哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统

按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。

研究现状

①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。

②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。

③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。

1 表达载体

1．1 表达栽体的类型

哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。

根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。

质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。

附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同，附加体型表达载体主要分为4大类，表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。

载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核

生物基因高表达载体必须具有如下调控元件：

①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。目前采州的哺乳动物细胞表达戟体大都带有来自pBR322的衍生质粒如pX[3、pBRd和pM[的原核序列；

②启动子和增强子；

③剪接信号；

④终止信号和poIyA加尾信号。

为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞．还必须加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dh]r)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。

1．2 表达载体的结构元件

哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子／增强子是表达载体中最重要的元件，我们这里仅对它做简要介绍。

外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。

启动子需包含两个识别序列：mRNA转录起始点和TA TA盒。TATA盒位于转录起始值点上游25--30bp处，是引导RNA聚合酶在正确起始位点转录所必需的序列，即保证转录的精确起始。其他上游启动子元件常位于TA TA盒上游100~200bp之间。其功能是调节转录的起始频率和提高转录效率。启动于和增强子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞的娄型选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高效表达。目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三种启动子驱动目的基因的表达。近年来又发现了一些新的强启动子：如人leukosialin基因同和鼠3-磷酸甘油激酶l(PGKI)基因启动子，活性与CMV-IE相当；人编在蛋白(ubiquitin)C基因启动子不仅具有较高的活性，而且比CMV-IE、PGK1等启动子有更广泛的宿主细胞范围，几乎在转基因小鼠的所有组织细胞中都具有较高活性。核内小RNA(snRNA)启动子亦具有与CMV-IE相近的活性，此前认为该启动子的转录产物不具有正常mRNA的修饰过程和功能，虽然转录同样是由RNA聚合酶Ⅱ完成；但Bartlett等的研究显示，Ul snRNA启动子合成的lacZ基因RNA可被正确地在5’端加帽和3’端加polyA 尾，并与核糖体结合引导Iacz蛋白的翻译。

常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列和人巨细胞病毒增强子。james等利用糖皮质类周醇诱导的鼠乳房瘤病毒(MMTV)启动子和鼠乳房痛病毒长末端重复序列(MMTV-LTR)，在CHO细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的SV40和CMV 启动子的10倍，超过0.4mg/ml。

构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径，比如由人ubiquitin C启动区序列与CMV增强子组成的杂合启动子、由SV40早期启动子和人I型T淋巴细胞病毒LTR 中的增强子序列(R-U5片段)组成的SR-α启动子的活性均与CMV-IE相当；而由鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子不仅活性比CMV—IE高，而且具有更为广谱的宿主细胞范围。Novagen公司的pBacMam表达系统即是以该杂合启动子驱动目的基因的转录。

另一类杂合启动子是由活性很低的启动子与数个转录激活因子结合位点串联而成，这些位点与转录激活因子的结合受细胞外小分子药物的调控；这类启动子主要用作基因的诱导表达。如Invitrogen公司的ecdysone诱导表达系统，其负责目的基因转录的启动子是由热休克蛋白启动子核心序列(minimal promotor)和5个E/GRE元件组成；Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。

另外，在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录的基因，如编码红细胞生成素(EPO)转铁蛋白、血红素加氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件(CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导低氧诱导作用因子-1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录，在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。据报道红细胞生成素启动子在1%氧浓度比在21%氧浓度下活陛增强100倍。这又是一种新的提高表达量的作用机制。

2 宿主细胞

哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。

常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。

COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生比，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平，但大肠杆菌表达的动物蛋白能进行正确的翻译后加工如糖基化和三维结构的形成，不具有与天然抗体相似的功能活性，且在人体内易于清除。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌型蛋白，例如细胞表面的受体或细胞外的激素和酶，则不能在原棱细胞中表达。而哺乳动物细胞表达的蛋白则具有天然蛋白的生物学活性。为提高哺乳动物细胞的蛋白表达量，需选择合适的表达载体和有效的启动子和增强子。

近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)，Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层贴壁培养情况下表达量达10 ms/L。作者认为如此高的表达量可能与MDCK细胞的特性有关，因为同样的载体在CH0细胞中仅得到低水平的表达。

在球蛋白基因簇上游50kb处发现有一区域在红细胞系的细胞中起调控基因表达的作用，称为位点控制区域(LCR)，LCR可调整附近区域染色体的结构并增强球蛋白的转录活性。一些外源基因如thy-l和TK基因与LCR相连后均可在红系细胞中高表达，而且表达水平与载体的插入位点无关，这一特性使得红系细胞颇受关注。MEL—E9是目前常用于重组蛋白表达的红系细胞株，它来源于感染了SSF病毒(spleen focus forming virus)的N小鼠的脾细胞。

对现有细胞株选择性地进行遗传改造是提高重组蛋白表达水平的重要手段。BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VPI6蛋白的BHK细胞，由于VPI6的转录激活作用，载体中的HSV早期启动子在该工程细胞中有很高的活性；已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因子等在内的多种蛋白的高效稳定表达。基于腺病毒EIA

蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建立了稳定表达EIA的CHO细胞株，在该细胞中重组前胶原酶的产量与CHO细胞相比增加了l2倍；该细胞在多种抗体的表达中亦取得满意的结果。对细胞其它特性的遗传改造，包括细胞生长周期的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋白糖基化的模式及细胞乳酸的合成等方面，亦有相关报道，其实际应用价值有待得到更多实验数据的支持。

3 表达系统

根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。大规模的瞬时表达技术是近年来的一个研究热点。已有报道能放大到100 L反应器中生产重组蛋白，产量(分泌型蛋白)可达l~10 mg/L。不过该方法技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。

稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。Geisse等以白血病抑制因子的制备为例，比较了几种不同稳定表达体系在产量及时间上的差异(表3)，把目的基因定点整合入染色体高活性位点有望能在较短时间内获得高表达细胞株。如通过Cre或Flp重组酶的作用，将带有相应同源臂的目的基因替换出插入在高活性位点的报告基因。Koduri等甚至证实还可直接通过同源重组作用将目的基因插入至已知的高活性位点区(即体细胞打靶技术)。另外，近年来还报道了一些筛选高表达克隆的新方法，如影印法、固相筛选技术等，对缩短实验时间甚有帮助。

诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异性低和毒性高等诸多缺点；近几年以突变的或非哺乳动物细胞来源的调控蛋白为平台建立了一些新的诱导表达系统(表4)，在这些系统中外源基因的表达本底低，诱导倍增效应高，药物诱导后目的基因的表达可提高数万倍。而且，参与诱导调控的因子与细胞内源性的因子间无相互作用，因此一方面目的基因的表达本身不受细胞内环境改变的影响，另一方面诱导药物对内源基因的表达无作用，因而具有很好的严谨性和特异性。当然，这些系统也存在有待改进的问题，如ecdysone 系统的诱导倍增效应偏低，Tet-On或Tet-0FF系统中的调控蛋白VP16有一定的细胞毒性，诱导药物四环素还可能影响某些细胞的生长、分裂期。

4 表达系统的选择

对于一个表达实验，选择何种表达系统应根据实际需要来决定，如表达蛋白的需求量、用途、实验所需时间及对细胞的毒性。选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细胞的合理搭配问题：比如若以BHl/VP16为宿主细胞，则表达载体最好选用HSV早期启动子驱动目的基因的表达，因为该启动子受VP16的转录激活；LCR元件只有在红系细胞中才有消除整合位点的位置效应的功能，因此如果要发挥载体中LCR的功能，则可考虑选择IVlEL-E9细胞；在肝细胞中CMV启动子活性低，此时可考虑选用其它的启动子；使用附加体型表达载体时，应选择其对应的复制允许细胞，等等。

哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性等；而且某些理论上可信的设计在实验中不一定可行，比如含LCr{的载体在MEI，．E9细胞中有时并不能消除整合位点的位置效应嗍，外源基因在染色体高活性位点的定点整合也不一定能获得高表达御，等等。因此如果需获得一个基因的高表达。最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。

5 提高蛋白表达产量的措施

哺乳动物细胞对培养环境十分敏感，营养和生长因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性

代谢物的积累、机械搅动以及培养压力的增加等很多固素都可诱导细胞凋亡。大量细胞的死亡严重影响蛋白的表达产量。现已证实，有些基因能抑制细胞凋亡，如Bcl-12和BcI-x能抑制许多因素诱发的细胞凋亡，以及某肿瘤细胞从贴壁培养转入悬浮培养而诱发的细胆凋亡。A1ison等报道，感染dSsV CAT病毒载体的BHK Bcl-12和CHO BcI-x细胞生存期均延长数倍。BHK Bel 2、HHK BcI-x均使感染SFV II l!的细胞恢复生长到对数生长期的细胞感染后可存活达9 d，LL12的产量提高一倍。有些化学制剂也能抑制不同阶段的细胞凋亡，如乙酰半胱氨酸tNAC、吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC)等以及caspase抑制剂Z-VAD fmk、YV AD，cmk等，从而大大增加表达蛋白的产量。如利用NAC和z -V AD fmk的细胞培养，表达蛋白的产量分别提高2.2和3.9倍。细胞凋亡的抑制不仅延长细胞的存活期，提高蛋白的产量，而且有利于下游的纯化过程。

在细胞大规模培育过程，细胞的持续大量增殖使蛋白表达很快进入衰退期。同时由于营养缺乏，细胞大量死亡使细胞产品的产量下降，死亡的细胞释放蛋白酶和糖苷酶使表达产物降解，产品质量下降。为获得产物的大量有效表达，必须控制细胞在达到最适表达产物期停止增殖。现已发现四环素抑制表达系统(Tctoff)可严格控制细胞增殖过程。外源基因和抑制细胞生长的基因(如P27)在同一个双顺反子表逸单位，在可稠节的启动子(Tot off)作用下使细胞增殖期与增殖抑制产物表达期分开。细胞生长和产物表达都能达到最大程度。Tot off 基因表达系统的优点在于毒性低，作用快，不影响哺乳动物细胞的代谢过程。由于四环素很不稳定，易于氧化脱水、芳香基化和表易构化作用，使Tot基因表达系统成为一个高效、无毒、具有严密开关功能(Trt switch)的可诱导性基因表达系统，仅受四环素初浓度的影响，终产物中四环素自发降解，有利于下游的纯化过程。这种Tel基因表达系统控制的蛋白表达方式，因使细胞生长期和产物袁达期分开而适用于生产使细胞具有代谢负担或毒性的蛋白产物。mazur等报道利用该系统，在作用于细胞周期的激酶抑制子p27诱导下，使CHO细胞成功地达到持续生长抑制期，表达分泌型碱性磷酸酶SEAP(一种典型的外源糖蛋白)水平提高10~15倍。

在孵育批量培养中，通过减少葡萄糖和谷胱甘肽的量，使细胞代谢发生改变，以减少代谢产物乳酸、胺的形成，使细胞培养达到一种稳定状态，细胞浓度和蛋白产物大大增加。

目前的生物工程要求使用第三代无血清培养基，即无血清无蛋白(或含量极低)的双无培养基，使细胞培养很容易做到恒定，细胞分泌的的蛋白更易分离纯化，培养基的成本大为下降。随着基工程技术研究的深人，利用哺乳动物细胞表达蛋白产物的有效方式必将得到进一步发展，其在工业生产中的开发应用必将促进基因工程药物的大量生产。

发展趋势

在目前和今后若干年内(至少到本世纪末)，以下两种系统没有根本解决之前，哺乳动物细胞作为一种日趋成熟的表达系统，仍然会受到研究人员和产业家的重视，并将成为基因工程研究中十分活跃的领域，众多的产物必须依靠这种系统进行表达与生产。尚未解决的两个基因工程系统是：

①可表达复杂的真核基因的真核微生物系统或改造的原核微生物系统；

②用作生物反应器的转基因动物系统。

研究方向

大致有两方面，

①探讨一些陆续发现和纯化的糖蛋白和具有复杂结构(如多亚基)的蛋白的表达以及与天然蛋白的比较，包括生物活性、物化性质甚至一级结构。

②提高表达水平。这是哺乳动物表达系统的关键问题。目前看来，仍然需要从以下途径进行研究：①除现有的MT启动子、热休克启动子、病毒启动子，应发展一些新的强启动子。②寻找合适的增强子，特别是细胞增强子。③提高基因剂量的新途径。因dhfr

放大子(amplicon)只能用于CHO dhfr-细胞株。④选择载体-宿主的最优组合。⑤装配适合于cDNA高效表达的必要元件。因目前cDNA在哺乳动物细胞中表达水平一般均低。

当然，大规模培养条件和无血清及无蛋白培养条件的探索也是与哺乳动物细胞表达系统密切有关的问题，但这是属于另一领域的课题。其中值得提及的是研究某些生长因子基因在导入哺乳动物细胞后，其表达产物有可能使细胞脱离血清生长，这一途径对于哺乳动物细胞基因工程具有很大的吸引力。

我国在哺乳动物细胞表达系统方面研究不多，在乙肝表面抗原、tPA、生长激素等方面均有单位在研究中，表达水平也有高有低。我属现有的基因工程基础研究水平有很大局限性，故不可能去发展新的表达系统，但利用现有的基因元件，选择合适的载宿主系统以提高表达水平却是有现实意义的。今后应注意以下几方面的研究：

①提高cDNA表达水平的途径。因多数克隆的基因多是cDNA，尤其对于基因组很大的基因，只能用eDNA进行表达。

②探索提高基因剂量的非dhfr放大途径，如采用tk、ada或MT放大的可行性。

③利用若干能使外源基因产物在转晕后稳定性提高的基因元件或有利于此过程的宿主细胞。

④利用附加体(即染色体外基因)与整合在染色体上的基因，这两类外源基因在同一细胞中可以有共存性这一性质来大幅度提高外源基因的表达水平。这是新近国外发展的一种表达系统，值得进一步研究。

八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必

用于生产生物制品的建库哺乳动物细胞基质的制备_鉴定和检测.

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动物组织学复习题及答案

动物组织学与胚胎学复习题及答案 第一章组织学绪论 一、单项选择题1．光镜下观察组织石蜡包理切片厚度一般是 A.100um B.50um C.5-10um D.1um 左右 E.0.1-0.5um 2．透射电镜下观察的组织切片厚度一般是A.50-80nm B.5-10nm C.1-2nm D.100-500nm E.1um 左右 3．组织异染性的含义是 A.染色快速 B.染色困难 C.染色鲜明 D.染色需加还原剂 E.以上都不对 4．观察体外培养细胞首选的显微镜是 A.—般光镜 B.倒置相关显微镜 C.相差显微镜 D.暗视野显微镜 E.偏光显微镜 5．PAS 反应是检测组织内的 A.核酸 B.脂类 C.蛋白水解酶 D.多糖类 E.抗原 6．细胞的表现型是指 A.细胞结构和功能的特点 B .细胞分布状况 C .细胞功能静止和活动的变化 D.细胞形态结构的变化 E.细胞增殖状态 7．光镜组织切片和电镜组织切片 A.均为超薄切片 B.均用化学染料染色 C .均可制冷冻切片 D.均为固定组织 E.均可摄彩色照片 8．扫描电镜是主要用于观察 A.生物膜内部结构 B.细胞器的内部结构 C.组织和细胞的表面结构 D.细胞内的多糖 E .细胞核内的结构 9．组织的分类是根据 A.细胞的数量和密度 B .细胞排列的型式 C .细胞的代谢特点 D.细胞间质的组成 E.以上均不对 10．扫描电镜术不同于透射电镜术的一点是

A.组织勿需固定 B.勿需制备超薄切片 C.是以激光扫描标本 D.不在荧光屏上显像 E.可观察活细胞 二、多项选择题 1．冷冻切片的特点是 A.用树脂快速包埋 B.组织块可不固定 C .制片较迅速 D.细胞内酶活性保存较好 E.可制厚O.lum的切片 2．组织固定的意义是 A.使蛋白质迅速溶解 B.防止细胞自溶 C.使组织膨胀 D.使组织坚硬 E.防止组织腐败 3．组织化学术可检测组织内的 A.抗原 B.酶 C.脂类 D.糖类 E.核酸 4．现代组织学技术可显示和研究 A.细胞的受体分布 B.细胞内Ca2+等的含量测定 C.细胞内各种蛋白质的定位和定量 D.细胞内某种蛋白质的定位和定量 E.细胞运动，分泌,吞噬等动态过程5．透射电镜术中的组织块和组织切片 A.组织块大小与光镜术的相近 B.组织块用戊二醛,四氧化锇等固定 C.组织块石蜡包埋 D.切片用重金属电子染色 E.切片置在玻片上于电镜下观察 6．组织培养术 A.取新鲜组织和细胞 B.标本以高温灭菌 C.溶液和用具均需灭菌 D.标本培养于近似体内的条件下 E.可直接观察记录活细胞的行为 三、填空题 1 ．HE 的染色法的染料是________ 和 _______ ,组织切片中与前者亲和力强的着色结构称 ,与后者亲和力强的着色结构称,与两者亲和力均不强者称。2．组织块在包埋前需先经，常用的包埋剂是、和。 3．细胞间质是由 _______ 产生的，包括__________ 和 _______ 。 4．在光学显微镜下观察的固定标本除组织切片外，还有____________ 、_______ 和_______ 。5．银染法中若组织结构直接使硝酸银还原而显示的称为____________ ，若需加还原剂方能显示的 组织结构称 _______ 。 6．光学显微镜的最大分辨率是 ________ ，光镜下所见的结构称为_________ ；电子显微镜的分 辨率可达 _______ ，电镜下所见的结构称_________ 。 7．基本组织一般分为四大类，即 ________ 、_______ 、_______ 和 _______ 。

哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/5713425056.html, 哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展 作者：陆陈晨谭树华 来源：《科学与财富》2018年第13期 摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。 关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养 重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。 1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点 传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]： 1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化； 1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性； 1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。 2 细胞无血清悬浮培养的优势 细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。 3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法 3.1 分子生物学手段改造 贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表

pGL3-Promoter哺乳动物表达载体说明

pGL3-Promoter 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6010 pGL3--‐Promoter pGL3--‐Promoter载体基本信息 载体名称: pGL3-promoter, pGL3promoter 质粒类型: 荧光素酶报告系统载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: SV40 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5010bp 5' 测序引物及序列: RV primer3:CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 3' 测序引物及序列: GLprimer2: CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: -- 备注: 用于快速定量评估影响哺乳动物细胞特定基因表达的因子及其影响能力。 稳定性: 稳定 组成型: 非组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pGL3--‐Promoter载体质粒图谱和多克隆位点信息

pGL3--‐Promoter载体序列 ORIGIN 1 GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCCGG GCTCGAGATC TGCGATCTGC ATCTCAATTA 61 GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC 121 CGCCCATTCT CCGCCCCATC GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC 181 CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG

哺乳动物细胞冷冻保存

哺乳动物细胞冷冻保存 主要目的： （1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。 （2）减少细胞被微生物污染的危险性。 （3）减少细胞之间交叉污染的危险性。 （4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。 （5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。 （6）降低人力和物力。 冷冻保存要点： （1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30－60 分钟；然后转入-20℃，放置30 分钟；然后再转入-80℃放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到-3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存。 （2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 （3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。 （4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20％。 （5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO 作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。 特别注意： （1）细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。 （2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。 （3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。 常用细胞冷冻保存液： （1）10％DMSO ＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） （2）10％甘油＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）取对数生长期细胞培养物，离心200－400g 5 分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。 （2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到25－30ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养 DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。 特别注意：

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ 1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。 2、CHO细胞与293细胞有什么区别？ 答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长， （2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性， （3）能够表达与人相似的翻译后修饰。 此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。 HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。

3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什 么？ 答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1), 该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E 细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。该系统比常规的293F细胞表达量要高。 4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？ 答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进 行优化密码子。 蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。质粒质量：内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂 分子量较大或者太小：大于150KD表达会有一定的难度，小于5KD也会有难度。 有的表达量不低，但是纯化得率低（可溶性差，不挂住，不稳定，易降解） 难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗 摘要 动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。 传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。 研究背景 动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。 流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。世界卫生组织数据显示，每年有5%～15%的人会感染季节性流感，重症病例达三百万至五百万。 抗病毒药物常用作抵抗流感的应急药物。目前，获准用于流感病毒感染治疗的四种药物：金刚胺和金刚乙胺通过干扰病毒颗粒M2蛋白离子通道功能间接抑制病毒复制；扎那米韦和奥赛米韦是神经氨酸酶抑制剂，可以阻止病毒从细胞膜上正常释放。这些药物可以有效抑制流感病毒，但因其可能对人体产生不良反应及可能诱导耐药等缺点，面对大范围长时间的流感大流行，药物往往也无能为力。

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。

哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南-编制说明

国家标准《哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南》编 制说明 （一）工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做的工作等； 1、任务来源 本标准根据国标委公布的2018 年第四批国家标准计划项目（国标委综合号），本项目计划编号为20184467-T-469 ，名称为《哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南》。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。 本标准由深圳华大生命科学研究院联合起草。 2、目的和意义 确保用于生产用细胞基质、治疗性细胞产品，在体外培养过程中无细胞交叉污染，是细胞质量控制中的重要内容之一。随着国内干细胞及组织工程细胞在基础研究及临床应用研究中快速发展，进一步强调了对细胞间交叉污染检测的重要性。同时，细胞系作为体外模型被广泛应用于生命科学研究等领域，然而由于细胞系被交叉污染或错误鉴定而导致的研究结论错误、结果不可重复等问题，给生产、研究以及应用等造成了困扰。因此，准确判定所用细胞是否存在其他细胞的交叉污染，是保证细胞应用安全性的关键质控指标。 细胞交叉污染通常是由于在培养操作过程中同时用到多种细胞、混杂使用器具或液体、细胞培养过程中培养物的交叉污染以及随后污染细胞的过量生长、使用其它物种的滋养层繁殖人类干细胞或原始细胞时有意地共培养导致交叉污染或人类细胞系过生长，以及异种移植都会导致细胞交叉污染的发生。研究表明，自1960年以来，全球广泛使用的细胞系中，有超过400种细胞系证实被错误鉴定；至少有20%的存储在美国、欧洲和亚洲等各大实验室中的细胞系被误判或污染。然而，目前仍然缺少细胞交叉污染检测的标准和实施细则，因此建立一套标准化的、科学有效的细胞系交叉污染检测体系势在必行。 本标准提出了细胞交叉污染检测的基本原则和基本检测方法、方法选择原则和策略、检测要求和判定标准、质量控制等内容。本标准的建设可有效指导科研机构和涉及细胞相关的生产企业进行细胞交叉污染检测，对获得正确可重复性研究结果和确保基于细胞的相关生物制品质量具有重要意义。 3、协作单位

哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统 按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。 研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。 1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同，附加体型表达载体主要分为4大类，表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。 载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核

哺乳动物细胞培养基的基本要求

哺乳动物细胞培养基的基本要求 (一)营养成分 细胞生长繁殖所需要的营养成分包括氨基酸、单糖、维生素、无机离子和H 2 O。 氨基酸和维生素的添加量是有限的，某些氨基酸和维生素的添加量往往是凭经验的，通常与某个细胞系的建立过程有密切关系。例如，Fisher’s培养基含有高浓度的叶酸，这是因为L5178Y对叶酸的依赖性，在这种培养基的发展过程中，叶酸就被沿用下来了。 大多数细胞的培养基都含有葡萄糖作为能量来源，葡萄糖的主要代谢途径是通过无氧酵解产生丙酮酸，丙酮酸可转化为乳酸盐或乙酰乙酸盐，然后进入柠檬 酸循环被氧化成CO 2和H 2 0。培养基中乳酸的累积在培养胚胎及转化细胞时尤为 明显，提示体外培养时柠檬酸循环不能像多细胞机体内那样完全进行。有证据表明，碳源的大部分来自谷氨酰胺而非葡萄糖。这也解释了为何某些培养的细胞对谷氨酰胺和谷氨酸盐的需求异常高。 (二)促生长因子及激素 促生长因子及激素在商品干粉培养基或液体培养基中一般都不添加，含血清培养液的来源正是血清本身。在无血清培养基中+经常需要添加这些组分。 自然凝集的血清，与利用物理方法如离心法去除细胞得到的血浆相比，对于刺激细胞的增殖，效果更好。原因是，自然凝集的血清保留了更多的生长因子，如血小板生长因子。 (三)渗透压和pH 培养基中基础平衡盐溶液组成的盐类是维持渗透压平衡的主要化合物，这些 盐类主要包括Na一、K+、Mg2+、Cl一、SO 42-、Ca2+、POi 和HCO 3 -等。 大部分培养基的盐浓度是依据Eargle’s和Hank’s平衡盐溶液而来， Eargle’s平衡盐溶液的Hank，s浓度高，适合5％CO 2 的气体环境。Hank’s平 衡盐溶液的HCO 3 -浓度低，适 用于空气环境。5％CO 2 的气体环境中，培养液的pH稳定及调节依赖于溶解在培 养液的CO 2 气体和组成培养基基础平衡盐溶液的缓冲作用。

哺乳动物细胞培养手册

实用哺乳动物细胞培养手册 细胞培养基本概念 细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。 细胞培养目的与用途 1、科学研究：药物研究开发与基础研究 药物研究与开发 (1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。 (2) 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (3) 基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。 (4) 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 (5) 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 2、生物制药 (1) 疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (2) 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 2 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度

重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制

重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制 技术评价一般原则 二OO六年十月

目 录 1前言 1 1.1目的和意义 1.2适用范围 1.3局限性 2宿主细胞的选择 1 2.1宿主细胞来源、历史和一般特性 2.1.1宿主细胞来源和历史 2.1.2宿主细胞一般特性 3重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定 2 3.1目的基因来源 3.2表达载体的具体构建步骤 3.3载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选 3.4重组工程细胞的初步鉴定 4重组工程细胞库的建立 3 4.1细胞库建立 4.2建库细胞的管理 5细胞库检定 3 5.1细胞鉴定 5.1.1细胞种属的鉴定 5.1.2致瘤性试验 5.1.3目的基因和表达框架分析 5.1.4表达产物检测 5.2微生物污染检测 5.2.1细菌、真菌和支原体检查 5.2.2病毒因子的检查 5.2.2.1体外试验 5.2.2.2体内试验 5.2.2.3种属特异性病毒的检定

5.2.2.4逆转录病毒的检测 5.2.2.4.1感染性试验 5.2.2.4.2逆转录酶检测 5.2.2.4.3透射电镜检查 6细胞稳定性研究 6 6.1贮存条件下的稳定性 6.2传代/扩增过程中的稳定性 6.2.1基因水平的比较 6.2.2目的产物表达水平的比较 6.2.3细胞自身的稳定性 6.2.4内源因子检查 6.2.5 致瘤性监测 7 生产过程细胞质量控制 7 7.1常规生产过程监控 7.2细胞增殖限度 7.3其它风险性因素控制 8小结 8 9、名词解释 9 10、参考文献 10

1前言 对于结构复杂、带有糖基化修饰基团的抗体、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常需要借助哺乳动物细胞才能正确表达和修饰成具有预期生物活性的重组制品。随着生物工程技术的进步和发展，目前这些细胞应用不断增多。 在宿主细胞选择、重组工程细胞构建以及生产细胞的培养扩增和监控过程中，不仅要关注细胞的适用性、目的产物表达生产能力，同时还应当重视伴随细胞培养产生的内源性病毒、宿主细胞残余蛋白和DNA、致肿瘤成分等潜在的风险性因素对重组产品带来的安全性影响，在早期研究阶段，同步开展库细胞、生产培养过程细胞、生产终末细胞的全面检定和控制以及病毒和/或致瘤性成分的去除/灭活工艺的验证。 1.1目的和意义 经过全面检测的种子细胞是实现重组基因工程产品生产的前提和基础，使生产用种子细胞具有共同的始祖细胞，保持相同的遗传和生物学特征，在特定的培养环境和条件下持续稳定表达携带的外源目的基因；经过研究确定细胞在扩增培养和生产过程中的变化，才能够有效控制风险性因素，满足生产的持续需求，使产品质量保持一致。 本技术评价一般原则重在阐述重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制的基本内容和相关要求，以期引导开展全面完整的细胞质量试验研究、生产细胞培养工艺验证，建立系统规范的重组工程细胞库及实现生产过程细胞质量的有效监控。

昆虫细胞表达系统

昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；

【2014】EPI,哺乳动物细胞的非CG位点的甲基化

Introduction DNA methylation involves the addition of a methyl group to the 5th carbon atom of cytosine to create 5-methylcytosine. In most mammalian cells, the majority of 5-methylcytosine is found immediately preceding (5′) guanine residues and is referred to as CpG methylation. The mammalian genome is interspersed with regions of high CpG density, known as CpG islands (CGIs), which overlap the promoter regions of ~70% of human genes.1 DNA methylation has also been described in non-CpG con-texts, such as CpA, CpT, and CpC, which will be collectively referred to as non-CpG methylation throughout this review. First described in the plant genome,2 non-CpG methylation has since been found independent to, or coexisting with, CpG methyla-tion in various contexts within mammalian genomes. Non-CpG methylation occurs within various cell types and at specific stages during cell development; however, the functional significance of this in the mammalian genome is poorly understood. In this review, we will describe evidence for the existence of non-CpG methylation, specifically in mammalian genomes, and discuss the differences between CpG and non-CpG methylation, possible mechanisms of its establishment and maintenance, and the potential functions of this DNA modification. The Function of CpG Methylation in Mammalian Cells The function of CpG methylation is context-dependent 3; how-ever, it is most clearly understood as a mechanism of controlling gene expression. Changes in CpG methylation, histone modifica-tions and nucleosome positioning can alter promoter DNA acces-sibility and regulate the recruitment of DNA binding proteins, such as transcription factors. CpG methylation can also repress transcription by directly blocking the binding of transcription activating proteins.4,5 Although CpG methylation at promoters is associated with transcriptional silencing, high levels of methyla-tion within the gene body are associated with highly expressed genes.6 The enrichment of CpG methylation within gene bod-ies, particularly at exonic regions, may contribute to exonic rec-ognition and splicing by promoting the pausing of the RNA polymerase II complex at exons and increasing the probability of co-transcriptional splicing.7,8 Other functions of CpG meth-ylation include the regulation of interactions between enhancers and promoters through the regulation of specific DNA-protein interactions. For example, nucleosome occlusion and hyper-methylation of the distal enhancers of the NANOG /OCT4 and glucocorticoid receptor promoters prevents them from activat-ing these genes.9,10 The expression of the imprinted IGF2 gene is regulated by methylation at sites within the IGF2-H19 imprinted locus, which prevents binding of the CTCF insulator and allows interaction of the IGF2 gene promoter with its enhancer.11 CpG *Correspondence to: Luke Hesson; Email: l.hesson@https://www.sodocs.net/doc/5713425056.html,.au Submitted: 02/24/2014; Revised: 03/26/2014; Accepted: 04/02/2014;Published Online: 04/09/2014; https://www.sodocs.net/doc/5713425056.html,/10.4161/epi.28741 The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells vibha Patil, Robyn L ward, and Luke B Hesson* Adult Cancer Program; Lowy Cancer Research Centre and Prince of wales Clinical School; University of New South wales; Sydney, NSw Australia Keywords: DNA methylation, non-CpG methylation, non-CG methylation, epigenetics Abbreviations: B29, Immunoglobin β-Chain; CDKN2A, cyclin-dependent kinase inhibitor 2A; CGI’s, CpG islands; CTCF, CCCTC-binding factor; DNMT, DNA methyltransferase; EBF, early B-cell factor; ESCs, embryonic stem cells; GSTP1, glutathione S-transferase pi 1; GVOs, germinal vesicle oocytes; H19, imprinted maternally expressed transcript; hESCs, human embryonic stem cells; IGF2, insulin-like growth factor 2; iPSCs, induced pluripotent stem cells; LUMA, luminometric-based assay; MSRE, methylation sensitive restriction endonuclease; PDK4, pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4; OR, odourant receptor; PGC-1α, peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1 α; SOX2, sex determining region Y-box 2; SYT11, synaptotagmin XI; TNF-α, tumor necrosis factor-α; TP53, tumor protein p53; T2DM, type 2 diabetes mellitus; WGBS, whole genome bisulphite sequencing in mammalian genomes, the methylation of cytosine residues within CpG dinucleotides is crucial to normal devel-opment and cell differentiation. However, methylation of cytosines in the contexts of CpA, CpT, and CpC (non-CpG methylation) has been reported for decades, yet remains poorly understood. in recent years, whole genome bisulphite sequencing (wGBS) has confirmed significant levels of non-CpG methylation in specific tissues and cell types. N on-CpG methylation has several properties that distinguish it from CpG methylation. Here we review the literature describing non-CpG methylation in mammalian cells, describe the important characteristics that distinguish it from CpG methylation, and discuss its functional importance. ?2014 L a n d e s B i o s c i e n c e . D o n o t d i s t r i b u t e .