细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍

细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍

（2016年10月16日）

哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：

一、培养法

●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转

接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体

培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。

●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可

的方法之一。

●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支

原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最

常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无

法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有细胞

支原体污染的20-50%。

●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中

收录的培养法支原体检测方法进行操作。

二、荧光染色法

●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培

养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，

如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料

染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。

●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。

●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污

染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细

胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的

能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；

（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。

●《荧光染色法支原体检测试剂盒》主要厂家：读者可以根据《中国药典》

中收录的荧光染色法支原体检测方法进行操作。

三、PCR法

●原理：设计支原体特意的引物，进行PCR扩增。

●优点：（1）快速，往往只需几小时；（2）可检测的支原体种类较多；（3）

目前，该方法是细胞培养液中支原体污染检测的常规方法之一。

●缺点：（1）整个过程大约需要3个小时；（2）由于细胞培养数天后，培

养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物，所以样品的前处理一般是

PCR法不可或缺的环节；（3）PCR产物的电泳，需要用到EB等潜在的致

癌物质；（4）需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器；

（5）存在假阳性和假阴性。

●《PCR法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）Sigma公司的LookOut

Mycoplasma PCR Detection Kit（货号：MP0035），价格：价格：3469

元/24次；（2）上海易色医疗科技有限公司的《PCR法支原体检测试剂盒》，

货号：PM008；价格：1000元/100次；（3）以色列Biological Industries

（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit，货号：20-700-10，

价格：约1000元/10次。

四、RD-RCA恒温扩增法

●原理：这个是上海易色医疗科技公司依托其RD-RCA恒温扩增技术开发的

支原体检测产品，产品名称：《一步法恒温支原体检测试剂盒》。该产品

非常具有特色，详细原理可以访问其网站了解。

●优点：《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用独特的RD-RCA恒温基因扩

增技术，彻底解决了上述PCR法的缺点：（1）整个检测过程只需1小时，

大大缩短了检测时间；（2）细胞培养液中的PCR抑制剂，不会抑制该产

品的恒温基因扩增，所以任何情况下都无需样品的前处理；（3）恒温基

因扩增的灵敏度是PCR法的10-1000倍，检测只需使用1μL的细胞培养

液，无需样品的离心浓缩或者进行支原体DNA的抽提；（4）恒温基因扩

增的产物无需电泳，可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果；

（5）无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器，整个检测

过程只需一个水浴锅。

●缺点：该产品只能保证认识最常见的污染细胞的13种支原体，虽然这

13种支原体大约占污染细胞的支原体种类的99%左右。但是，不排除《一

步法恒温支原体检测试剂盒》无法识别个别在体外细胞培养中出现概率

极低的支原体。

●《RD-RCA恒温扩增法支原体检测试剂盒》主要厂家：据笔者了解，目前

只有上海易色医疗科技公司生产《一步法恒温支原体检测试剂盒》，货号：MD001，价格大约15-19元/次

五、酶活法

●原理：通过检测支原体特异性ATP合成相关酶的活性。

●优点：（1）支原体识别率高，100多种支原体，只有1种不能识别，而

不能识别的这种支原体几乎不会出现在体外培养的细胞中；（2）可以区

分支原体的死活；（3）不存在假阳性和假阴性；（4）检测时间短，整个

检测过程只需25分钟。

●缺点：需要用到具有发光检测功能的多功能酶标仪或独立的发光检测仪。

●《酶活法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）上海易色医疗科技有限公

司的《发光法支原体检测试剂盒》，货号：LM009；价格：1250元/50次。

（2）Lonza公司的 MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit，货号：

LT07-710；价格：大约10000元/100次。

总结：以上每种支原体检测方法各有优缺点，大家应该根据自己试验的需要和实验室条件进行选择。此外，作为支原体检测领域的共识，单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒和检测方法，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。

细胞培养中支原体污染

细胞培养中的支原体污染的预防及处理 Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（https://www.sodocs.net/doc/641289444.html,idlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养

细胞支原体污染相关知识简介

细胞支原体污染相关知识简介 （2016年10月16日） （1）支原体简介： 支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.1 - 0.6微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。其中，有近20种曾经在各种细胞培养体系中检测到，但超过98%以上的支原体污染是由6-8种引起的（注：具体的支原体种类，上海易色的《一步法恒温支原体检测试剂盒》说明书中有详细介绍）。而且同一种细胞经常被多种支原体污染。 （2）支原体污染细胞的途径： 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。 细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等。 （3）细胞支原体污染的隐蔽性： 由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达107-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。 而且，轻度到中度的支原体污染并不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。 以上两个原因就导致体外培养的细胞即使被支原体污染了，一般的科研工作者也不会觉察到。也就是说：如果不进行支原体的常规检测，你甚至不知道你培

表1，细胞支原体污染统计结果，数据来自参考文献 [4]

3. Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC?). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma? Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18 4. John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. p. 24.

解脲支原体检查方法

如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 解脲支原体检查方法 导语：解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会 解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会表现出来的，而解脲支原体的检查方法有是有很多的，一般在做这个检查的时候都是很多男性出现了尿多尿急尿频繁的现象，所以才到医院做检查，那么解脲支原体检查方法有哪些？ 解脲支原体的检查方法主要有三种，第一种检查方法就是血液检查，主要是通过抽血化验。第二种检查方法就是通过口腔的涂片的培养来进行检查。第三种检查方式就是PCR的技术检测，这种检查方式可以检查出igm的抗体情况，然后再判断感染的情况。这种疾病的治疗可以使用四环素，比如米诺环素、多西环素等等，但是建议最好两种到三种的抗生素结合一起使用，治疗效果更好。 支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细胞，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。 男性支原体检查方法有哪些？男性支原体检查方法如下： 1、血常规：周围血白细胞计数一般正常嗜酸性粒细胞增多。 2、血清学检全：采用补体结合试验着恢复期血清抗体效价比急性预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏

1医学检验毕业论文 (三种肺炎支原体检测法的临床应用分析)

毕业论文 题目：三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 地市: 学校: 准考证号: 考生姓名: 王莹 指导老师: 二〇一八年八月十四日

三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 摘要 目的探讨肺炎支原体（MP）咽拭子快速液体培养法、咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清MP被动凝集法（MP-Ab）等方法在儿童MP感染诊断治疗过程中的敏感性方法采用3MP检测法对362例临床拟诊呼吸道（非细菌性）感染的患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，每患儿取咽拭子做快速培养和PCR，同时取血清做MP-Ab检测，对3种方法的检测结果与临床诊断治疗病例进行回顾性分析。结果回顾临床病例诊断MP感染患儿152例。MP快速培养法检出阳性78例，阳性率为51.3%，病程为（4.5±2.6）天；PCR法检测出阳性103例，阳性率为67.8%，病程为（6.2±3.5）天；MP-Ab法检测出阳性127例，阳性率83.5%，病程（8.1±4.5）天。结论 3种MP检测法的敏感性与病程有相关性，临床医生应根据患儿病程选取检测方法，以提高阳性检出率和敏感性。 关键词肺炎支原体，快速培养法，咽拭子聚合酶链反应，血清抗体，配对研究

目录 前言 (4) 第一章文献综述 (5) §1.1 肺炎支原体的定义 (5) §1.2 肺炎支原体的发病机制 (5) §1.3 肺炎支原体的分类 (5) §1.4 肺炎支原体的临床表现 (5) §1.5 肺炎支原体的临床诊断 (5) §1.6 肺炎支原体的实验室检查 (6) 第二章材料和方法 (7) §2.1 样本 (7) §2.2方法概述 (7) §2.3临床诊断MP感染的诊断标准 (7) §2.4实验方法 (7) §2.5统计学方法 .................................................................... .. (8) 第三章结果 (9) 第四章讨论 (10) 结论 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 错误！未定义书签。

人型支原体阴性正常吗

人型支原体阴性正常吗 可能当我们偶尔听到人型支原体这一名字时会十分陌生，其实人型支原体是一种微生物，而如果人体感染了这种微生物的话就会引起一系列的不适，如果不及时治疗还会给身体造成很多的危害。因此对有相关症状的患者要做及时检查，那么人型支原体阴性正常吗？ 人型支原体阴性正常吗 人型支原体阴性是正常的。人型支原体（M.hominis，MH），人型支原体是支原体的一种，它存在于泌尿系和生殖器中，可以引起泌尿系的感染和生殖器的炎症，如果您担心的话，可以来院做相关检查，明确是否有感染。 无细胞壁及前体，细胞器极少。DNA的G+C含量低，菌体内具有非常小的染色体组，其分子量约为45×108，菌体细胞大小约为0.2-0.3μm，很少超过1.0μm。由三层蛋白质和脂质组成的膜样结构以及一层类似毛发结构组成。支原体由二分裂繁殖，形态多样。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。 人型支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养。营养要求比细菌高。由于它没有细胞壁，因此对影响细胞壁合成的抗生素等不敏感，可抑制或影响支原体的蛋白质合成，特别是含PHMB杀菌成分的洁阴洗液有杀伤支原体作用，支原体对热抵抗力差，通常55℃经15分钟处理可使之灭活。石碳酸，来苏儿易将其杀死。在培养基中置入脲素并以硫酸锰作指示剂极易与其他支原体作出鉴别。 人型支原体感染有什么危害 支原体是非淋性尿道炎的一种特殊类型，是微生物。支原体感染临床表现为：“尿黄，尿道口微红，尿频，尿不尽，尿道痛，烧灼感”等症状。人型支原体，其特点是生长时需要类固醇物质。人型支原体菌落较大，直径在300～1000微米，典型的菌落具有“油煎蛋”的外观。长期的或反复的衣原体和支原体感染会破坏子宫颈和输卵管内的内膜层，造成不孕。衣原体和支原体的感染大多数是通过性行为传染的，有杜绝互相传染而反复感染，就应该对性伴侣同时治疗。 人型支原体感染后会导致患者身体出现多种不适的症状，人型支原体阴性的检查结果就说明了患者并没有真正的感染上这种微生物，这是一件值得高兴的事情。并且在生活中我们也要注意做好这种疾病的预防，这样才能远离疾病给我们身体带来的危害。

人型支原体感染是什么

人型支原体感染是什么 我们常说支原体衣原体，其实这是性/病的一类，在划分细点，支原体还可以分为解脲支原体、人型支原体、肺炎支原体，而衣原体中最多见的是沙眼原体。临床很多的患者被检查出有解脲支原体，而检查出有人型支原体的比较在少数。于是很多人对自身检查出人型支原体阳性不懂是什么意思？ 人型支原体感染，和解脲支原体一样是生殖道支原体感染的一种，主要可以通过血培养和生殖泌尿道分泌物培养而检测出，若是为阳性就是表明有感染，其中，分泌物的培养多准确点，以MH-DNA阳性表现有感染。若是有症状的患者或是无症状的备孕夫妻是需要治疗的，治疗上可服用妇炎丸治疗。 人型支原体既不是细菌也不是病毒，是介乎于细菌和病毒之间的病原体，是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌，同时也是一种条件致病菌，就是在特定的环境下可以致病。这里的特定的环境下，可以是在人体抵抗力差的时候致病，也可以是在长期的抗生素大剂量使用下，导致体内的菌群失调下致病。 人型支原体感染是怎么得的？ 人型支原体主要通过性接触或分娩时经产道感染人体，前者多是在有过多人性/交史或者有过不洁性/交史的成人身上，后者多是有过人型支原体感染的孕妇顺产的婴儿身上。 人型支原体感染有什么危害的？ 人型支原体由于只对粘膜细胞敏感，尤其是对男性的尿道粘膜和女性的宫颈粘膜、尿道粘膜敏感，它不侵入机体组织与血液，而是在泌尿生殖道上皮细胞黏附并定居后，通过不同机制引起细胞损伤，引起粘膜发生炎性反应和炎性细胞浸润，从而导致一些类的生殖道疾病、泌尿道疾病，甚至是直接减低男女的生育能力。 女性有人型支原体感染，前期表现是支原体宫颈炎，此时经过妇炎丸治疗多是会取得满意的效果。若是此阶段没有重视或是治疗方法不对，支原体会继续感染，进入生殖道后可附着于细胞膜受体上，引起粘膜发生炎性反应和炎性细胞浸润，以巨噬细胞及中性粒细胞等炎性细胞为主，被激活的巨噬细胞产生大量的肿瘤坏死因子和干扰素、白介素等细胞因子，使宿主细胞结构和机能受损，造成子宫颈管内膜的慢性炎症，且易逆行传播至子宫内膜及输卵管粘膜使其受损。 人型支原体的治疗，若是经抗生素治疗效果不佳或者已经产生耐药性，建议转为中药的治疗同时，需要多注重个人生活卫生，保持良好的个人卫生!最好不好进行房事，以免交叉感染！

细胞支原体污染一般情况及预防措施

细胞支原体污染一般情况及预防措施 细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。 各国细胞库支原体污染的统计表，如下： 国家受支原体污染(%) 报告年度 USA－FDA 15 1993(past 30 years) USA－ATCC 15-20 1992 Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998 Germany－DSM 36 1990-1994 Argentina 65 1987 Israel 32 1986-1993 China 95 1990 造成支原体高污染率的原因为： 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 5、研究或操作人员忽略污染问题 支原体污染了来源： 1、已受污染的细胞 2、操作人员的疏失 3、已受污染的培养基、血清 4、操作环境不良、实验器具不洁等 由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。 去除支原体污染： 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（B ayer），Enrofloxacin（Bayer） 2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 3、Anti-sera 预防与控制方面可从以下各点加强注意： 设备方面： 1、使用已作支原体测试ok之细胞株

人型支原体感染有什么症状

人型支原体感染有什么症状 随着现在的精神文化生活日渐丰富，人们的思想观念与西方日益接轨，人型支原体这种主要依赖于性传播的疾病日渐猖獗，在成人男女中发病率特别高，特别是女性朋友，感染人型支原体的几率和感染的严重程度都比男性要高。那么人型支原体感染有什么症状，缘何爱盯上女性呢? 女性人型支原体感染症状 其实女性人型支原体感染是一种妇科炎症，主要通过性接触传播。一般来说，女性如果有支原体感染的情况，会有以下症状： 1、早期的女性人型支原体感染，患者会出现尿道口红、肿、痒、刺痛、白带增多的情况;少数患者无明显症状; 2、女性人型支原体感染一段时间后，可引起宫颈炎、子宫内膜炎或输卵管及卵巢炎，这时候，患者会出现畏寒、发热、恶心、呕吐、纳差、腹痛、腹泻及白带增多等情况;有些患者伴有尿急、尿痛及尿频。 3、如果女性患人型支原体感染时间较长，没有得到及时治疗，膝、腕、踝及肘等关节会有肿胀、疼痛及活动受限的情况，严重的话甚至可能发生脓毒性关节炎。 4、人型支原体感染严重者，或者免疫力异常低下的女性，还可伴发心肌炎、心内膜炎及淋菌性脑膜炎等。 5、女性人型支原体感染，若前庭大腺受侵，可出现外阴红肿、疼痛及破溃流脓等情况。 女性感染人型支原体后，症状还是比较明显的，一旦出现了早期感染症状，要及时去医院检查治疗，以免耽误治疗，引发严重的后果。那么女性为什么容易感染人型支原体，症状为何比男性重，其实这是由于女性的生理结构决定的，我们继续往下看。 人型支原体感染爱盯上女性的原因 1、女性尿道短，仅约3～5cm，直而宽，尿道括约肌薄弱，且尿道口大，细菌易上行侵入膀胱。而女性膀胱排空不如男性完全，残余尿量较多，尿液在膀胱内停留时间过长，有利于细菌滋生。 2、女性尿道口距阴道、肛门近，尿路上皮细胞对细菌粘附性及敏感性较男性为高，月经血也是细菌良好的培养基，如不注意外阴清洁则细菌容易滋生，受到外界的感染。

支原体检查

附录XIIB支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法 第一法培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基

内。每个稀释度接种3支试管，置36℃ 士1℃ 培养7～14天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定以接种后培养基管数的2 / 3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 )应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。 检查法（1）供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃ ；超过24小时应置一20℃ 以下贮存。 ( 2 )检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 )，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml的支原体半流体培养墓（已冷至36℃ 士1℃ ）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃ 士1℃ 培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃ 士l℃ 培养21天，每隔3天观察1次． ( 3 )结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。 试剂（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank 's平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank ' s溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。 （3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。 （4）封片液量取0.1mol / L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol / L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。 培养墓及指示细胞（1） DMEM完全培养基。 ( 2 ) DMEM无抗生素培养基。

支原体污染的特点及体检

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。 支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(P H7.6—8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后。培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解。因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢。甚至从培养器皿脱落。 为确定有无支原体污染可做如下检酗： ①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。 ②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗。置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。 ③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速。也可以利用透射电镜。 ④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高。但方法较为复杂 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变

细胞培养中常见的污染的处理

细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液 一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养 液是否存在浑浊的现象！ 可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的 消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期 清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就 要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体 感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用 8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍

细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍 （2016年10月16日） 哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。 目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有： 一、培养法 ●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转 接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体 培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。 ●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可 的方法之一。 ●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支 原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最 常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无 法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有细胞 支原体污染的20-50%。 ●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中 收录的培养法支原体检测方法进行操作。 二、荧光染色法 ●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培 养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色， 如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料 染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。 ●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。 ●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污 染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细

细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办

细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办 （2016年10月16日） 一、细胞支原体污染的图片 我们首先来认识一下，细胞支原体污染与非污染的图片有什么区别。 如上图所示，左侧为未经支原体清除试剂处理的人Hela细胞,经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA，说明细胞支原体污染非常严重。 而右侧为经过本公司的支原体清除试剂2处理7天的Hela细胞，经DAPI 染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质没有任何絮状核酸物质被染成蓝色，说明支原体已经被清除。（版权声明：上图来自上海易色医疗科技有限公司网站。） 二、细胞支原体污染的危害和表现 细胞支原体污染的危害（1） 培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献1）。Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。

从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。 总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！ 细胞支原体污染的危害（2） 1. 细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的 严重错误！ ●结果：由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗 肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.） ●参考文献：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8. 2. 免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前 国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。 ●结果：（1）The capacity of these cell lines to induce DC maturation was due to their contamination by mycoplasma. Our results reveal that DC are able to sense mycoplasma infection and mature as they do in response to most viruses and bacteria.（2）Further investigation demonstrated that the changes in DC phenotype and functions were due to the presence of mycoplasmas in these two cell lines; eradication of mycoplasmas completely abolished the observed effects, and importantly, pure mycoplasmas in the absence of tumor cell supernatants were able to produce the same effects. ●参考文献：（1）Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur. J. Immunol. 2000.30: 705–708。（2）Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells. J Biomed Sci. 2005;12(1):31-46.

人型支原体的预防措施

主持人：各位网民朋友，大家晚上好，欢迎登陆中国生殖健康网，今天我们请到的专家是北京中医药大学附属东方医院皮肤性病科主任李元文，今天的话题是衣原体和支原体感染的中医药治疗。首先请专家给我们做一下讲解，之后回答网民朋友的问题。 李元文：说起衣原体和支原体的感染，我们就想到了性病中最常见的非淋菌性的尿道炎，或者是非淋菌性的宫颈炎，这个病是非常常见的，有人认为发病率在目前的状态下可能是排在第一位的，也有人认为他是仅次于淋病，或者是梅毒，总之发病率非常高的一种性病。由支原体和衣原体感染引起的这种非淋菌性的尿道或者是宫颈炎，是一种危害非常大的性病，为什么这么说呢？一般的性病，危害性首先是局部可以出现炎症的损害，或者我们叫感染，表现就是泌尿或生殖道的疼痛，灼热、红肿，或者是脓性分泌物，这样的话引起泌尿生殖道的炎症反应，这是第一个危害。第二个危害，由衣原体和支原体感染引起的泌尿生殖道的炎症，往往逆行从前尿道向后尿道转化，比如说男性出现了衣原体、支原体感染的前列腺炎以及精囊炎，女性出现宫颈炎，慢性的疾病可能引起不孕不育，因为泌尿生殖道的炎症，特别是慢性的炎症，可能引起不孕不育。[20:03:44] 李元文：在支原体感染的患者中，由于支原体和精子的结合，导致了精子活动度的下降，以及精子质量明显的下降，或者是出现早产、流产的情况，所以大家感觉到，有衣原体和支原体感染引起的性病，它的危害性是比较大的。所以说这种病往往引起慢性的损害，很多患者感觉到轻微的自觉症状，使得治疗延误，比如说有的患者感染了支原体数年，但是他并不知道，他没有意识到，因为症状很轻微，比如说女性患者只感觉到我的白带稍微多一些，或者是腹部隐隐作痛，她认为是不是着凉，或者是月经前不规则的出血，是不是慢性的炎症，到妇科检查，往往有一些宫颈的糜烂，宫颈的炎症，或者是不典型增生，这时候导致的延误治疗，使得病情复杂化，所以说这个病的危害性和后果，我们经常也有认识不足的问题。所以我今天就这个话题讲一下治疗，在讲治疗前，我想重点让大家明白，什么样的症状要检查。[20:06:01] 李元文：性病绝大多数是通过性途径传播的，比如说不洁的性交，当然性传播的途径不是每个人都非常清楚，我给大家举个例子，我的一个病人，有支原体的感染多长时间不知道，怎么感染不知道，有的女性患者也可能有无辜性的感染，比如说夫妻俩，如果是丈夫有所谓的嫖娼史，但是没有把这种情况告诉妻子，妻子又出现了支原体、衣原体的感染，症状又不是很明显，所以很难给自己断定我就是感染了支原体，也不可能积极主动地寻求治疗。所以说，我们讲治疗前，我们给大家先讲一下什么样的情况应该检查支原体。对男性患者，如果出现尿道有不适的症状，包括了尿频、尿急、尿痛，以及尿道口的灼热、瘙痒，或者是憋不住尿，有这种感觉的时候，考虑是否有支原体的感染。 主持人：比如说这两天有这种症状，或者说一周有，之后就没有了，或者说这种症状是持续性的？ 李元文：由衣原体、支原体感染引起的尿道炎，往往是慢性的尿道炎，它绝对不会说两三天症状就消退了，往往是断断续续，比如说1周前有明显的症状，但是1周后可能减轻了，但是过一段时间又出现了，这时就一定要小心，这就符合慢性、复发性感染的疾病症状，男性就是尿频、尿急、尿痛，尿道的灼热、不适，会阴的酸胀、不适，这时就要考虑到是不是有衣原体、支原体的感染。如果发现自己有不舒服的症状，观察到尿道口在晨起的时候，尿道口有一些清晰的，或者是粘滞的分泌物的时候，一定要高度怀疑是衣原体、支原体的感染。

支原体检测

支原体检验法 1 培养基 1.1 检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey 氏培养基。 1.2 检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基 1.3 检验血清用无血清的支原体培养基 2 检查法 2.1 样品处理每批制品取样3-5瓶，液体制品混合后备用；冻干制品加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。 2.2 疫苗的检测 2.2.1 接种于观察每个样品需同时用以下两种方法检测 2.2.2.1 液体培养基培养将疫苗混合物5.0ml接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。 2.2.2.2 琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的

环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。 2.2.2 对照每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。 2.3 血清的检测取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。 3 结果判定 3.1 接种本物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判定血清或者疫苗不合格。 3.2 阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。 附注：上述小瓶培养基是指在100ml小瓶中盛20ml液体培养基；小管培养基是指在1.0cm*10cm中盛1.8ml培养基。小管与小瓶须用胶塞封口。

如何解决细胞培养中的支原体污染

如何解决细胞培养中的支原体污染？ 一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染往往容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染。据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂渐渐蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。 狡猾的支原体 支原体是唯一一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。由于它的直径小（约为0.15-2 μm），而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。支原体的种类非常多，超过了100种。当然，大部分支原体检测都不可能检测到所有的种类。不过，在实验室中捣乱的支原体也通常就是那一小撮。 支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞。然而，它们能以许多不同方式改变细胞的新陈代谢。细胞除了长得不好之外，几乎所有的实验表现如蛋白表达也都会受到影响。传统的抗生素对支原体并不奏效，因为它们大多破坏细胞壁的完整性，而支原体恰恰没有细胞壁。这也就是支原体感染率高企的主要原因。曾有一位细胞培养专家戏称：“我可是支原体方面的专家，并不是因为我喜欢他们，而是25-60%的细胞系都感染了支原体。”支原体总在偷偷地改变细胞，篡改我们的实验数据。怎么办？ 检测、检测、再检测 对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心（NCCC），它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明无支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。 检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析、ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该算是检测支原体的理想方法，它综合了几个优势：灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可直接用来检测，非常方便。Sigma-Aldrich公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，扩增的就是支原体基因组上16S核糖体RNA基因。此区域高度保守，因此可检测多达19种支原体。当然，为了避免假阳性和假阴性，实验中必须设立多种对照：阳性对照、阴性对照和内对照。如果电泳图上出现259bp的清晰条带，对不起，你中招了。以色列Biological Industries（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit也能提供支原体的快速检测，引物与Sigma类似，也是扩增16S rRNA。这个试剂盒的灵敏度颇高，M. capricolum的检测极限为5.5 CFU/ml，M. hyorhinis则为10.5 CFU/ml。

支原体

支原体（mycoplasma）感染是一种性接触传播疾病。支原体可存在于健康携带者，而在性乱者、同性恋、妓女、淋病患者中检出率较高。性伴数越多，性活跃指数越大，感染率越高。 目录 1基本概述 2流行病学 3病原学 4检查诊断 1. 4.1 血常规 2. 4.2 x线检查 3. 4.3 直接涂片镜检 4. 4.4 快速抗原检测 5. 4.5 衣原体分离 6. 4.6 血清学检全 7. 4.7 PcR技术 5感染概率 概述 从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体（M.pneumoniae）、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）、人型支原体（M.homins）、生殖支原体 （M.genitalium）及发酵支原体（M.fermentans）。脲解支原体属（ureaplasma）含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。肺炎支原体是呼吸道感染、肺炎的主要原因。脲解支原体、人型支原体则引起泌尿生殖道感染（即支原体感染）。 支原体（mycoplasma）是细胞外生存的最小微生物。是一类缺 支原体模型 乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。

支原体是一种不同与细菌和真菌的另一类微小病原体，支原体属有80余种，与人类有关的支原体有肺炎支原体（MP），人型支原体（MH）、解脲支原体（UU）和生殖支原体（MG），前者引起肺炎，后三者引起泌尿生殖道感染。 支原体、衣原体感染人体后，首先侵入柱状上皮细胞并在细胞内生长繁殖，然后进入单核巨噬细胞系统的细胞内增殖。由于支原体、衣原体在细胞内繁殖，导致感染细胞死亡，同时尚能逃避宿主免疫防御功能，得到间歇性保护。支原体、衣原体的致病机理是抑制被感染细胞代谢，溶解破坏细胞并导致溶解酶释放，代谢产物的细胞毒作用，引起变态反应和自身免疫。 2流行病学 2000年我国研究者骆丹等用PCR法对广东、昆明、上海、南京、广州等地区患性传播性疾病（STD）的妇女进行了生殖器支原体（Mh）的检测，结果其总阳性检出率为16.05%，对照组（未患STD）仅为1.79%；广东、昆明地区的阳性检出率分别是21.69%和19.20%，显著高于上海、南京等地区。2001年西班牙对不孕患者的研究发现，47.3%的不孕妇女有感染史，而解脲支原体（Uu）和Mh的分离率分别为23.5%和408%。西非2000年对孕妇的横断面研究证实，妊娠期妇女生殖道的支原体检出率为73%，其中Uu22%、Mh20%。国外有学者报道在13—19岁患STD的青少年，支原体检出率为50%，显著高于成年对照组的检出率28%。总之，支原体的检出率和支原体类型、地区和人群有关。孕妇、性生活活跃的年轻人、STD 患者是支原体感染的高危人群。 3病原学 目前已知的支原体有80多种。从人体分离出的主要种类有：人型支原体（Mh）、解脲支原体（Uu）、灵长类支原体、生殖器支原体、穿透支原体、亲脂支原体、肺支原体等。电镜下支原体呈烧瓶状或梨形，菌体长0.6—0.7μm，靠近底部宽0.3—0.4μm，顶部末端宽0.06—0.08μm，末端向下延伸有约7nm的茸毛，没有细胞壁，对干燥敏感，其代谢产物的堆积不利于其生长繁殖。不同的支原体具有不完全相同的生物学特征。 4检查诊断