冰冻切片免疫荧光间接法实验

实验报告

3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。

4.注意：

1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。

2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）

分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。

3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。

4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。

5）切片甩干，擦去多余PBS。滴加适量的二抗，盖好湿盒。于37℃恒温培养箱孵育2小时。注意加二抗过程及孵育过程中避光。

6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。

7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。于37℃继续孵育8分钟。注意实验过程中避光。

8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。

9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。

4.封片

1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。

2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边

5.镜下观察

立即用荧光显微镜观察。

注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。

免疫荧光双染

免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走）， 在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1? （TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二

抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。 8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。 (紫 外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm， 发射波长515-555?nm；CY3 红光激发波长510-560，发射波长590nm) 石蜡切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15- 20min-二甲苯 n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长) 。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)， 在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释)覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min 。 3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?(TdT)? 和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内， 37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、？BSA封闭:将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。

免疫荧光双染

免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021

免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定 10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在 圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。

冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程 (表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT； （3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜； （5）PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时； （7）PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项： （1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂 0.3%TrixtonX100。 附注2：所用液体（表面分子染色不用 0.3%TrixtonX100）： （1）pH 7.4

0.01MPBS： 配方为： 0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS配方为： Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2- 7.4 （2）洗涤液： 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装 1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4

免疫荧光染色SOP

免疫荧光染色SOP 肾活检冰冻切片免疫荧光染 色（直接法） 一．试剂 1.冷冻包埋剂OCT 2.荧光抗体：IgG-FITC （1：100），IgA-FITC（1：200），IgM-FITC（1：300）， C3-FITC（1：100）， C1q-FITC（1：150） 3.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 4.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ）二．取材 1.准备液氮罐、冷冻架、塑料小凹、OCT 2.活检标本取出后，立即浸入塑料小凹OCT中，置液氮罐 内冷冻架上速冻约10秒 3.置恒冷切片机内立即行冰冻切片（切片厚度为3um） 三、固定 1.待冰冻切片充分干燥后，立即放入纯丙酮固定7min，吹干，收至低温冰箱保存。 2.固定后的冰冻切片已干燥，可直接染色，如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干，方可染色。 四、抗原抗体反应过程 1. IgG , C3加一抗前用TBS孵育15min， IgA，IgM ，C1q 加一抗前用10%小牛血清封闭15min。（10%小牛血清为PBS稀释） 2. 去除多余液体，加稀释好的抗体，避光，湿盒内室温孵 育40min

3. 流水冲洗，置95%酒精2min，吹干 4. 甘油封片，荧光显微镜观察结果 五、注意事项 1.冷冻标本时间要掌握好，防止过软或碎裂 2.切片温度需适宜，不宜过高或过低 3.染色过程中必须防止切片干燥，严格避光 4.多聚赖氨酸、丙酮、酒精、缓冲液必须及时定期更换 肾活检石蜡切片免疫荧光染 色（间接法） 一、试剂 一抗：IgG（1：50）IgA（1：50）IgM（1：50）C3（1：50）C1q（1：50）以上均为 DAKO公司产品 1.二抗猪抗兔-FITC （ 1：50，DAKO公司） 2.EDTA(PH=8.0) 3.胃蛋白酶（Invitrogen） 4.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 5.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ） 二、方法 1.光镜石蜡切片脱蜡、入水 2.用高温高压修复15min(EDTA, PH=8.0)，冷却后水洗 3.胃蛋白酶室温消化5 min，水洗 4.10%小牛血清封闭（10%小牛血清为PBS稀释） 5.去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温或4度过 夜 6.PBS冲洗2min。

冰冻切片的免疫荧光

免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白

7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min

免疫荧光双染完整版

免疫荧光双染完整版 免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN] 免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全 干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按 2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加 用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内

4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在 圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染 液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用 抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330- 380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇 Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按 2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱

免疫荧光双染

精心整理免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫 荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在 圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。

抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm， 发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。

抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm， 发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2 (1) (2) (3)

免疫荧光双染

免疫荧光双染 免疫荧光双染 Document number【AA80KGB-AA98YT-AAT8CB-2A6UT-A18GG】 免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、?冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮 固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流 走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵 育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、?加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂 1?(TdT)?和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、?BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭

30min。 6、?加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一 抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、?加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、?DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除 PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫 外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯 Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流 走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）

冰冻切片免疫荧光间接法实验

实验报告

3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。 4.注意： 1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。 2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）

分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。 3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。 4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。 5）切片甩干，擦去多余PBS。滴加适量的二抗，盖好湿盒。于37℃恒温培养箱孵育2小时。注意加二抗过程及孵育过程中避光。 6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。 7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。于37℃继续孵育8分钟。注意实验过程中避光。 8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。 9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。 4.封片 1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。 2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边 5.镜下观察 立即用荧光显微镜观察。 注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。

免疫荧光方法【精品】

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤： （1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （2）固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min. （3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. （4）封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. （5）一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. （6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 （7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 （一）细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （二）固定和通透 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：