冰冻切片免疫荧光取材
冰冻切片免疫荧光取材
2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。
2.1.5.1 标本制备
1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，
先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），
将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；
2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。
3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；
脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；
4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；
5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。
6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。
2.1.5.2 免疫荧光染色步骤
1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；
2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；
3) PBS 洗10min×3 次；
4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；
5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；
6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；
7) 一抗：甩去多余血清，不洗。滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。阴性对照用PBS替代一抗；
8) PBS 洗10min×3 次；
9) 二抗：滴加Alexa Fluor488 标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h；
10) PBS 洗10min×3 次；
11) Hochest33342 复染核10~20min；
12) PBS 洗10m in×3 次；
13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内；
14) Olympus F1000 激光共聚焦显微镜用488nm 波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。
冰冻切片免疫组化步骤
冰冻切片免疫组化步骤 1.需要准备的材料 APES包被的载玻片 PBS（） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 3.免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入L的甘氨酸。 孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片 1.固定： 将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。 2.脱水： 为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。 3.透明： 常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。 4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。 先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5包埋: 以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。 6.切片: 切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。 7.贴片与烤片: 般使用恒温水浴锅，温度控制在37-401左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60^恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。 8.切片脱蜡及水化: 干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。 9染色: 经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。 免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
冰冻切片免疫荧光取材
冰冻切片免疫荧光取材 2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。 2.1.5.1 标本制备 1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)， 先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上）， 将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳； 2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。 3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水； 脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋； 4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用； 5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。 6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min
免疫荧光染色SOP
免疫荧光染色SOP 肾活检冰冻切片免疫荧光染 色（直接法） 一．试剂 1.冷冻包埋剂OCT 2.荧光抗体：IgG-FITC （1：100），IgA-FITC（1：200），IgM-FITC（1：300）， C3-FITC（1：100）， C1q-FITC（1：150） 3.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 4.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ）二．取材 1.准备液氮罐、冷冻架、塑料小凹、OCT 2.活检标本取出后，立即浸入塑料小凹OCT中，置液氮罐 内冷冻架上速冻约10秒 3.置恒冷切片机内立即行冰冻切片（切片厚度为3um） 三、固定 1.待冰冻切片充分干燥后，立即放入纯丙酮固定7min，吹干，收至低温冰箱保存。 2.固定后的冰冻切片已干燥，可直接染色，如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干，方可染色。 四、抗原抗体反应过程 1. IgG , C3加一抗前用TBS孵育15min， IgA，IgM ，C1q 加一抗前用10%小牛血清封闭15min。（10%小牛血清为PBS稀释） 2. 去除多余液体，加稀释好的抗体，避光，湿盒内室温孵 育40min
3. 流水冲洗，置95%酒精2min，吹干 4. 甘油封片，荧光显微镜观察结果 五、注意事项 1.冷冻标本时间要掌握好，防止过软或碎裂 2.切片温度需适宜，不宜过高或过低 3.染色过程中必须防止切片干燥，严格避光 4.多聚赖氨酸、丙酮、酒精、缓冲液必须及时定期更换 肾活检石蜡切片免疫荧光染 色（间接法） 一、试剂 一抗：IgG（1：50）IgA（1：50）IgM（1：50）C3（1：50）C1q（1：50）以上均为 DAKO公司产品 1.二抗猪抗兔-FITC （ 1：50，DAKO公司） 2.EDTA(PH=8.0) 3.胃蛋白酶（Invitrogen） 4.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 5.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ） 二、方法 1.光镜石蜡切片脱蜡、入水 2.用高温高压修复15min(EDTA, PH=8.0)，冷却后水洗 3.胃蛋白酶室温消化5 min，水洗 4.10%小牛血清封闭（10%小牛血清为PBS稀释） 5.去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温或4度过 夜 6.PBS冲洗2min。
冰冻切片免疫组化步骤
冰冻切片免疫组化步骤Prepared on 21 November 2021
冰冻切片免疫组化步骤 1.需要准备的材料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8um(5um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 3.免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含 0.25%TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。 孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。
冰冻切片步骤 很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1. 取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2. 速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5~10min，消除内源性过氧化物酶的活性。 5．免疫荧光染色： 冰冻切片室温晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可不洗） 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。 第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。 滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1
冰冻切片实验步骤
全部试验步骤 1取颖组织于4%多聚甲醛固定24 小时 230%蔗糖脱水48 小时以上 3-250C 包埋〔冰冻切片机内〕 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3 次。用3%过氧化氢孵育5~10 分钟，以消退内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗，5 分钟×2 次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗 ！ 冰冻切片不能用热修复啊！！ 以下是我的步骤： 1冰冻切片室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，PBS 洗，5 分钟×2。 25~10％正常山羊血清〔PBS 稀释〕封闭，室温孵育10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或4℃过夜。 3PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4滴加滴加其次代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30 分钟。 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30 分钟。 6PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 7显色剂显色〔DAB〕。 8自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇 溶液，室温20 分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml 甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次颖配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，消退内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。