细菌脱氢酶活性的测定

细菌休止细胞的制备及其脱氢酶活性的测定

摘要休止细胞又叫静息细胞，在研究微生物生理生化及新陈代谢中应用广泛，这种细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，是测定细菌脱氢酶活性的良好材料。本实验用E.coli cVcc249菌株作为实验材料，制备其休止细胞，再加入四种同样浓度的TCA循环中的底物：乙酸钠、琥珀酸钠、α-酮戊二酸及柠檬酸钠，比较和分析在相同浓度、不同底物的情况下，细菌脱氢酶活性的大小；并对其中的α-酮戊二酸和柠檬酸钠两种底物配以浓度梯度，研究其分别与细菌脱氢酶活性之间的相互影响。在本次实验中，所采用的测定细菌脱氢酶活性的方法是噻唑盐还原法，噻唑盐宜与反应生成的还原氢反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，可溶解于二甲亚砜中，再根据其颜色变化的深浅，用分光光度计测其OD510nm值，即可表示细菌脱氢酶的活性。

Abstract

The resting cells, which are widely used in the study of microbial biochemistry and metabolism, are a kind of cells that are dormant ,not growth or reproduction. Those cells still contains a variety of enzymes as well as the capacity of oxidation and fermentation, thus make them good material of determining dehydrogenases activity. The experimental strain is E.coli cVcc249.Firstly,preparing the resting cells of the stain, then adding the four substates of TCA cycle with the same concentration, the four substates are: sodium acetate, sodium succinate, α-ketoglutaric acid and sodium citrate. These allow us to compare and analysis the bacterial dehydrogenase activity in those four same concentration substates. Secondly, making concentration gradient of α-ketoglutaric acid and sodium citrate perspectively, study their functions with bacterial dehydrogenase activity. In this experiment, we us the method of MTT reduction to determine the activity of dehydrogenase. The MTT can be reduced by the bacterial dehydrogenase, and the product is Formazan, which is a water-insoluble and blue-purple crystalline. We can solute Formazan in DMSO, then the samples were checked by measuring spectrophotometrically at 510 nm, which can represent the activity of bacterial dehydrogenase.

关键词休止细胞脱氢酶活性α-酮戊二酸柠檬酸钠噻唑盐

1.引言

1.1 休止细胞

1.1.1 休止细胞的定义及特性

休止细胞又称静息细胞，是把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。

它的主要特性就是细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长，多数可以在低温保存一定时间而不失活。另外休止细胞反应专一性强,可以提高底物转化率,不易染杂菌,可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制，是研究无细胞制剂等的好材料。

1.1.2 休止细胞的制备及注意事项

制备：

a.培养细胞，以固体或液体培养，收获比较年轻的细胞，制成细胞悬液；

b.洗涤细胞，以适量洗涤液洗涤细胞，4000rmp离心10min，保留沉淀细胞，重复2次；洗涤的目的是为了洗掉细胞表面的营养物质。

c.悬浮细胞，以适量洗涤液将细胞悬浮起来，即得休止细胞悬浮；

d.保存细胞，将细胞悬浮液保存在普通冰箱中，1~2周不会失活。

注意事项：

a.保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。活化的要求是使保藏菌种恢复旺盛的生命活动和显示其原有的代谢和生长性能。因此，保藏菌种的活化必须使用保藏菌种时所使用的相同的培养基和培养条件，或使用以保藏菌种生长和代谢最佳的培养基和培养条件，以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代谢速率和生理特性。以便接下来制备休止细胞。

b.洗涤细胞时，菌落一般在培养基表面粘附不紧密，用生理盐水可以轻易洗涤下来。倘若有部分菌落仍未脱落，可用接种环轻轻刮擦，注意尽量不要碰触培养基而使其进入洗涤液中。

c.在液体中静置培养和振荡培养时，一般用离心机来收集菌体。离心机收集细胞的条件一般随微生物的种类而不同，细菌一般用5000rmp，10min或者9000rmp，5min就做够了。然后洗涤以出去所收集细胞中的培养基，离心沉淀的细胞在加入洗涤液后，用玻璃棒小心搅拌使成均一的悬浊液，再离心分离。洗涤后，一般再悬浮在洗涤液中保存，有时也可直接保存除去上清液的沉淀细胞。

1.1.3 休止细胞的应用

a.休止细胞是制备无细胞制剂及其材料的原料。由于休止细胞的制备比较容易标准化，所以可用它定量地进行生理生化或代谢过程的研究。例如本实验中应用E.coli cVcc249的休止细胞测定酶活。

b.研究基质对微生物细胞呼吸的影响；比较不同菌种的呼吸强度，测定抑菌剂的作用大小和速度。

c.研究某种营养物质的呼吸商。呼吸商简称R.Q.，指生物体在同一时间内，释放二氧化碳与吸收氧气的体积之比或摩尔数之比，即指呼吸作用所释放的CO2和吸收的O2的分子比。由测得的呼吸商，推测该营养物质是否被完全氧化时所产生的CO2容量和所消耗O2容量之比。各种营养物质的碳、氧和氢的含量不同，所以氧化时消耗的O2和产生的CO2也不同，因而它们的呼吸商亦有差别。例如：糖完全氧化时的呼吸商=1；丙酮酸完全氧化时，呼吸商=1.2。

d.探索新的生长因子。如果某菌种的休止细胞氧化丙酮酸很慢，当加入酵母浸出物时氧化速度加快，而已知的生长因子都没有这种作用，这就表明酵母浸出物中可能含有促进氧化丙酮酸的新因子，如：硫辛酸就是用这种方法发现的。

1.1.4 应用休止细胞时的注意事项:

经培养的微生物，不仅在某菌体细胞的表面，同时在该菌体细胞的内部也残留有营养物质。为了去除这些物质，在应用休止细胞以前，可在室温下通气或振荡，以消耗菌体细胞内的营养物质，降低内源呼吸，避免在实验中产生误差。此外，休止细胞的应用也有局限性。例如，研究微生物繁殖时所发生的各种变化（如核酸的变化过程等），就不宜使用休止细胞。

1.2 酶活性

1.2.1 酶活性的定义

酶活性是指酶催化一定化学反应的能力。

任何一个酶都有催化一定底物进行特定反应的能力，但是酶的催化能力的测定实际上只能通过测定酶催化反应速度来实现。酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。而酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。另外，在研究酶促反应时，底物一般是过量的，因此一般测定产物的增加量较合适些。

由于酶催化反应速度受温度、pH、离子强度及底物等诸多因素的影响，我们所谓的酶活性都是只在特定的系统和条件下测到的反应速度，因此在测定酶活性时，一定要注明这些特定的条件。即使同样的酶，甚至用同样的测定方法和同样的单位定义，由于条件稍有不同，也会使测到的酶活性难以比较。因此，要比较各篇文献报道或者不同牌号制剂的某种酶活性时，必须注意它们的单位定义和测定系统及条件，千万不能盲目比较。

与酶活性相关的另一个概念是“比活”，食指单位重量的蛋白质中所含的某种酶的催化活性，是纯度量度，单位为u/mg。比活越高则酶越纯。

1.2.2 酶活性的影响因素

酶促反应速度受酶浓度和底物浓度的影响，也受温度、pH、激活剂和抑制剂的影响。

a.酶浓度对酶促反应速度的影响:一定范围内，酶促反应速度与酶分子的浓度成正比.当底物分子浓度足够时,酶分子越多,底物转化的速度越快。

b.底物浓度对酶促反应速度的影响在生化反应中,若酶的浓度为定值,底物的起始浓度较

低时,酶促反应速度随底物浓度的增加而增加.当所有的酶与底物结合生成中间产物后,即使在增加底物浓度,中间产物浓度也不会增加,酶促反应速度也不增加。

c.温度对酶促反应速度的影响各种酶在最适温度范围内,酶活性最强,酶促反应速度最大.在适宜的温度范围内,温度每升高10℃,酶促反应速度可以相应提高1~2倍.不同生物体内酶的最适温度不同.过高或过低的温度都会降低酶的催化效率,即降低酶促反应速度。

d. pH对酶促反应速度的影响酶在最适pH范围内表现出活性,大于或小于最适pH,都会降低酶活性.主要表现在两个方面:①改变底物分子和酶分子的带电状态,从而影响酶和底物的结合;②过高或过低的pH都会影响酶的稳定性,进而使酶遭受不可逆破坏。

e.能激活酶的物质称为酶的激活剂.激活剂种类很多,有①无机阳离子;②无机阴离子;③有机化合物、还原性谷胱甘肽等.能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂.它可降低酶促反应速度.酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、表面活性剂等。

1.3 细菌脱氢酶活性的测定

1.3.1 脱氢酶

脱氢酶（dehydrogenases）是一类催化物质氧化还原反应的酶，在酶学分类中属于第一大类。反应中被氧化的底物叫氢供体或电子供体，被还原的底物叫氢受体或电子受体。当受体是O2时，催化该反应的酶称为氧化酶，其他情况下都称为脱氢酶。脱氢酶是已知酶中种类最多的一类，其中以催化供体中醇基团（—CHOH）、醛、酮基团（—HCO或—RCO）及烷基因（—CH2—CH2—）脱氢的为最常见。天然受体主要有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）和细胞色素。

大多数脱氢酶的天然受体是NAD+或NADP+(以下用NAD(P)+表示)，例如苹果酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶等。脱氢酶的底物经这类脱氢酶的催化使NAD(P)+还原生成NAD(P)H。另一些脱氢酶以黄素为辅基，辅基在催化反应中进行氧化还原。例如琥珀酸脱氢酶，还原型烟酰胺腺嘌岭二核苷酸（NADH）脱氢酶，胆碱脱氢酶等。NADH以及一些直接以黄素为辅基的脱氢酶的底物通过脱氢酶的催化最后通过细胞色素系统而被氧氧化，此时释放出的能量供机体需要。它们与细胞色素系统电子传递链的连接大体上可以用简单的图来表示（如下）。

NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶都含有黄素辅基。NADH脱氢酶的辅基是黄素单核苷酸（FMN），以非共价键与酶蛋白结合。琥珀酸脱氢酶的辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），以共价键与酶蛋白的组氨酸结合。

生物体中绝大多数氧化还原反应都是在脱氢酶及氧化酶的催化下进行。物质经脱氢酶催化氧化，最后通过电子传递链而被氧氧化，此时通过氧化磷酸化作用生成腺苷三磷酸（ATP），是异养生物体取得能量的主要途径。

1.3.2 酶催化活性测定的一般原理

酶的催化活性的测定方法分为定性和定量两种：定性的方法包括组织化学和度纸测定等；定量的方法包括简单反应和偶联反应两种。

具体说来，酶催化活性定量测定的简单反应是指，直接测定酶催化前后产物的量的变化。如果酶催化的是一个简单的反应：s p，在底物大大过量的情况下，酶催化的反应初速度与酶量成正比，因此通过测定反应后底物的减少或者产物的增加就可能确定酶的催化活性。由于底物量是大量存在的，只有在底物量显著减少时测定才能达到一定的精确性，所以一般大多数依靠测定产物的生成来确定酶的催化活性，这样可以提高灵敏度。只有在产物测定十分困难或者底物测定特别方便且灵敏度要求不高时，才采用测定底物减少的方法。

定量测定中的偶联反应的过程是：如果要测定的酶催化反应为A B、则将产物B与另一化合物C反应，通过测定C的变化来确定B的量，进而在确定酶的催化活性。这其中的化合物C通常是一种无色染料，通过与B反应后，被氧化成一定的颜色，即所谓的“指示剂反应”。

本实验所用的方法即为偶联反应，指示剂为噻唑盐。

1.3.3测定酶活性时的注意事项

a.测定反应初速度。酶催化反应的动力学表明，反应速度随着时间延长会越来越慢。如果用分光光度计来测定酶活性，通过吸收值A来表示产物浓度，用A对时间t作图，只有在反应初期曲线才近似直线，因此酶活性通常是在底物大大过量的情况下测定反应初速度来求得的。

b.精确计时。由于反应速度是通过测定一定时间内底物或者产物量变化而求得的，因此计时的精确性十分重要。活性测定都要求用秒表精确计时，据不能象一般化学分析那样将反应液保温一段大约的时间就算了。例如，如果保温需十分钟，计时误差在定分钟，则仅计时引起的测量误差就达10%。

c.恒温。酶反应受温度影响很大，因此测定时必须严格恒温。反应要放在自动控制温度的恒温水中或者恒温箱中，底物在与酶液混合之前应预保温若干时间，然后混合。

d.恒定缓冲液的pH和离子强度的要求。有些酶对pH变化十分敏感，pH显著改变反应速度。另为，有时样品本身含的酸或碱会严重改变反应系统的pH，缓冲液缓冲不了其酸或碱造成的影响，在这种情况下，可设法事先将样品调到需要的pH值，再测定。而缓冲液的离子强度对反应速度的影响没有这么显著，变化范围可以稍微大些，但也应尽可能维持恒定。

e.空白对照。用相同的空白对照，可以使得测量到的一系列值在比较大小时有同一标准，是结果更具有可靠性。如果忽略空白对照，则可能会引起相当大的误差。

1.3.4 细菌脱氢酶活性的测定原理

1911-1920年间，T.Thunberg氏先后报道了近40种有机化合物为动物细胞组织所氧化。其中以琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和柠檬酸氧化最快，并发明了测定氧化的方法，即Thunberg （桑泊）管法。1915年，Makaen，Zilue二人将此技术首先用于细菌脱氢酶活性测定的研究。

细菌脱氢酶活性测定方法甚多，Thunberg管法较其他方法，如液体石蜡法、氯化三苯基四氮法[TTC 法]更完善，重复性好，因而更为常用。

本实验所采用是噻唑盐还原法。噻唑盐是一种黄颜色的染料，能被脱氢酶产生的还原氢还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中；二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，使反应液呈现蓝紫色。控制底物与酶反应的时间一样，再用722分光光度计在510nm时测量各个反应液的OD510值，可间接表示脱氢酶反应速率，即脱氢酶活性。

1.4 TCA循环与四种底物

1.4.1 TCA循环总反应

TCA循环

Acetyl-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + P i + 3 H2O →CoA-SH + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP + 2 CO2柠檬酸循环是在细胞的线粒体中进行的。丙酮酸通过柠檬酸循环进行脱羧和脱氢反应；羧基形成CO2，氢原子则随着载体（NAD+、FAD）进入电子传递链经过氧化磷酸化作用，形成水分子并将释放出的能量合成ATP。

柠檬酸循环不只是丙酮酸氧化所经历的途径，也是脂肪酸、氨基酸等各种燃料分子氧化分解所经历的共同途径。此外柠檬酸循环的中间体还可作为许多生物合成的前体。也可以说柠檬酸循环是两用代谢途径。

a.三大营养素的最终代谢通路。糖、脂肪和蛋白质在分解代谢过程都先生成乙酰辅酶A，

乙酚辅酶A与草酷乙酸结合进入三羧酸循环而彻底氧化。所以三梭酸循环是糖、脂肪和蛋白质分解的共同通路。

b.糖、脂肪和氨基酸代谢的联系通路。三羧酸循环另一重要功能是为其他合成代谢提供小分子前体。α-酮戊二酸和草酰乙酸分别是合成谷氨酸和天冬氨酸的前体；草酰乙酸先转变成丙酮酸再合成丙氨酸；许多氨基酸通过草酰乙酸可异生成糖。所以三羧酸循环是糖、脂肪酸(不能异生成糖)和某些氨基酸相互转变的代谢枢纽。

1.4.2 TCA循环特点

（1）在此循环中，最初草酰乙酸因参加反应而消耗，但经过循环又重新生成。所以每循环一次，净结果为1个乙酰基通过两次脱羧而被消耗。循环中有机酸脱羧产生的CO2，是机体中CO2的主要来源。

（2）在三羧酸循环中，共有4次脱氢反应，脱下的氢原子以NADH+H+和FADH2的形式进入呼吸链，最后传递给O2生成H2O，在此过程中释放的能量可以合成ATP。

（3）乙酰辅酶A不仅来自糖的分解，也可由脂肪酸和氨基酸的分解代谢中产生，都进入三羧酸循环彻底氧化。并且，凡是能转变成三羧酸循环中任何一种中间代谢物的物质都能通过三羧酸循环而被氧化。所以三羧酸循环实际是糖、脂、蛋白质等有机物在生物体内末端氧化的共同途径。

1.4.3 乙醛酸循环

2乙酰-CoA + 2 NAD++ FAD → 草酰乙酸+ 2 CoA-SH + 2 NADH + FADH2 + 2 H+

此途径只存在于植物和微生物中。其主要内容是通过乙醛酸途径使乙酰-CoA转变为草酰乙酸，进而以生成的琥珀酸进入柠檬酸循环。

具体过程为：

草酰乙酸经乙醛酸循环体与乙酰辅酶A缩合成柠檬酸。但线粒体中的草酰乙酸不能透过

线粒体膜，必须在天冬氨酸氨基转移酶作用下接受谷氨酸分子的α-氨基形成天冬氨酸，才能跨越线粒体膜并进入乙醛酸循环体。在乙醛酸循环体内，天冬氨酸再经天冬氨酸氨基转移酶的作用将氨基转移到α-酮戊二酸分子上，本身形成草酰乙酸后，才能与乙酰-CoA结合形成柠檬酸。柠檬酸异构化形成异柠檬酸，与柠檬酸循环不同的是异柠檬酸不进行脱羧，而是经异柠檬酸裂合酶裂解成为琥珀酸和乙醛酸。乙醛酸与另一分子乙酰CoA在苹果酸合酶催化缩合形成苹果酸，苹果酸穿过乙醛酸循环体膜进入细胞溶胶，由苹果酸脱氢酶将其氧化为草酰乙酸。在乙醛酸循环中，两个关键酶为异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶。

另外，细胞溶胶中的草酰乙酸可经糖异生转变为葡萄糖。异柠檬酸裂解产生的琥珀酸又可跨膜进入线粒体，通过与柠檬酸相同的途径形成草酰乙酸，同时将2分子NAD+和1分子的FAD还原。

1.4.4 四种底物与TCA循环关系

a.柠檬酸钠:TCA反应开始时，草酰乙酸与乙酰-CoA缩合形成柠檬酸，由柠檬酸合酶催化，柠檬酸再异构成异柠檬酸，以进一步氧化。柠檬酸是柠檬酸合酶底物之一的草酰乙酸的竞争性抑制剂，柠檬酸浓度的下降又促使柠檬酸的合成。若由此步进入TCA循环，共产生2NADH 和1FADH2。

b. α-酮戊二酸：由异柠檬酸氧化脱羧形成，中间产物是草酰琥珀酸。在有些细菌体内，异柠檬酸的转变有两条途径。当需要能量时，即进行氧化脱羧形成α-酮戊二酸；当能量贮备充裕时，异柠檬酸裂解为琥珀酸和乙醛酸，由异柠檬酸裂解酶催化。另外，α-酮戊二酸脱氢酶受产物NADH和琥珀酰-CoA的抑制，如果NADH的浓度下降，α-酮戊二酸脱氢酶的活性也必然升高。若由此步进入TCA循环，共产生1NADH和1FADH2。

c.琥珀酸钠；α-酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酰-CoA，由α-酮戊二酸脱氢酶催化，是一步不可逆反应；接着琥珀酰-CoA转化成琥珀酸并产生一个高能磷酸键。若由此步进入TCA循环，共产生1NADH和1FADH2。

d. NaAc: 乙酸是通过乙醛酸途径进入TCA循环的，具体反应是，乙酸通过乙酰-CoA合成酶变成乙酰-CoA，再通过乙醛酸途径变成草酰乙酸，由乙醛酸循环中产生的琥珀酸进入TCA 循环，生成草酰乙酸，完成一次循环。整个循环过程可以看做是将两个乙酰-CoA分子转变为一分子草酰乙酸，同时将2NAD+和1FAD还原。

1.5 酶促反应动力学分析

1.5.1 米氏方程

酶活性可通过酶在特定条件下的反应速度来表示，底物浓度是影响酶促反应速度的一个重要因素。在其它因素保持不变的情况下，底物浓度对反应初速度影响的作用呈现矩形双曲线。在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到

饱和时所需底物浓度各不相同而已。米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是描述这种非变异构酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。

米氏方程：

V0：酶促反应初速率；

Vmax：酶促反应在实验条件下达到的最大速率，是Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度；Km：米氏常数，酶的特征常数；

[S]：底物浓度。

在本实验中，琥珀酸钠与酶活性的关系符合米氏方程。

催化琥珀酸钠反应的酶是琥珀酸脱氢酶，与FAD的关系是以共价键互相连接，因此它们是酶和辅基的关系。且琥珀酸脱氢酶不是变构酶，其活性不受产物FAD的反馈抑制。因而当琥珀酸浓度在一定范围内时，其活性随着琥珀酸浓度的增加而增加，曲线呈上升趋势；当琥珀酸浓度高于某值时，由于底物浓度过量，远远大于酶量，由v=V max﹒[S]/(K m+[S])可知，其反应速率v= V max，因而表现为平滑的直线。

1.5.2 酶的变构调节

a.反馈抑制。是一种负反馈机制，其中酶促反应的末端产物可抑制在此产物合成过程中起作用的酶。这种抑制具有协同性、积累性和序贯性。

b.酶活性调节的分子机制。酶活性调节的分子机制主要有两种：别构调节（酶分子构象发生改变），酶分子的化学修饰（酶分子结构发生改变）。

别构酶能够调节其催化活性，它们具有的共同特性：①别构酶含多个亚基；②别构酶分子中含有两个中心，即催化中心和调节中心，它们在空间上是分开的，可以在不同的亚基上，也可以在同一亚基的不同部位上；③每个别构酶分子可以结合一个或多个配体（底物和效应物），理论上结合底物的最大数目与催化中心的数目相等，结合的效应物的最大数目应与调节中心的数目相等；④配体和酶蛋白的不同部位（或亚基）结合时，可在底物-底物、效应物-底物、效应物-效应物之间发生协同效应，此效应可促进或抑制；⑤因别构酶有协同效应，故底物（S）对反应速度（V）的动力学曲线不是双曲线，而是S曲线（正协同）或表现双曲线（负协同），二者都不符合米氏动力学。

在本实验中，异柠檬酸脱氢酶是一个别构调节酶，这也解释了为什么柠檬酸与脱氢酶之

间的相互作用不符合米氏方程的原因。

异柠檬酸脱氢酶的活性受ADP变构激活。ADP可增强酶与底物的亲和力。该酶与异柠檬酸、Mg2+、NAD+、ADP的结合有相互协同作用。与NAD+、ADP的作用相反、NADP、ATP 对该酶起别构抑制作用。NAD+的含量升高，不仅有利于柠檬酸脱氢酶，对其他需要以NAD+为辅助因子的酶促反应也有推动作用。异柠檬酸脱氢酶所具有的这些性质，使它在柠檬酸循环中起到调节酶的作用。当柠檬酸浓度在一定范围内的时候，产物的抑制作用没那么强，随着底物浓度的升高，酶的活性逐渐增强，反应速度随底物浓度的增加而增加；当柠檬酸浓度高于某值时，产物NADPH和ATP积累到一定程度，则会使异柠檬酸脱氢酶发生变构，活性

降低，使反应减慢，随着柠檬酸浓度的继续增加，变构抑制作用便会增强，因此酶活性会随之下降，最后形成钟罩型曲线。

2.材料和方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌种

E.coli cVcc249

2.1.2 培养基

完全液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL ，pH 7.0

（100mL，两瓶）

完全固体培养基：按2%加入琼脂

2.1.3 试剂与仪器

试剂：0.1M乙酸钠、0.1M琥珀酸钠、0.1Mα-酮戊二酸、0.1M 柠檬酸钠，PBS缓冲液（pH 7.0：制悬浮液用，pH 7.4：配制噻唑盐时用），0.1M NaCl，噻唑盐（终浓度为5mg/mL），二甲亚砜。

PBS缓冲液配方（1L）：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g

仪器：试管，三角瓶，5mL离心管，移液枪，枪尖（1000mL，200mL），天平，称量纸，玻璃棒，接种环，酒精灯，振荡器，离心机，振荡培养箱，恒温箱，722分光光度计。

2.2 方法

2.2.1 菌种的活化和扩大培养

a.无菌操作，将E.coli cVcc249保藏菌种转接到试管完全固体培养基斜面，37℃培养18~24h。

b.无菌操作，选取生长良好的活化菌种转接到含有完全液体培养基的三角瓶中，在振荡

培养箱中，37℃培养16~18h（OD600>1.0）。

2.2.2 休止细胞的制备

a.将三角瓶中的菌体倒入离心管中，4500rpm，10min，收集沉淀。

b.0.1M的生理盐水洗涤沉淀三次，每次4500rpm，10min。以洗掉细胞表面的营养物质。

c.用pH 7.0的磷酸缓冲液（PBS）10~20mL（用量根据使菌体数量而定）制备菌悬液。在本次实验中，本组加了15mL PBS。

d.将制成的菌悬液放入0℃冰箱，72hr。再放到37摄氏度恒温箱中4~8hr，以降低内呼吸。休止细胞即制得。

2.2.3 底物的配制

a.分别配制浓度为0.1M的四种底物：乙酸钠、琥珀酸钠、α-酮戊二酸和柠檬酸钠。

b.配制琥珀酸钠的浓度梯度：0.1M、0.1/10 M、0.1/20 M、0.1/30 M、0.1/40 M。

c.配制柠檬酸钠的浓度梯度：0.1M、0.1/2 M、0,1/3 M、0.1/4 M、0.1/5 M、0.1/10 M、0.1/15 M、0.1/20 M、0.1/25 M。

2.2.4 酶与底物反应（每组实验平行三次）（浓度见结果）

对于每个酶与底物的反应：在5mL的离心管中，加入0.4mL的休止细胞+1mL底物+40uL

噻唑盐，振荡混匀，在37℃下反应1~2hr（反应时间试指示剂的变色程度而定，但一定要确

保每个离心管中酶和底物的反应时间相同）；反应完后，再离心管中加入1.3mL的二甲亚砜，混匀振荡，并在37℃恒温箱中保温30min，以终止反应。

注：为了确保每个离心管中的酶和底物反应时间相同，比如说都为1.5hr，可将离心管排成一排，先都加上底物，再加休止细胞的时候，各个离心管间间隔时间为5s；在终止反应时，也已同样的顺序加入二甲亚砜，时间间隔同样是5s。

2.2.5 测定OD510值

a.以蒸馏水为空白对照，调节分光光度计：波长为510nm，吸光值为0，透光值为100。

b.先测试一个样品的吸光值，若吸光值大于0.7，则在每个样品中都加入适量的PBS（pH 7.0）缓冲液，混匀，以使每个样品最终测量值都在0.2~0.7之间（因为本分光光度计敏感的测量范围在0.2~0.7之间）。

c.测定各个样品的OD510值，并做好实验记录。

3. 结果

表一：大肠杆菌休止细胞与各种底物反应后测得的OD510nm值

在origin和excel上作图得一下结果：

4. 分析

4.1 大肠杆菌脱氢酶活性随柠檬酸钠浓度的变化

从图1中可以看到，曲线呈钟罩型，即柠檬酸钠浓度在一定范围内时，大肠杆菌脱氢活性随其浓度的增加而增加；但当柠檬酸钠浓度达到0.04M 时，大肠杆菌脱氢酶活性随其浓度的增加而降低。可以看出，当柠檬酸钠浓度在0.04M 左右时，是细菌脱氢酶活性最适的浓度范围。

产生这种现象的原因：当加入的底物为柠檬酸钠时，柠檬酸经乌头酸酶催化作用，产生0.5610.712

0.5236666670.4643333330

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

柠檬酸钠琥珀酸乙酸钠酮戊二酸柠檬酸钠琥珀酸乙酸钠酮戊二酸

一系列的构象的变化，变为异柠檬酸后，在异柠檬酸脱氢酶的作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，再脱羧形成α-酮戊二酸、NADH和CO2，为不可逆反应，也是TCA循环中的限速步骤。而异柠檬酸脱氢酶是一个别构调节酶，活性受ADP变构激活。ADP可增强酶与底物的亲和力。该酶与异柠檬酸、Mg2+、NAD+、ADP的结合有相互协同作用。与NAD+、ADP的作用相反、NADH、ATP对该酶起别构抑制作用。NAD+的含量升高，不仅有利于柠檬酸脱氢酶，对其他需要以NAD+为辅助因子的酶促反应也有推动作用。当柠檬酸浓度在一定范围内的时候（小于0.04M），产物的抑制作用没那么强，随着底物浓度的升高，酶的活性逐渐增强，反应速度随底物浓度的增加而增加，因而曲线呈现上升趋势；当柠檬酸浓度高于0.04M时，产物NADPH和ATP积累到一定程度，则会使异柠檬酸脱氢酶发生变构，活性降低，使反应减慢，随着柠檬酸浓度的继续增加，变构抑制作用便会增强，因此酶活性会随之下降，曲线呈现下降趋势。所以柠檬酸钠浓度与细菌脱氢酶活性的关系会呈现钟罩型曲线。

将实验数据用origin8.1作图，并用Gauss函数拟合，拟合曲线的卡方为3.44903×10-5，相关度（R2）为0.9372，可以看出数据偏离非线性分析的结果不大。

4.2 大肠杆菌脱氢酶的活性随琥珀酸钠浓度的变化

从图2可以看出，曲线是双曲线，符合米氏方程曲线。即琥珀酸浓度在一定范围内时，大肠杆菌脱氢酶活性随其浓度的增加而增加；当琥珀酸浓度到达0.03M时，随着其浓度的增加，大肠杆菌脱氢酶活性基本保持恒定水平。可以看出，当琥珀酸浓度在0.03M时，酶的活性达到最大，之后即使底物浓度再有增加，酶活性也基本保持不变。

产生这种现象的原因：在TCA循环中，琥珀酸会在琥珀酸脱氢酶的作用下生成延胡索酸和FADH2。琥珀酸脱氢酶与柠檬酸循环中的其他酶不同，是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒体内膜的一个重要组成部分，其他酶通常存在于线粒体基质上。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸的脱氢具有严格的立体专一性。并且它是以FAD作为其脱下电子的受体而不是NAD+，其与FAD的关系是以共价键互相连接，因此它们是酶和辅基的关系，而且这个辅基是一种修饰形式，其8a位碳原子与酶的组氨酸残基相连。由此可见，琥珀酸脱氢酶不是变构酶，其活性不受产物FAD的反馈抑制。因而当琥珀酸浓度在0.03M之前时，其活性随着琥珀酸浓度的增加而增加，曲线呈上升趋势；当琥珀酸浓度高于0.03M后，由于底物浓度过量，远远大于酶量，由米氏方程v=V max﹒[S]/(K m+[S])，反应体系中[S]>>[E],当[S]很高时所有酶都被底物所饱和形成ES，即[E]=[ES],则酶反应速率v=V max，V max=k﹒[E] [s]/ (K m+[S]) =k﹒[E]，取决于酶的浓度，因而酶活性保持不变状态。

将实验数据用origin8.1作图，并用Hill函数拟合，取n=1后，拟合的曲线：卡方为9.4334×10-4，相关度（R2）为0.87188，可以看出数据偏离非线性分析的结果不大；另外，从拟合的结果可以看出，在底物为琥珀酸钠的情况下，脱氢酶的Km值为0.101×10-3mol/L，V max为0.73689。

4.3 同样浓度下四种不同底物对脱氢酶活性的影响

乙醛酸循环和TCA循环之间的关系如下图显示

乙醛酸和TCA循环总图

由图3可知，脱氢酶活性在四种底物下的大小顺序为：琥珀酸钠>柠檬酸钠>乙酸钠>α-酮戊二酸。这是由它们各自进入TCA循环的顺序和产生还原氢的能力所决定的。

由反应过程可以看出，琥珀酸、乙酸、α-酮戊二酸在循环过程中都产生1FADH2和1NADH，它们对酶活性的影响就主要取决于它们进入TCA循环的顺序。由于产生FADH2是在琥珀酸脱氢生成延胡索酸这步完成的，产生NADH是在苹果酸脱氢生成草酰乙酸这步完成的，即它们都是在相同的反应中产生还原氢的，而由图可知，在这三种底物中，琥珀酸是最先进行脱氢的，因而其酶活性最高，但乙酸和α-酮戊二酸的先后顺序就无从比较了。至于柠檬酸对酶活性的影响，虽然它在TCA循环中产生2NADH和1 FADH2，但其异柠檬酸脱氢酶是一种变构调节酶，受产物NADPH和ATP的变构抑制，而在高浓度的柠檬酸条件下，其产物浓度也相应增高，则会使异柠檬酸脱氢酶活性降低；由于其脱氢酶性质不同于其他三种底物的脱氢酶性质，因而也无法比较它们脱氢酶活性的大小。

但由上述分析可知，在琥珀酸钠的影响下，其脱氢酶活性要高于乙酸钠和α-酮戊二酸的，柱状图图3符合这一理论情况。

5.讨论

5.1 实验总括

本实验所用的方法是用MTT法测量大肠杆菌脱氢酶的活性。MTT：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄色染料。在实验中，细菌线粒体中脱氢酶可以使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，再加入二甲基亚砜，可溶解细胞中的甲瓒。用分光光度计测量其反应液的OD510nm值，由于反应是在相同条件和相同时间下进行的，因而测量的OD510nm即可表示酶与底物的反应速率，又可进一步表示酶活性大小。

在本实验中，由于脱氢酶活性为定性测量的，而且没有酶活性的标准曲线做比较，再加上所测得的是细菌中总的脱氢酶活性的大小，为一个复合酶体系，使得酶与底物之间的反应受到多方面的影响，因而无法对其大小进行定量的分析。

5.2 实验注意事项

①在从保藏菌株转接至试管中时，一定要无菌操作，因为所用的培养基为完全培养基，一般的微生物也能生长，为确保所测得的脱氢酶活性是来自于保藏菌种的，所以第一步活化菌种时一定要确保无菌操作。

②活化菌种后，大肠杆菌需要扩大培养，在应生理盐水洗涤之前，要确保OD值>1.0，这样才能保证之后制备的休止细胞的菌浓度不至于过稀，而影响实验结果。如果菌浓度过浓，则会使曲线只出现前半部分；反之，如果菌浓度过稀，则会使曲线只出现后半部分。

③扩大培养后，需用生理盐水洗涤菌体，要彻底，以尽量洗去细菌外所附着的培养基，以免培养基残留在细胞表面后，影响休止细胞的制备。另外，在制备休止细胞菌悬液时要根据实际情况确定加入缓冲液的量，同样是为了避免制备的菌悬液过稀或过浓。如果实验条件允许的话，可以通过测量其OD值，多次重复试验，以确定最适的菌浓度。另外，所制备的菌悬液需保存在冰箱中。

④底物和酶的反应时间需严格控制，具体需要严格控制时间的步骤为加底物和加二甲亚砜这两步。在实验过程中，所需用的离心管很多，应做好标签，次序放好，再加入酶和底物。最好分工合作，一人负责加试剂，一人负责计时间间隔。如果时间控制的不好，致使反应的时间有多有少，便会严重影响最后所测的的酶活性的可靠性。这是本实验的关键步骤之一，也是本实验误差来源之一。

⑤噻唑盐必须避光保存，因其见光易分解。另外，由于噻唑盐和二甲基亚砜都有毒性，再加入这两种试剂时，需戴手套进行操作。

⑥在用分光光度计测量其OD值时，由于本实验中所用的分光光度计适合的测量范围在

0.2~0.7中，在测量前需检测下样品的OD值是否在这个范围内，如果过高，则加适量PBS稀释。另外，在测量前，样品需充分混匀，且动作要快，以免甲瓒又结晶出来，影响测量的结果。空白对照为蒸馏水。

⑦由于酶的活性受很多因素的影响，比如说pH和温度。本实验所用的大肠杆菌，其脱氢酶活性的最适pH为7.0，温度为37℃。因此在实验中，要严格控制这两个量。

5.2 实验关键点

①休止细胞菌悬液的浓度一定要适中。

②底物和酶的反应时间一定要严格控制，以免引起大的误差。

③在测量OD值前，样品一定要充分混匀。

④严格控制缓冲液的pH（7.0），酶反应温度（37℃）。

6.致谢

感谢张老师在此次实验中给予的指导，感谢同组同学实验中的默契。

7.参考文献

【1】王镜岩、朱圣庚、徐长法，生物化学（第三版）上册，高等教育出版社，2009年。【2】王镜岩、朱圣庚、徐长法，生物化学（第三版）下册，高等教育出版社，2009年。【3】微生物大实验，山东大学出版社。

【4】微生物生理，山东大学出版社。

【5】百度，谷歌，维基百科搜索。

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）

土壤酶活性测定方法

土壤酸性磷酸酶活性的测定 1．试剂配制 (1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液 取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至 2 250ml.4摄氏度冰箱保存。 (2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀） 原液由以下成分组成: 三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g 溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯 (4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液： 36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤 置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。 培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3．计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示， W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t） 式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）； t —反应时间（h）；=1h m—样品土壤的重量（g） 无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。 标准曲线的制作： 1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。 2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml， ②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 ③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（mg）=a+b×A410.

植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书 微量法

植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC3125 规格:100T/48S 产品内容： 试剂一：粉剂×2瓶。使用前加少量水溶解，定容至50mL，避光、4℃保存（尽量现配现用）。 试剂二：液体100mL×2瓶，4℃保存。 试剂三：乙酸乙酯，自备。 产品说明： 生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase,PDHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。 受氢体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，即TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，其还原产物三苯基甲替（TriphenylFormazone，即TFF）呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得植物脱氢酶活性。 试验中所需的仪器和试剂： 台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯/聚丙烯材质）、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水、乙酸乙酯（不允许快递，请用户自备）。 操作步骤： 一、样品处理： 称取0.1g的植物组织，用双蒸水清洗3-4次，用滤纸吸干水分，备用。 二、测定步骤： 1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至485nm，乙酸乙酯调零。 2、操作表：取5mLEP管依次加入

对照管测定管 样品（g）0.10.1 试剂一（mL）1 试剂二（mL）21 充分混匀，37℃，暗培养3h，取出后立即冰浴5min，去滤液，尽量用滤纸吸干样品，置于研钵/匀浆器中。 试剂三（mL）11 充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，用少量试剂三冲洗研钵，一起加入离心管，用试剂三定容至2mL，10000rpm/min，4℃，离心5min，取200μL上清至微量 玻璃比色皿或96孔板中，测定485nm下的吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。 三、脱氢酶活力计算 A:用微量玻璃比色皿（光径，1cm）测定的计算公式如下 酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.01为一个酶活单位。 脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.01÷T÷W=33×ΔA÷W。 B:用96孔板（光径，0.5cm）测定的计算公式如下 酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.005为一个酶活单位。 脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.005÷T÷W=66.7×ΔA÷W。 T：反应时间，3h；W：样品鲜重，g。 注意事项： 1.配制好的试剂一避光保存于4℃，尽量在一周内使用，若出现红色，则不能使用。 2.试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。 3.反应完成后立即冰浴以终止反应，并去除干净残留的反应液。 4.如果测定出来的吸光值较大，需把样品适当稀释再进行测定，注意计算公式乘以稀释倍数。 5.如果用96孔板进行检测，建议不要使用聚苯乙烯/聚丙烯材质的96孔板。

土壤酶活性测定的实验步骤

土壤酶的测定 1．三角瓶用稀HNO 3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2．土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5×2=29g。 一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323） 1．试剂配制： (1)0.3%过氧化氢溶液： ①（1：100 30%的H 2O 2和水） ②（0.5molH 2O 2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H 2O 2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸： （10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液： （1.58gKMnO

4+100ml蒸馏水） 2．操作步骤： 2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H 2O 2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3．结果计算 过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO 4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中： A： 空白消耗的0.1N KMnO 4毫升数 B： 滤液消耗的0.1 N KMnO 4毫升数 T： KMnO 4滴定度的校正值

以容量法测H2O2的酶活： Kappen （1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H 2O 2与土壤相互作用时，未分解的H 2O 2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H 2O 2）测定H 2O 2的酶活 2 KMnO 4＋5H 2O 2＋3H 2SO 4→2MnSO 4＋K 2SO

乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法

乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 货号：BC1080 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存。临用前把试剂二转移到试剂一中，分装保存于-20℃。 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。 ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm吸光度下降速率，来计算ADH活性。 自备仪器和用品： 研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提 取液）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。 2、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞 加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。 3、血清等液体：直接测定。 二、ADH测定操作：

1.分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃水浴中保温30min以上。 3.空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于 340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A空白管=A1-A2。空白管只需做1~2个。 4.测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于 340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。△A测定管=A3-A4。 三、ADH活性计算： （1）按照蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/mg prot)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管)÷Cpr （2）按照样本质量计算 活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/g)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(W×V样÷V样总)÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管)÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/104cell)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管)÷细胞数量 （4）按液体体积计算 活性单位定义：25℃中每毫升样品每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/mL)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管) ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；

土壤酶活性测定

土壤酶活性测定 几种水解酶：芳基硫酸酯酶（Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)）, 葡萄糖苷酶（β-glucosidase(EC 3.2.1.21) ）和磷酸单酯酶（phosphmonoesterase(EC 3.1.3)）测定：这三种酶的测定都是依据人工合成底物（p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively）裂解后释放的p-nitrophenol 的量来测定。 Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)：称取1g土（湿重），与4ml 500mM乙酸缓冲液（acetate buffer）（pH5.8）和1ml底物（25mM）混匀。对照为4ml乙酸缓冲液加1ml灭菌蒸馏水。土壤稍作涡旋振荡，置于旋转摇床20℃，200rpm培养2h。然后，往样品中加1ml 无菌蒸馏水，往对照中加1ml底物。再加入1ml 500mM 氯化钙和4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬浮液在旋转摇床上20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，然后在400nm波长下测定上清夜中所提取的p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定，则用蒸馏水取代乙酸缓冲液。标准曲线制作：用蒸馏水配制p-nitrophenol溶液，浓度范围0-50ug/ml。 β-glucosidase(EC 3.2.1.21)：缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH6.0);底物浓度25mM，提取液用Tris缓冲液（pH12.0）. phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer）(pH4.0和9.0)（分别测定酸性和碱性磷酸酯酶），底物浓度为15mM。 脲酶Urease (EC 3.5.1.5): 称取5g土（湿土），加2.5ml脲（80mM）和20ml 75mM 硼酸缓冲液（pH10.0）。涡旋振荡，旋转摇床20℃，200rpm振荡反应4h。对照为加2.5ml灭菌蒸馏水和20ml硼酸缓冲液。4h后，处理中加2.5ml灭菌蒸馏水，对照中加2.5ml脲。然后用30ml酸化的2M氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床20℃，200rpm振荡30min。9464×g离心5min，取1ml上清夜与9ml 蒸馏水、5ml水杨酸钠（sodium salicylate）/ 氢氧化钠溶液和2ml dichloroisocyanuric acid(Na+盐)混允，20±2℃静置1h，在690nm波长下测定溶液的颜色强度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作，浓度范围0-2.5ug/ml。 脱氢酶（Dehydrogenase）： INT（2(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride）还原酶活性（既脱氢酶活性）采用Von Mersi 和Schinner（1991）的方法测定。1g鲜土置于带盖的玻璃瓶中，加入1.5ml 1M Tris缓冲液（pH 7.0）和2ml INT（5mg/ml，溶于2%体积比的二甲替甲酰胺（N，N-dimethylformamide）中）。对照土壤加1.5ml Tris缓冲液和2ml蒸馏水。旋转摇床20℃，200rpm培养24h。然后，往样品中加2ml蒸馏水，而往对照土样中加2ml INT。然后加10ml N，N-dimethylformamide/ 甲醇（1：1，v/v）提取液终止反应，20℃，200rpm振荡1h。9464×g离心5min，464nm波长下测定上清夜的吸光值。对于中性土壤用蒸馏水取代Tris缓冲液。用INTF（iodonitrotetrazolium chloride）（Sigma）制作标准曲线，浓度范围0-27ug/ml提取液。 荧光素二乙酸酯水解（Fluorescein diacetate hydrolysis）： 称取3g鲜土，悬浮于50ml 磷酸盐缓冲液，加入250ul FDA（2mg/ml，溶于丙酮）。对照加250ul蒸馏水。土壤悬浮液在20℃，200rpm培养4h。培养结束后，样品中加250ul 蒸馏水，而对照中加250ul FDA。悬浮液涡旋振荡，取5ml置于含5ml丙酮的试管中以终

土壤酶活性测定方法综合

土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。

乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测试剂盒说明书微量法

乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC0755 规格：100T/96S 产品内容： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂40mg×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入3mL蒸馏水溶解，-20℃分装保存；或者按比例现用现配。 试剂三：液体0.5mL×1支，4℃避光保存。 试剂四：液体1mL×1支，4℃保存。 试剂五：液体2mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶I 的存在下，它催化乙醇在内的某些一级或二级醇、醛或酮的脱氢反应。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。 乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min。 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定步骤： 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。 3、操作表： 试剂名称空白管测定管 样本（μL）40 蒸馏水（μL）10060 试剂一（μL）6060 试剂二（μL）2020 试剂三（μL）44 试剂四（μL）66 试剂五（μL）1010 在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱1min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定90s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、ALDH酶活计算 1、按微量石英比色皿计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。 ALDH酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Crp）÷T=804×△A÷Cpr （2）按样本质量计算

土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯

纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘　要　用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙　词:　测试　纤维素酶　活度中图分类号:　TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1　实验方法 1.1　化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2　FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3　针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2　结果与讨论 2.1　显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 　H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2　最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1　D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3　底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4　葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印　染(2002No .8) www .cdfn .com .cn

土壤脱氢酶活性的测定

土壤脱氢酶活性的测定 一、实验原理 脱氢酶的正式命名是AH：B氧化还原酶，广泛存在于动植物组织和微生物细胞内，它能酶促一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对土壤中有机物的氧化分解能力，即土壤酶的活性。 已知受氢体可接受脱氢酶脱出的氢原子，根据接收氢原子的量可以判断脱氢酶的活性。如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，俗称红四唑）接受氢后变成红色的三苯基甲瓒（TF），根据产生红色的色度进行比色定量分析，就可以判断脱氢酶的活性。通常，吸光度越大（红色越深），脱氢酶活性越大。 二、实验材料、试剂和仪器 1．材料：过0.9mm孔径筛的土壤样品，8g 2．试剂：0.36%Na2SO3溶液，15ml Tris-HCl缓冲液（PH=7.6），45ml 0.4%TTC,7.6ml Na2S2O4，十几粒 甲醛，10ml 丙酮，20ml 3．仪器：50ml具塞比色管，6只 比色管架，1只 1~5ml移液枪，1只（枪头3个） 100~1000ul移液枪1只（枪头1个） 药匙1个 水浴锅1个 分光光度计1台 分析天平1台 离心管4只 培养箱1台

离心机1台 三、实验步骤 1．标准曲线的绘制 （1）按下表配制系列浓度的TTC标准溶液。 （2）显色。 用药匙向每只比色管中各加入少许连二亚硫酸钠（Na2S2O4），混匀，使TTC 全部还原为红色的TF。用1~5ml移液枪向各管滴加1ml甲醛终止反应，摇匀后再加入2ml丙酮震荡摇匀，37℃水浴10min。 （3）测定吸光度，绘制标准曲线。 在485nm波长下测定各管溶液的吸光度A，并以A为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。 2．土壤脱氢酶活性的测定 （1）培养并显色（此步骤由助教预先完成）。 首先，按下表向四只离心管中分别加入以下物质 然后，将以上四只离心管避光，37℃保温培养12~24h。 （2）培养结束后，用1~5ml可调式移液枪向各管分别加入1ml甲醛终止反应，

土壤漆酶活性检测试剂盒说明书 微量法

土壤漆酶活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC1965 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×2瓶，4℃避光保存，临用前每瓶加7.5mL试剂一溶解。 试剂三：液体3mL×1瓶，常温保存。若有白色物质析出，放于37℃中溶解即可。 产品说明： 土壤漆酶（SL）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌和高等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维素降解以及生物检测方面有非常广泛的应用。 漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、震荡仪、30目筛（或更小）。操作步骤： 一、样本处理 新鲜土样风干，过30目筛。 二、测定操作 1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到420nm，蒸馏水调零。 2.加样表： 试剂名称测定管对照管 土样（g）0.030.03

试剂一（μL）135135 试剂二（μL）150- 37℃水浴反应10min。 试剂三（μL）1515 试剂二（μL）-150 4℃12000g离心15min，取200μL上清于420nm测定其吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。 三、土壤漆酶（SL）活性计算公式 （1）按微量比色皿计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.833×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，3×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 （2）按96孔板计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol ABTS自由基所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 SL活性（U/g）=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T= 1.39×△A÷W。 ε：ABTS自由基摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，0.6cm；V反总：反应总体积，3 ×10-4L；W，样本质量，g；T：反应时间，10min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 注意事项： 1.试剂一需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。 2.测定之前进行预实验，若吸光值较高（A＞1.5），请减少土样质量再进行测定。若数值偏小可以延长反 应时间或增加土样质量进行测定。 3.离心后若上清仍然浑浊，可再次离心去除。

酶活性测定方法

酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化

土壤脱氢酶(S-DHA)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法

土壤脱氢酶（S-DHA）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0390 规格：50T/24S 产品简介： 土壤脱氢酶(Soil dehydrogenase,sDHA)的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，可以作为土壤微生物的降解性能指标。 氢受体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride,TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，被还原为三苯基甲臜（Triphenyl Formazone,TF），TF呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得土壤脱氢酶活性。 试验中所需的仪器和试剂： 筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计、玻璃比色皿，冰、蒸馏水、丙酮（不允许快递，请用户自备）。 产品内容： 试剂一：粉剂×1瓶，使用前加30ml水溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。 试剂二：液体50ml×1瓶，4℃保存。 试剂三：丙酮，自备。 操作步骤： 一、样本前处理： 1.土壤样品：准确称取过40目筛的新鲜土壤样品约0.1g（以保证TTC与土壤颗粒充分接触）。 2.污泥样品：污泥用蒸馏水洗涤，12000rpm，25℃，离心10min，弃上清，反复3-4次。 二、测定操作： 对照管测定管 样品（g）0.10.1

试剂一（ml） 0.5试剂二（ml）10.5 充分混匀，37℃，暗培养6h，取出后立即冰浴5min 试剂三（ml）0.50.5 反复震荡数次，37℃保温10min，12000rpm，4℃，离心5min，取上清1ml 于1ml 玻璃比色皿， 分光光度计提前30分钟预热，蒸馏水调零，测定对照管和测定管，计算△A。 脱氢酶活力的计算： 酶活单位定义：在37℃时，每克样品每小时使每ml 反应体系OD 值每增加0.01为一个酶活单位。计算公式：sDHA 活性（U/g）=01.0△A ÷培养时间（6h）÷样品质量（0.1g）×V 反总（1.5ml） =250×A 485 注意事项： 1. 配制好的试剂一避光保存于4℃，最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。2. 试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。3. 反应完成后立即冰浴以终止反应。4. 如果测定出来的吸光值较大，减少样品用量再进行测定，若吸光值过小则延长培养时间。5.试剂盒2-8℃保存。

土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)

土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，

酶活性测定方法

一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；

2.1土壤酸性磷酸酶活性测定

土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数