国家重点基础研究发展计划973项目（编号：2006CB504700） 作者简介：肖瑛（1981-），女，博士研究生，研究方向为药物毒理学。 *通讯作者：任进，Email: CDSER_SIMM@mail. https://www.sodocs.net/doc/3514479216.html, Tel & Fax：（021）50806600-2207
大鼠肝微粒体的制备
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备 大鼠肝微粒体制备全过程： 1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：0055706 2．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg2kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并 固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土 黄色。 3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mM EDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。 4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。 5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。 6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。 7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。 8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应 后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同 样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓 度。 9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3?0.5 mg/mL，取两份肝微 粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加 入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。 CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) ×1000)/(91 ×C) (2.1) 其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。 实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定 一、目的要求
血液中微粒的流式检测及临床意义
血液中微粒的流式检测及临床意义 来源：中华检验医学杂志 关键词：流式微粒血液流式检测临床意义 各种血液细胞及血管内皮细胞受到刺激而活化或发生凋亡后，细胞膜磷脂酰丝氨酸由胞膜内层进入外层，以出芽方式形成小泡状结构而脱落，形成所谓的“微粒（microparticle，MP）”。正常人体血液中即存在少量MP，而在许多疾病中MP水平明显升高。MP具有促进血液凝固反应发生与血栓形成等多种重要生物学活性。越来越多的研究提示，检测血液MP水平与性质有助于监测病情、指导治疗与疗效判断。 一、血液中微粒的检测方法 1、流式细胞术（flow cytometry，FCM） MP膜上表达与其来源细胞相同的表面标志分子，选取针对特异性标记分子的单抗，它可确定其细胞来源；MP体积远小于其来源细胞，流式细胞术检测中的前向散射光强度可反映颗粒大小；MP外露的磷脂酰丝氨酸可应用荧光标记AnnexinV显示，这些都为应用FCM检测MP提供了基础。 对细胞表面标志分子的确认与单克隆抗体制备技术的发展及完善，使FCM成为当今定量与定性检测MP最为广泛的方法。检测不同细胞来源的MP所使用的单抗如下：血小板微粒（platelet micorparticles，PMP）使用抗糖蛋白抗体，比如抗CD41、抗CD61与抗CIM2a等抗体；检测内皮细胞微粒（endothelial microparticles，EMP）使用的抗体包括抗CD31、抗CD51与抗CD144等抗体；检测单核细胞微粒（monocyte.derived microparticles，MDMP）使用的抗体包括抗CD14抗体；检测淋巴细胞微粒使用的抗体包括抗CD3、抗CD4与抗CD19等抗体。可见检测某种细胞来源的MP可有多种抗体供选择，而应用不同抗体检测结果不尽相同，比如应用抗CD41a抗体检测出的PMP水平高于抗CD61和抗CD42a抗体检测出的水平¨；应用抗CD31抗体检测冠心病患者EMP水平较正常对照升高10倍，而抗黏附分子抗体检测EMP仅增高1.5—2.0倍，这可能是由于不同抗体检测灵敏度不同所致。除表达来源细胞表面标志分子外，MP可表达某些来源细胞原来并不表达的蛋白分子，使MP获得新的生物学活性，比如PMP表达组织因子（tissue factor，TF），而在巨核细胞并未检测到此分子，TF使得PMP获得促凝活性，在许多疾病中发挥致病作用。 由于多步骤操作易导致细胞体外激活，尤其是血小板，从而影响检测准确性，因此，检测者除了要注意选择抗体之外，对FCM的具体操作也应作进一步改善，以提高准确性与灵敏度。比如在样本收集方面，有研究建议使用柠檬酸．茶碱．腺苷酸．双嘧达莫抗凝管，与枸橼酸钠抗凝相比，能更有效抑制血小板体外激活，保证了结果的可靠性¨；由于MP很小，有可能不能通过前向散射光强度来反映（能检测最小颗粒直径不小于0.1 p.m），此外MP表面积小导致标记的荧光强度小，使得荧光检测灵敏度与准确性降低，改良方法中使用已知直径的微球来校正流式细胞仪，从而提高准确性；应用3.0 m与0.8m乳胶微粒作为内参照检测PMP，0.8m乳胶微粒用于设门，3.0m乳胶微粒用于定量，此方法有效排除血小板的干扰，也有效地提高了准确性。 2、酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA方法也可用于检测MP，但远不及FCM广泛。Osumi等选用多种抗血小板抗体以期建立检测PMP更优良的ELISA方法。结果发现以抗CD42a抗体作为捕获PMP的一抗，抗CD42b抗体作为二抗，可获得阳性率与特异性最高的检测结果，该方法与FCM检测结果具有一致性，提示应用ELISA检测MP的可行性。也有人先利用AnnexinV捕获血液中的MP，之后应用特异性抗体以确定MP的细胞来源，同样获得了有意义的研究结果。 二、血液中微粒检测的临床意义
实验四 线粒体的分离与观察
实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
循环内皮细胞及内皮细胞微粒的临床应用及其进展
循环内皮细胞及内皮细胞微粒的临床应用及其进展 摘要 循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CECs）是30多年前在外周血涂片标本中发现的，自此陆续出现了很多关于CECs的提取、计数及应用的研究，特别是免疫磁珠分离法及荧光激活细胞分离技术的应用促进了对CECs进一步的了解。内皮细胞微粒（endothelial microparticles，EMPs）是在1990年Hamilton等将补体蛋白C5b-9和钙离子载体A23187作用于脐静脉内皮细胞的实验中第一次通过流式细胞仪检测出一种的微粒，至此开始陆续有很多实验对EMPs的特征进行了描述并证实在多种疾病中有明显升高。本文中，我们通过总结CECs及EMPs的计数方法及临床意义，深入了解循环CECs及EMPs的临床应用发展。 关键词循环内皮细胞内皮细胞颗粒检测方法临床应用 循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CEC）是指能够在外周血中测得的血管内皮细胞VEC（vascular endothelial cell），VEC具有多种生理功能，参与机体血管的舒缩、凝血、炎症、免疫、物质转运和生物活性物质释放等多种生命活动。正常状态下，内皮细胞的更新率很低（0–1%），正常人体内的CECs数量非常少（0-10个/ml），血管损伤或新血管形成时，CECs会显著增多，因此CECs可以评估血管的病变程度，可直接反映血管内皮损伤。内皮细胞微粒（endothelial microparticles，EMPs）是活化或凋亡的内皮细胞释放的直径﹤1微米级大小的囊泡，在反映内皮细胞的功能及血管生理中有重要的生物学意义，介导血管炎症、血栓形成，血管舒缩反应、血管生成等过程。EMPs是评价内皮细胞功能紊乱的标志物，在不同的疾病中有着不同的反映。 1、CECs及EMPs的来源 CECs是继发于血管损伤后血管内皮脱落的成熟内皮细胞，然而细胞脱落的机制有多种可能，目前尚未有统一结论。不同的实验模型研究报道主要考虑可能由于机械损伤、内皮细胞粘附性能缺失、蛋白酶或细胞因子介导、细胞程序性凋亡等触发内皮细胞的抗原暴露，从而逐步进展至内皮细胞损伤与功能障碍，直至细胞凋亡或坏死脱落[1; 2]。 CECs在活化或凋亡时释放EMPs，关于EMPs的形成机制至今仍未明确阐明，可能与细胞骨架的破坏、膜磷脂不对称分布消失等原因有关。EMPs表面表达多种内皮细胞膜表面的蛋白抗原，包括成熟内皮细胞表达的特异性黏附分子，如ICAM-1 (CD54)、选择素 E (CD62E)、选择素P(CD62P)、PECAM (CD31)、VE钙粘蛋白(CD144)等，以及其他特异性抗原，如endoglin (CD105)、S-endo1 (CD146)等。不同EMPs所表达的膜抗原会因其产生原因的不同(活化或凋亡)而有所不同[3]。 2、CECs及EMPs的测定 最早CECs的测定是在显微镜下对其形态学检测来分离及计数，但是这些方法都存在着血小板或其他细胞的干扰、对检测人员的要求较高、且缺乏特异性等问题，近年来逐渐出现了新的检测方法，如免疫磁珠法、荧光激活细胞分离技术，这些技术准确性高，特异性强。2.1 CECs的测定 2.1.1免疫磁珠法（Immunomagnetic isolation） 免疫磁珠法最早是在用于检测外周血中的罕见细胞（例如转移性癌细胞），CECs也是外周血中的罕见细胞，免疫磁珠法能较好的检测CECs的存在。此技术现将抗内皮细胞抗体包被于顺磁性微粒（Dynabead TM）上，然后再从全血中分离这些顺磁性微粒结合的内皮细胞[1]。 由于CD146分子在活化淋巴细胞、滋养层细胞、间充质干细胞、牙周组织及恶性肿瘤中均有一定程度的表达，所以为了纯化CECs的提取，必须对细胞进行二次标记，即结合荆
实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定 1 实验目的 本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。 2 实验原理 研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。 细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。 3 实验材料 3.1实验动物 大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h） 3.2实验器材与试剂 器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂：1.17% KCl 溶液 Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g； 水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml 4.实验方法 4.1动物处理与匀浆制备 断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆
核与线粒体分离提取方案
线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破
3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较
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3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较 作者：简暾昱， 徐帆， 廖春龙， 徐贵丽， Jian Tunyu， Xu Fan， Liao Chunlong， Xu Guili 作者单位：简暾昱,Jian Tunyu(昆明医学院成都军区昆明总医院第一临床学院,昆明,650032)， 徐帆,徐贵丽,Xu Fan,Xu Guili(成都军区昆明总医院)， 廖春龙,Liao Chunlong(大理学院) 刊名： 中国药师 英文刊名：CHINA PHARMACIST 年，卷(期)：2011,14(3) 参考文献(5条) 1.金科涛;王宇光;徐彭HPLC测定大鼠肝微粒体P450活性方法学研究进展[期刊论文]-药物分析杂志 2006(03) 2.孙忠实;朱珠药物代谢性相互作用研究进展 2000(01) 3.李海玲;彭书明;李凛4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志 2008(04) 4.许家喜蛋白质的检测方法与乳制晶中蛋白含量测定[期刊论文]-大学化学 2009(01) 5.Cinti DL;Moldeua P;Schenkman JB Kinetic parametera of drug-metabolizing enzymes in Ca2+-sedimented microsomea from rat liver[外文期刊] 1972(24) 本文读者也读过(1条) 1.LI Hai-ling.彭书明.LI Lin.张雪梅.LI Hai-ling.PENG Shu-ming.LI Lin.ZHANG Xue-mei4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志2008,29(4) 本文链接：https://www.sodocs.net/doc/3514479216.html,/Periodical_zgys201103012.aspx
循环内皮细胞微粒
循环内皮细胞微粒----动脉粥样硬化进展的标志 各种心血管疾病都会引起循环微粒（MPS）水平升高，血浆中循环微粒（MPS）水平升高可以将其视为血管功能改变的生物标记。内皮细胞激活或凋亡时，可以释放一种复杂的亚微米（0．1～1ΜM）小囊泡于血液中，临床上称之为循环微粒（MPS）。内皮细胞微粒(EMP S)能引起生理和病理等变化，并且可以促进氧化应激和血管炎症等。血管紧X素II，脂多糖，和过氧化氢引起的动脉粥样硬化可以诱发内皮细胞微粒(EMP S)释放。然而，内皮细胞微粒(EMP S)也可以通过多种生理学途径产生，例如NADPH氧化酶促进内皮形成ROS以及R HO激酶途径和丝裂原活化蛋白激酶等等。内皮功能障碍是引起动脉粥样硬化斑块形成的关键因素，而从破裂颈动脉斑块中释放的粥样硬化栓子，是中风的主要致病因子。越来越多的证据表明，无论是在病情恶化或触发修复反应过程中，内皮细胞微粒(EMP S)作为损伤标记物，在心血管疾病的发病机制中发挥着重要的作用。就这个方面来说，我们已经证实内皮细胞微粒(EMP S)具有潜在的充当疾病发展状态的生物标志物的可能性。本文的目的就是提供有关内皮细胞微粒(EMP S)在动脉粥样硬化过程中发病机制的最新信息。 1.什么是微粒？ 微粒（MPS）是细胞膜脱落的亚微米片段（0．1～1ΜM），其包含的信息有M RNA、MICRO RNA S、受体以及母细胞的特异蛋白，细胞应激和细胞活化过程中会产生微粒。研究表明，微粒（MPS）是由血液中某些相关的细胞比如：内皮细胞、平滑肌细胞、血小 板、红细 胞以及白细胞的特异性表面蛋白释放的膜囊泡。一直以来，微粒（MPS）都被视为“细胞垃圾或碎片”，因为对其形成的过程还未完全明确。不过，微粒（MPS）的形成和脱落涉及到细胞膜磷脂结构的重组包括外小叶磷脂酰丝氨酸（PS）及细胞结构的改变与细胞骨架组织的破坏。几项研究报告指出小囊泡中存在类似微粒（MPS）磷脂酰丝氨酸，但不会在外部小叶暴露磷脂酰丝氨酸。各种临床试验和研究证实MP S在糖尿病、肺癌、中枢神经系统紊乱、炎症、全身红斑狼疮以及心血管疾病（心血管病）发挥着重要的作用，因此与MP相关的研究领域得以迅速发展。
组织线粒体分离试剂盒
组织线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 低温离心机、匀浆器 2、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。注：如需获得纯度更高的线粒体，可 编号 名称 CS0010 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异
代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。由此，代谢稳定性研究常作为早 期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。目前常用 于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针 对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是 什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数 据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下 文将带着这些疑问进行阐述。 1 肝微粒体与肝细胞的差别 要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、
OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。 (摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies in Drug Design and Development》一书)
细胞线粒体分离试剂盒
细胞线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。本试剂盒提供台盼蓝染色液和PMSF ，可以分别判断线粒体质量和提取细胞浆蛋白。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶 2、 低温离心机、匀浆器 3、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：用预冷的PBS 清洗细胞，离心，其上清。 2、裂解：沉淀用预冷的Mitochondria Lysis buffer 重悬细胞，冰浴放置，可用相差显微镜检测膨胀的程度。 3、匀浆：把细胞悬液转移至Dounce 匀浆器中，匀浆。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 编号 名称 CS0201 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光 试剂(C): Wash buffer 100ml -20℃ 试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT 试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
实验五 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
实验五大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定 姓名：任妮 2011302110100 摘要：目的：研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法，掌握用考马斯亮蓝的方法测定蛋白质的含量。方法：通过使用80mg/kg苯巴比妥钠对大鼠进行诱导（连续3～5d），停止给药后24h采样（无菌取出肝脏），制备肝匀浆，9000g速度0～4℃低温环境下离心，取出上清液（S9组分），最后加入考马斯亮蓝染色液，测定OD595nm值。通过不同浓度的标准蛋白溶液来建立标准蛋白的标准曲线，根据肝S9组分的OD595nm值计算出样品中蛋白质浓度。结果：本实验建立的标准曲线方程为y=0.0062x-0.045，相关系数为0.9887,相关性较好。测得肝S9组分样品蛋白的浓度为25.04mg/ml。结论：苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制备出大鼠肝S9. 关键词：肝S9；蛋白质含量；考马斯亮蓝染色法（Bradford法） 前言：许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝S9是许多体外实验常用的体外活化系统,其主要有效成分为混合功能氧化酶( MPO)系统,其中许多酶共同组成电子传递体系,其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用,具有活化氧分子和与底物结合的双重功能。CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用,苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂,能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细胞色素。因此,本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂,制备S9,并采用考马斯亮蓝法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法。 蛋白质浓度的测定有许多方法，本次试验采用的是考马斯亮蓝染色法（Bradford法），该方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝染色法原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。 1 实验材料 1.1实验动物
线粒体分离及功能测定
组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）： Components Final concentration Tris-HCl 50mM pH7.4 NaCl 150mM EDTA 2mM EGTA 2mM Triton X-100 0.2% NP-40 0.3% PMSF 100uM NaVO3 1mM NaF 250mM Leupeptin 10ug/ml Aprotinin 2ug/ml DTT 1mM 组织线粒体的分离 1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓 冲液中， 2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分， 3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎， 4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次， 5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中， 6) 重复上面步骤一次， 7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体， 8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次， 9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours）， 10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。 分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法) 低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration Hepes(KOH) 20mM pH7.2 Sucrose 210mM Mannitol 70mM EDTA 1mM EGTA 1mM
利用石蜡切片对小鼠肝脏组织器官细微结构的观察
摘要：本文采用石蜡永久制片和光学显微摄像的方法对经过环磷酰胺处理过的小鼠肝脏的显微结构进行了研究，分析环磷酰胺对小鼠肝脏的显微结构产生的影响。结果表明，一定剂量的环磷酰胺对肝脏具有损伤作用。 关键词：小鼠肝脏石蜡切片 环磷酰胺( Cyclophosphamide, Cp) 是人工合成的氮芥类烷化剂。可以抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞，限制其转化为免疫母细胞，可以作为细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药，被广泛用于治疗急慢性淋巴细胞性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等；但同时可以引起剂量依赖性肝损伤的副作用——原因可能是环磷酰胺主要代谢物丙烯对肝脏有毒副作用，能引起肝细胞坏死，肝小叶中心充血，同时伴有氨基转移酶含量升高的现象。 1 材料与仪器 1.1 实验材料 小白鼠 1.2 实验仪器： 镊子、毛笔、蜡杯、溶蜡箱、酒精灯、切片机、载玻片、盖玻片、染色缸、光学显微镜。1.3 试剂： 中性福尔马林固定液、各浓度酒精、二甲苯、石蜡、伊红染液、苏木精染液、加拿大树胶 2 实验方法 2.1 取材 用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，小白鼠瞬间死亡。取肝组织。 2.2 固定 将小鼠肝脏块投入中性福尔马林固定液中固定。 2.3 脱水 将组织经各浓度酒精各1 h，95%、100% 的酒精各两次，每次30 min。 2.4 透明 将组织块置于酒精二甲苯混合液中15 min，再将组织块置于二甲苯中透明两次，每次10 min。最后将组织块置于二甲苯石蜡混合液中20 min。
2.5 透蜡 将组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温，共三次，前两次45 min，第三次 30 min。 2.6 包埋 向纸盒中倒入少许石蜡，将组织块用镊子夹取到纸盒中，放入盛有冷水的盆中使其凝固。2.7 切片 右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，当切成的蜡带到一定长度时，将蜡带放在纸上。 2.8 贴片、展片 选取蜡带放置在载玻片上。将载玻片放置在机器上进行展片，待蜡带完全展开时将载玻片拿下，放入盒内。 2.9 脱蜡复水 将石蜡切片经二甲苯Ⅰ脱蜡 20 min，二甲苯Ⅱ脱蜡 10 min，然后放入各级酒精溶液中各2 min，蒸馏水中2 min。 2.10染色 将石蜡切片在苏木精染液中浸40min，然后蒸馏水涮洗几次至发蓝（约2min），镜检。 2.11 脱水Ⅰ、复染、脱水Ⅱ 将镜检合格的石蜡切片依次在各级酒精中浸2min，再在伊红水溶液浸二十至三十秒，再依次在95%、纯酒精Ⅰ、纯酒精Ⅱ中各浸 3 min。 2.12 透明 将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 3 min。 2.13封藏：中性树胶封存 将载玻片取出，在切片中央滴一滴树胶，用镊子盖上盖玻片。 3 小鼠肝脏石蜡切片观察 见下图：
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察 高熹1120152430（李安一） （北京理工大学生命学院16121501班） 摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。 关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。 1 引言 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。 制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 Giemsa染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。 2 实验器材及材料 2.1 实验材料 大鼠肝脏。