哺乳动物细胞蛋白表达FAQ

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ

1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。

2、CHO细胞与293细胞有什么区别？

答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长，

（2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性，

（3）能够表达与人相似的翻译后修饰。

此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。

HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。

3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什

么？

答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1),

该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E

细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。该系统比常规的293F细胞表达量要高。

4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？

答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进

行优化密码子。

蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。质粒质量：内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂

分子量较大或者太小：大于150KD表达会有一定的难度，小于5KD也会有难度。

有的表达量不低，但是纯化得率低（可溶性差，不挂住，不稳定，易降解）

难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白

5、促进蛋白表达的方式有哪些？

答：加可溶性标签GST,FC、加促表达标签GST、加表达量高的融合蛋白这些都是设计

选用高表达系统：比如293细胞较cho细胞转染效率要高，EXPI293或者Expicho系统表达较freestyle系统表达水平高，但是成本也较高。

表达优化：细胞系、质粒、转染试剂方面的实验优化

工艺优化：加辅料、低温、加葡糖糖、二次转染等方式提高表达量，延长表达时间。

6、是不是都能实现分泌表达？

信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电信号肽的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔．而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。

信号肽只是一个搬运工具，它能够促进蛋白搬运到胞外区，有的蛋白

胞内的组织蛋白或者结构蛋白等分泌能力较弱的蛋白可能就不能被

信号肽酶切除。

7、哺乳动物细胞蛋白表达体系可表达的蛋白大小范围？

10kd-120kd。

分子量大于150KD，小于5KD表达是有难度的，但是昆虫系统对大分子蛋白表达是有优势的，目前我们接触过250KD的蛋白用昆虫杆状病毒表达系统表达成功。

8、什么情况下需要选择哺乳动物细胞蛋白表达体系来表达？

答：生物药蛋白、分泌蛋白、糖基化修饰高的蛋白、需要活性蛋白、内毒素要求控制的蛋白亚细胞定位在胞外的蛋白。以上说明不代表昆虫不能做

9、表达得到的蛋白是有活性的么？

答：哺乳动物细胞蛋白表达系统表达的蛋白基本上有活性，但是蛋白不一样很多蛋白没有活性可能是蛋白本身原因，比如亲水性差，可溶性差，不稳定等。

八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必

(完整版)精准检验对流式细胞术的发展和质量控制要求

精准检验对流式细胞术发展和质量控制需求 盛慧明 2016年11月11日

一、流式细胞术发展历史和现状 二、流式细胞术的最新进展 三、BEAMing技术 四、流式细胞术的质量控制

一、流式细胞术发展历史和现状 二、流式细胞术的最新进展 三、BEAMing技术 四、流式细胞术的质量控制

一、流式细胞术发展历史和现状 流式细胞术Flow Cytometry 现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代，源于对细胞进行分选，所以最早是Fluorescence-activated cell sorting ，FACS；最早的omic 经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟并不断推陈出新，广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面； 是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术； 流式细胞术技术平台涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作 用。

流式细胞术完成FCM计数的主要历程 ◆1930年,Casperrsson 和Thorell 开始致力于细胞的计数; ◆1934年,Moldaven 是世界上最早通过光电仪记录细胞数量; ◆1940年,Coons 提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白; ◆1953年,Croslannd Taylor 应用分层鞘流原理,奠定了流式细胞术的液流技术基础; ◆1956年,Coulter 生产了Coulter细胞颗粒计数器; ◆1953年,Parker 和Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形; ◆1967年, Holm 等设计了汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电设备计数的装置; ◆1973年, Steinkmp设计了利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，达到计数和分选的 装置.

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量 控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在

用于生产生物制品的建库哺乳动物细胞基质的制备_鉴定和检测.

8Duan D,Yue Y,Yan Z,et al.A new dual-vector approach to enh ance r ecom binant adeno-as sociated virus-mediated gene exp ress ion thr ou gh in termolecular cis activation.Nat M ed, 2000,6:595-598. 9Gao GP,Lu F,S anm iguel JC,et al.Rep/Cap gene amplification an high-yield pr odu ction of AAV in an A549cell line exp ress ing Rep/Cap.M ol T her,2002,5(5Pt1:644-649. 10Collaco RF,Cao X,T rem pe JP.A helper virus-free pack aging sys tem for r ecom binant adeno-as sociated virus vectors.Gene, 1999,238:397-405. 11鲁晓春,李小鹰,马鑫,等.腺相关病毒载体对心肌细胞感染和外源基因表达的作用.中国临床康复,2003,7:4056-4057. 12Hoshijima M,Ikeda Y,Iw an aga Y,et al.Chr on ic s uppression of heart-failure progression by a pseudo ph os phorylated mutan t of phos pholamban via in vivo card iac rAAV gene delivery.Nat M ed,2002,8:864-871. 13Bartlett J S,W ilcher R,Samulski RJ.Infectiou s en try pathw ay of adeno-ass ociated vir us and adeno-ass ociated virus vectors.J Virol,2000,74:2777-2785. 14黄志军,袁洪,曾钧发,等.重组腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165 基因对缺血心肌血管新生的影响.中国动脉硬化杂志,2004,12:627-631.15S ugiyam a A,Hottori S,Tanaka S,et al.Defective aden oass ociated viral-m ediated trans fection of insulin gene by direct injection into liver parenchym a decreases b lood glucose of d iabetic mice.Horm M etab Res,1997,29:599-603. 16Yang Z,Chen M,Wu R,et al.Su ppres sion of autoimmune diabetes by viral IL- 10gene transfer.J Immunol,2002,168: 6479-6485. 17S hklyaev S,As lanidi G,T ennan t M,et al.Sus tained p eriph eral expression of trans gene adiponectin offs ets the development of diet-induced obesity in rats.Proc Natl Acad S ci USA,2003, 25:14217-14222.

传奇公司 CAR-T细胞产品的质量控制和非临床研究

介绍 1.CAR-T细胞质量控制1.1控制生产材料 1.2过程控制 1.3释放试验 1.4工艺验证 1.5稳定性研究 2.非临床研究 2.1实验室规范 2.2测试样本来源、分析 2.3体内药效学、药代动力学研究 2.4非临床安全性研究 3.质控要点 3.1基因修饰载体质量控制 3.2微生物安全 3.3其他

?嵌合抗原受体T 细胞（CAR-T，Chimeric antigen receptor T cell）是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T 细胞激活信号的遗传物质转入T 细胞，使T 细胞通过直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活，通过释放穿孔素、颗粒酶素B 等直接杀伤肿瘤细胞，同时还通过释放细胞因子募集人体内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的，而且还可形成免疫记忆T 细胞从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。目前，CAR-T 细胞对多种血液肿瘤显示了非常好的临床效果，对实体瘤治疗也表现出了非常大的潜力。CAR通常含有三个结构域：识别肿瘤相关抗原的细胞外结构域（例如，单链片段可变（scFv））;一个信号转导结构域（例如，CD3ζ）;和细胞内共刺激结构域（例如，可衍生自CD28，4-1BB，OX40，等）。

CAR的结构分为三部分： 1.抗原结合区，通常为scFv，用来结合肿瘤细胞上的抗原； 2.跨膜区，用来向细胞内传递结合信号； 3.胞内信号区，用来激活T细胞，发挥生物学功能。

以研发为目的的，采用生长在培养皿、培养瓶、多盘系统的贴壁细胞。转染试剂采用磷酸钙、PEI 、阳离子转染试剂。小规模生产慢病毒载体

哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/3a14526763.html, 哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展 作者：陆陈晨谭树华 来源：《科学与财富》2018年第13期 摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。 关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养 重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。 1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点 传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]： 1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化； 1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性； 1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。 2 细胞无血清悬浮培养的优势 细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。 3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法 3.1 分子生物学手段改造 贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表

pGL3-Promoter哺乳动物表达载体说明

pGL3-Promoter 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6010 pGL3--‐Promoter pGL3--‐Promoter载体基本信息 载体名称: pGL3-promoter, pGL3promoter 质粒类型: 荧光素酶报告系统载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: SV40 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5010bp 5' 测序引物及序列: RV primer3:CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 3' 测序引物及序列: GLprimer2: CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: -- 备注: 用于快速定量评估影响哺乳动物细胞特定基因表达的因子及其影响能力。 稳定性: 稳定 组成型: 非组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pGL3--‐Promoter载体质粒图谱和多克隆位点信息

pGL3--‐Promoter载体序列 ORIGIN 1 GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCCGG GCTCGAGATC TGCGATCTGC ATCTCAATTA 61 GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC 121 CGCCCATTCT CCGCCCCATC GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC 181 CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG

pAcGFP1-N1哺乳动物表达载体说明

pAcGFP1-N1 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6107 pAcGFP1--‐N1 pAcGFP1--‐N1载体基本信息 载体名称: pAcGFP1-N1 质粒类型: 哺乳动物细胞表达载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV IE 载体大小: 4726 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: AcGFP1 (C-端） 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: 新霉素（Neomycin） 克隆菌株: DH5α, HB101 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO等） 备注: 哺乳动物载体pAcGFP1-N1组成型表达C端AcGFP融合蛋白；AcGFP1与GFP相比，密码子经过了优化，更适合在哺乳动物细胞中高水平表达，同时也增强了亮度。 稳定性: 稳表达或瞬表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pAcGFP1--‐N1载体质粒图谱和多克隆位点信息

pAcGFP1-N1载体描述 pAcGFP1-N1 encodes a green fluorescent protein (GFP) from Aequorea coerulescens (excitation maximum = 475 nm; emission maximum = 505 nm). The coding sequence of the AcGFP1 gene contains silent base changes, which correspond to human codon-usage preferences (1). The MCS in pAcGFP1-N1 is between the immediate early promoter of CMV (PCMV IE) and the AcGFP1 coding sequences. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the N-terminus of AcGFP1 if they are in the same reading frame as AcGFP1 and there are no intervening stop codons. SV40 polyadenylation signals downstream of the AcGFP1 gene direct proper processing of the 3' end of the AcGFP1 mRNA. The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T antigen. A neomycin-resistance cassette (Neor), consisting of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upstream of the gene expresses kanamycin resistance in E. coli. The pAcGFP1-N1 backbone also provides a pUC origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production. Fusions to the N terminus of AcGFP1 retain the fluorescent properties of the native protein allowing the localization of the fusion protein in vivo . The target gene should be cloned into pAcGFP1-N1 so that it is in frame with the AcGFP1 coding sequences, with no intervening in-frame stop codons. The inserted gene should include the initiating ATG codon. The recombinant AcGFP1 vector can be transfected into mammalian cells using any standard transfection method. If required, stable transformants can be selected using G418 (2). pAcGFP1-N1 can also be used simply to express AcGFP1 in a cell line of interest (e.g., as a transfection marker). Propagation in E. coli Suitable host strains: DH5α, HB101 and other general purpose strains. Single-stranded DNA production requires a host containing an F plasmid such as JM101 or XL1-Blue. Selectable marker: plasmid confers resistance to kanamycin (30 μg/ml) to E. coli hosts. E. coli replication origin: pUC Copy number: ≈500 Plasmid incompatibility group: pMB1/ColE1

哺乳动物细胞冷冻保存

哺乳动物细胞冷冻保存 主要目的： （1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。 （2）减少细胞被微生物污染的危险性。 （3）减少细胞之间交叉污染的危险性。 （4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。 （5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。 （6）降低人力和物力。 冷冻保存要点： （1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30－60 分钟；然后转入-20℃，放置30 分钟；然后再转入-80℃放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到-3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存。 （2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 （3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。 （4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20％。 （5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO 作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。 特别注意： （1）细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。 （2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。 （3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。 常用细胞冷冻保存液： （1）10％DMSO ＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） （2）10％甘油＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）取对数生长期细胞培养物，离心200－400g 5 分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。 （2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到25－30ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养 DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。 特别注意：

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ 1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。 2、CHO细胞与293细胞有什么区别？ 答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长， （2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性， （3）能够表达与人相似的翻译后修饰。 此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。 HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。

3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什 么？ 答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1), 该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E 细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。该系统比常规的293F细胞表达量要高。 4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？ 答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进 行优化密码子。 蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。质粒质量：内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂 分子量较大或者太小：大于150KD表达会有一定的难度，小于5KD也会有难度。 有的表达量不低，但是纯化得率低（可溶性差，不挂住，不稳定，易降解） 难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白

哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统 按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。 研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。 1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同，附加体型表达载体主要分为4大类，表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。 载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗 摘要 动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。 传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。 研究背景 动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。 流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。世界卫生组织数据显示，每年有5%～15%的人会感染季节性流感，重症病例达三百万至五百万。 抗病毒药物常用作抵抗流感的应急药物。目前，获准用于流感病毒感染治疗的四种药物：金刚胺和金刚乙胺通过干扰病毒颗粒M2蛋白离子通道功能间接抑制病毒复制；扎那米韦和奥赛米韦是神经氨酸酶抑制剂，可以阻止病毒从细胞膜上正常释放。这些药物可以有效抑制流感病毒，但因其可能对人体产生不良反应及可能诱导耐药等缺点，面对大范围长时间的流感大流行，药物往往也无能为力。

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。

哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南-编制说明

国家标准《哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南》编 制说明 （一）工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做的工作等； 1、任务来源 本标准根据国标委公布的2018 年第四批国家标准计划项目（国标委综合号），本项目计划编号为20184467-T-469 ，名称为《哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南》。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。 本标准由深圳华大生命科学研究院联合起草。 2、目的和意义 确保用于生产用细胞基质、治疗性细胞产品，在体外培养过程中无细胞交叉污染，是细胞质量控制中的重要内容之一。随着国内干细胞及组织工程细胞在基础研究及临床应用研究中快速发展，进一步强调了对细胞间交叉污染检测的重要性。同时，细胞系作为体外模型被广泛应用于生命科学研究等领域，然而由于细胞系被交叉污染或错误鉴定而导致的研究结论错误、结果不可重复等问题，给生产、研究以及应用等造成了困扰。因此，准确判定所用细胞是否存在其他细胞的交叉污染，是保证细胞应用安全性的关键质控指标。 细胞交叉污染通常是由于在培养操作过程中同时用到多种细胞、混杂使用器具或液体、细胞培养过程中培养物的交叉污染以及随后污染细胞的过量生长、使用其它物种的滋养层繁殖人类干细胞或原始细胞时有意地共培养导致交叉污染或人类细胞系过生长，以及异种移植都会导致细胞交叉污染的发生。研究表明，自1960年以来，全球广泛使用的细胞系中，有超过400种细胞系证实被错误鉴定；至少有20%的存储在美国、欧洲和亚洲等各大实验室中的细胞系被误判或污染。然而，目前仍然缺少细胞交叉污染检测的标准和实施细则，因此建立一套标准化的、科学有效的细胞系交叉污染检测体系势在必行。 本标准提出了细胞交叉污染检测的基本原则和基本检测方法、方法选择原则和策略、检测要求和判定标准、质量控制等内容。本标准的建设可有效指导科研机构和涉及细胞相关的生产企业进行细胞交叉污染检测，对获得正确可重复性研究结果和确保基于细胞的相关生物制品质量具有重要意义。 3、协作单位

pIRES哺乳动物表达载体说明

pIRES 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6163 pIRES pIRES载体基本信息 载体名称: pIRES 质粒类型: 哺乳动物细胞表达载体；双顺反子载体；双表达载体启动子: CMV 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6092 bp 5' 测序引物: CMV-F: 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' 3' 测序引物: pIRES-R:5'-GCCCTAGATGCATGCTCG-3' 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin） 筛选标记: 新霉素（Neomycin） 备注: pIRES载体含有IRES元件，可以同时表达两个基因。稳定性: 稳表达或瞬表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pIRES载体质粒图谱和多克隆位点信息

pIRES载体简介 pIRES i s a m ammalian e xpression v ector t hat a llows h igh l evel e xpression o f t wo g enes o f interest from the same bicistronic mRNA transcript. The vector contains the encephalomyocarditis virus (ECMV) internal ribosome entry site (IRES) flanked by two multiple cloning sites (MCS A and B), an arrangement that allows cap--‐independent translation of the gene cloned into MCS B (1–3). pIRES utilizes a partially disabled IRES sequence (1) that reduces the rate at which the gene cloned into MCS B is translated relative t o t hat o f M CS A. Expression of the bicistronic transcript is driven by the constitutively active cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located upstream of MCS A. An intervening sequence (IVS) known to enhance the stability of mRNA (4) is located between PCMV IE and MCS A, and is efficiently spliced out following transcription. SV40 polyadenylation signals downstream of MCS B direct proper processing of the 3' end of the mRNA. Bacteriophage T7 and T3 promoters are located upstream of MCS A and downstream o f M CS B, r espectively. p IRES i ncludes a n eomycin r esistance g ene (Neor) t o aid in the selection of transfected cells. Neor is expressed from the SV40 enhancer/promoter, a nd a s ynthetic p olyadenyla?tion s ignal d irects p roper p rocessing o f the 3' e nd o f t he N eor m RNA. T he S V40 o rigin a l?lows f or r eplication i n m ammalian c ells expressing the SV40 T antigen. The vector also contains an ampicillin resistance gene (Ampr), a nd a C olE1 o rigin o f r eplication f or s e?lection a nd p ropagation i n E. c oli, a nd a n f1 o rigin f or s ingle--‐stranded D NA p roduction. pIRES载体应用 Genes cloned into either MCS must contain ATG start codons. pIRES and derivatives can be introduced into mammalian cells by any standard transfection method. Transformed cells can be selected by growth in medium containing the antibiotic G418. Sense or antisense R NA c an b e t ranscribed f rom t he T7 a nd T3 p romoters, r espectively. pIRES载体序列 ORIGIN 1 TCAATATTGG CCATTAGCCA TATTATTCAT TGGTTATATA GCATAAATCA ATATTGGCTA 61 TTGGCCATTG CATACGTTGT ATCTATATCA TAATATGTAC ATTTATATTG GCTCATGTCC 121 AATATGACCG CCATGTTGGC ATTGATTATT GACTAGTTAT TAATAGTAAT CAATTACGGG 181 GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC 241 GCCTGGCTGA CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT 301 AGTAACGCCA ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC 361 CCACTTGGCA GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTCCG CCCCCTATTG ACGTCAATGA 421 CGGTAAATGG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TTACGGGACT TTCCTACTTG 481 GCAGTACATC TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAC 541 CAATGGGCGT GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT 601 CAATGGGAGT TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTG 661 CGATCGCCCG CCCCGTTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA