BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV的感染应答

BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV

的感染应答

家蚕浓核病毒(Bm BDV)能特异性地侵染家蚕中肠组织的柱状细胞,是家蚕软化病的病原。Bm BDV的基因组由两种不同的单链DNA,VD1(6,543 nts)和

VD2(6,022 nts)构成,病毒粒子中只含有两种DNA分子中的一种。

目前还没有一种细胞系可感染Bm BDV,也不能通过基因操作改变Bm BDV的基因研究病毒基因的功能。家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)基因组由10个分节ds RNA片段组成,每个ds RNA片段含有一个完整的开放阅读框(ORF)。

由于Bm CPV为ds RNA,且缺乏Bm CPV的敏感细胞系,无法通过基因敲除或敲入研究Bm CPV基因功能,导致Bm CPV基因功能研究几无进展。不同的家蚕品种对Bm CPV的抗性存在差异,但品种间的抗性差异机制仍有许多不明之处。

基于目前的研究现状和存在问题,我们开展了基于Bm BDV基因组DNA质粒拯救病毒研究、基于体外转录的病毒RNA转染细胞拯救Bm CPV研究,期望为Bm BDV 和Bm CPV基因的功能研究提供新的系统;同时,利用RNA-Seq技术,研究了不同抗性品种家蚕感染Bm CPV后,中肠组织基因组转录水平的变化,期望为理解家蚕对Bm CPV的感染应答及抗Bm CPV的分子机制提供新的线索。1、Bm BDV反向遗传学系统的研究为了提供Bm BDV基因功能的研究平台,将含有Bm BDV VD1基因组的重组质粒p GEM-VD1转染家蚕卵巢(Bm N)细胞,发现细胞表现出明显的细胞病变;Western blotting与免疫荧光皆能检测到Bm BDV基因的表达。

同时,我们通过Bac-to-Bac载体表达系统构建了装载VD1全基因组的重组杆状病毒Bm Bac-VD1,该重组病毒基因组DNA转染Bm N培养细胞,可观察到细胞出现明显病变,将培养上清转接正常Bm N细胞,表现出相同的病变;Western

blotting与免疫荧光试验可检测到Bm BDV病毒结构蛋白的表达;透射电镜可同时观察到球形病毒粒子与杆状病毒粒子,通过差速离心将两种病毒粒子分离,分子生物学鉴定结果显示,球形病毒样颗粒中包裹有重组病毒基因组。上述结果显示,通过基于病毒基因组的质粒DNA可以拯救出Bm BDV,通过杆状病毒装载VD1全基因组可获得Bm BDV样的病毒颗粒,表明我们已建立了Bm BDV的反向遗传学系统,为通过基因缺失或突变的方式研究Bm BDV的基因功能提供了平台。

2、Bm CPV反向遗传学系统的研究利用片段搭桥和同源重组等方法对Bm CPV 基因组10个分节ds RNA片段的全长c DNA进行了克隆,并用T7启动子分别控制10个分节ds RNA片段的全长c DNA,克隆进p IZT-V5/His载体,获得了重组质粒p IZT-CS1—p IZT-CS10。同时,用Ds Red基因替换Bm CPV S10片段c DNA中的多角体蛋白基因的开放读码框(ORF),构建了重组质粒p IZT-CS10(Ds Red)。

以线性化的p IZT-CS1—p IZT-CS10为模板,体外转录成Bm CPV10个基因组片段的RNA,转染家蚕培养细胞,发现转染细胞表现出发病症状;Western blotting和免疫荧光能够检测到Bm CPV基因的表达蛋白;Real-time PCR结果显示,转染细胞中Bm CPV基因的明显上升,说明体外转录的病毒基因组片段的RNA 转染家蚕培养细胞可拯救出具有复制能力Bm CPV;进而,将Bm CPV S1-S9片段的体外转录RNA与p IZT-CS10(Ds Red)为模板的体外转录RNA共转染家蚕Bm N细胞,6天后将转染细胞的培养上清转接正常细胞,转接细胞发出红色荧光,随着培养时间的延长,荧光细胞的比例逐渐增大,说明S10片段为Bm CPV复制必须片段,病毒衣壳蛋白识别包埋S10片段的位点位于非编码区。上述结果表明,通过建立的基于体外转录的病毒基因组片段的RNA转染家蚕培养细胞拯救Bm CPV系统可以用于研究Bm CPV的基因功能,可通过将外源基因导入Bm CPV基因组的复制非

必须片段构建重组Bm CPV表达外源基因或通过类似策略研发重组CPV生物杀虫剂。

3、不同抗性家蚕品种感染家蚕质型多角体病毒的中肠组织比较转录组学研究为了探讨品种间Bm CPV的抗性产生机制,我们通过RNA-Seq测序技术,比较分析了家蚕蓝5(Lan5,Bm CPV易感品种)和欧17(Ou17,Bm CPV抗性品种)感染家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)后中肠组织的基因表达谱。测序结果显示,在感染的Lan5、Ou17中肠组织中,上调表达基因数量分别为330和218个,而下调表达基因数量分别为147和260个。

我们对Lan5与Ou17中肠组织差异表达基因(DEGs)进行了GO(Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes)富集分析,并利用STRING数据库分析了Lan5与Ou17中肠组织共同上调/下调基因的相互作用。结果显示,部分共同差异表达基因相互作用并形成网络,在共同上调表达基因中,表皮蛋白Cpr62Bc和微型染色体维持蛋白5(DNA复制许可因子Mcm5)的作用至关重要,而在共同下调基因中,热激蛋白23(Hsp23)的作用最为关键。

研究结果为进一步探讨家蚕抵抗Bm CPV病毒侵染的免疫机制、明确不同家蚕品种的抗性差异提供了新的线索,也为深入研究其中的关键基因奠定了基础。

BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV的感染应答

BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV 的感染应答 家蚕浓核病毒(Bm BDV)能特异性地侵染家蚕中肠组织的柱状细胞,是家蚕软化病的病原。Bm BDV的基因组由两种不同的单链DNA,VD1(6,543 nts)和 VD2(6,022 nts)构成,病毒粒子中只含有两种DNA分子中的一种。 目前还没有一种细胞系可感染Bm BDV,也不能通过基因操作改变Bm BDV的基因研究病毒基因的功能。家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)基因组由10个分节ds RNA片段组成,每个ds RNA片段含有一个完整的开放阅读框(ORF)。 由于Bm CPV为ds RNA,且缺乏Bm CPV的敏感细胞系,无法通过基因敲除或敲入研究Bm CPV基因功能,导致Bm CPV基因功能研究几无进展。不同的家蚕品种对Bm CPV的抗性存在差异,但品种间的抗性差异机制仍有许多不明之处。 基于目前的研究现状和存在问题,我们开展了基于Bm BDV基因组DNA质粒拯救病毒研究、基于体外转录的病毒RNA转染细胞拯救Bm CPV研究,期望为Bm BDV 和Bm CPV基因的功能研究提供新的系统;同时,利用RNA-Seq技术,研究了不同抗性品种家蚕感染Bm CPV后,中肠组织基因组转录水平的变化,期望为理解家蚕对Bm CPV的感染应答及抗Bm CPV的分子机制提供新的线索。1、Bm BDV反向遗传学系统的研究为了提供Bm BDV基因功能的研究平台,将含有Bm BDV VD1基因组的重组质粒p GEM-VD1转染家蚕卵巢(Bm N)细胞,发现细胞表现出明显的细胞病变;Western blotting与免疫荧光皆能检测到Bm BDV基因的表达。 同时,我们通过Bac-to-Bac载体表达系统构建了装载VD1全基因组的重组杆状病毒Bm Bac-VD1,该重组病毒基因组DNA转染Bm N培养细胞,可观察到细胞出现明显病变,将培养上清转接正常Bm N细胞,表现出相同的病变;Western

圆环病毒反向遗传学研究系统的建立

第三节圆环病毒科的繁殖与复制 一、吸附与穿入 Misinzo等[9]的研究结果表明硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸软骨素B(CS-B)参与了PCV-2的吸附，而细胞表面的蛋白聚糖可能是与PCV-2相互作用的第一个配体受体，它是病毒进入宿主细胞所必需的。此外，通过PCV-2感染缺少氨基葡萄糖(GAG)的CHO细胞研究发现，PCV-2可能还需另一个受体进入细胞。这一点与单纯性疱疹病毒、猪动脉炎病毒、腺病毒2型和腺联病毒2型等病毒很相似。对于这些病毒而言，蛋白聚糖是介导病毒吸附和聚集细胞表面抗原的复合受体。此外，用肝素琼脂糖层析技术研究发现PCV-2和PCV-2的病毒样颗粒(VLP)直接与肝素相互作用。Bratanich等[10]利用DDRT-PCR技术对感染PCV-2的猪与健康猪的淋巴结组织进行差异性比较分析，发现有两种基因的转录本丰度显著增高，其序列与人的RNA剪接因子和透明质酸介导的细胞运动受体基因有一定同源性，提示细胞在感染PCV-2过程中，它们可能参与了病毒的吸附过程。 二、基因组复制与转录 圆环病毒的基因组是采取滚环复制(rolling circle replication，RCR)的方式进行复制的。在复制过程中，病毒首先产生双链的复制型中间体(dsDNA)，该复制型中间体2条DNA链都能进行基因转录和蛋白质的表达。PCV最小的DNA复制起始区(ori)位于大小约111bp的基因片段内，包含基因间隔区及rep基因和cap基因的不同翻译起始元件。PCV-1和PCV-2基因间隔区同源性约为75％，而切割位点侧翼的60个核苷酸序列同源性大于90％，并具有相似的功能基序。ori呈茎一环样结构，PCV-1环包含12核苷酸序列(CTGTAGTATTAC)，PCV-2环包含10核苷酸序列(TAAGTA TTAC)，二者存在共同的8核苷酸序列(AGTATTAC)，其他圆环病毒、微病毒和双粒病毒基因组均存在相似序列。环的侧翼序列为包含11个核苷酸的倒置重复序列，形成回文结构。茎一环右臂存在4个保守的6核苷酸序列：CGGCAG(H1、H2、H3和H4)，其中，H1与H2相连、H3与H4相连，二者间隔5个核苷酸。 PCV-1基因组的复制依赖于Rep蛋白。Rep蛋白转录子中有一段内含子，如果此内含子被剪掉，则翻译出一个较短的蛋白质，即Re p′蛋白。Rep蛋白单独不能启动病毒复制，必须与Rep′蛋白共同作用，才能启动PCV-1的复制。研究发现，复制起始蛋白的启动子P 基因位于rep基因的上游，并与PCV-1的复制起始点重叠；结构蛋白的启动子P基因则位于rep编码区内部。Rep、Rep′蛋白都可结合包括P启动子在蛋白质结合位点。此外，位于病毒复制起始处有一段111bp DNA片段内具有一个环内保守的九聚体(5′TAGTATTAC-3′)的特征性茎-环结构。由于在这段序列中2次出现CGGCAGCGGTCAG序列，因而推测这可能是启动滚环复制的Rep蛋白结合位点。 PCV-1共有12种RNA，包括1个病毒衣壳蛋白RNA(CR)，8种与复制相关的RNA(ReP、Re p′、Rep3a、Rep3b、Rep3c-1、Rep3c-2、Rep3c-3和Rep3c-4和3个与NS相关RNA(NS462、NS642、NS0)。8个与Rep相关RNA都有相同的5′端和3′端核苷酸序列，同时和3个与NS相关RNA都有相同的3′端核苷酸序列。Rep蛋白是引起其他7种与Rep相关RNA剪接的前转录物，而3个与NS相关RNA则是由位于ORFl内部、独立于Rep启动子的3个不同启动子转录的。 PCV-2在PKl5细胞中复制时共检测到9种RNA，包括1个核衣壳蛋白RNA、5个与复制相关的RNA(Rep、Rep′、Rep3a、Rep3b、Rep3c)和3个与NS相关的RNA(NS515、NS672、NS0)。运用突变技术分析研究PCV-2蛋白合成及DNA复制过程中所涉及的PCV-2的每个转录单位。结果表明，在CR的5′端引入一个终止子不能影响Rep相关抗原或病毒DNA 的合成，改变其他RNA的剪接位点附近的序列或者在NS0 RNA中引入终止子对病毒蛋白

基于MultiBac的BmCPV病毒VP4基因克隆和表达

基于MultiBac的BmCPV病毒VP4基因克隆和表达 王峥豪;曾小群;刘子成;赵永超;任菲菲;孙京臣 【摘要】家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)的S6片段即VP4基因(1686 bp)是该病毒的重要基因,实验以VP4和GFP基因为模板进行PCR扩增克隆,经由pFBDM质粒载体转化入大肠杆菌TOP10中,应用MultiBac多基因高效表达平台表达目的蛋白,使用荧光显微技术、SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定表达产物.研究结果表明重组表达质粒pFBDM-VP4-GFP构建成功,VP4蛋白正常表达,为BmCPV病毒VP4蛋白的结构和功能研究奠定了基础.相比于传统脂质体转染技术,MultiBac多基因高效表达平台具有低成本、效率高、蛋白表达稳定性好、获得蛋白时间周期短等优点. 【期刊名称】《广东蚕业》 【年(卷),期】2018(052)012 【总页数】4页(P1-3,5) 【关键词】BmCPV;VP4;MultiBac表达系统 【作者】王峥豪;曾小群;刘子成;赵永超;任菲菲;孙京臣 【作者单位】华南农业大学动物科学学院广东广州 510642;华南农业大学动物科学学院广东广州 510642;华南农业大学动物科学学院广东广州 510642;华南农业大学动物科学学院广东广州 510642;华南农业大学动物科学学院广东广州510642;华南农业大学动物科学学院广东广州 510642 【正文语种】中文

【中图分类】S88 质型多角体病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus, CPV)，属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，质多角体病毒属(Cypovirus)，是一种典型的dsRNA病毒[1, 2]。CPV病毒的宿主域较为广泛，主要感染鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目昆虫， 病毒无囊膜，具单层衣壳[3]；病毒粒子为对称的正20 面体，直径约50 ~65 nm，病毒衣壳上具有12 个顶点[4]。CPV基因组通常有10 条独立的dsRNA构成，而本实验所研究的VP4基因位于BmCPV基因组的S6片段[5]。近期有关BmCPV 入侵和增殖机制的研究也取得显著进展，Wu[6]等用miRNA数据分析得到家蚕体内抑制BmCPV侵染的相关基因，过量表达的miR-278 -3p对家蚕体内BmCPV 增殖有显著抑制作用[7]，而Pan[8]等也通过对3条BmCPV的RdRp基因合成的dsRNA的研究，发现其具有抑制BmCPV增殖的作用。 细胞转染技术是指将外源DNA或RNA导入真核细胞获得新的遗传特性的过程[9]。脂质体复合物转染因为具有无免疫原性、组织毒性小、易于制备的特点，现已成为最常用的基因转移方法，但是目前该技术也存在脂质体复合物转染靶向性不强、转染率低的缺点，导致蛋白表达量低、持续时间短、稳定性差[10 -11 ]。而 Ikeda[12 ]等人在表达BmCPV的VP3基因时，利用杆状病毒表达载体，实现了 与BmCPV多角体蛋白基因共表达。本实验将采用MultiBac多基因高效表达系统，实现BmCPV病毒VP4基因的表达。 用于RNA提取的BmCPV病毒由本实验室繁殖和纯化；感受态细胞（Top菌株）购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒pFBDM由Richmond教授和Berger博士惠赠。含有AcMNPV-Bacmid的E.colisw106 菌株为本实验室构建保存，sf9 细胞由实验室保存培养。 限制性核酸内切酶（KpnⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和BssHⅡ）购自NEB公司； T4DNA连接酶购自ThermoScientific公司；Taq酶及PCR试剂、DNA分子量