小鼠颅内感染模型中agr系统对金黄色葡萄球菌毒力调控作用的探究

Ningxia Medical University Thesis for Application of Master’s Degree

The Accessory Gene Regulator (agr) Controls Staphylococcus Aureus Virulence in a Murine Intracranial Infection Model

Student’s Name:Li Dongzhi

Supervisor：Sun Tao

Subject Category:Medicine

Major:Surgery

Specialty: Basic and Clinical Study of Epilepsy

School: Ningxia Medical University

Completion Date:Apr 2014

宁夏医科大学学位论文独创性声明

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年月日年月日

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年月日年月日

小鼠颅内感染模型中agr系统对金黄色葡萄球菌

毒力调控作用的研究

摘要

目的建立由金黄色葡萄球菌引起的小鼠颅内感染模型。研究小鼠颅内感染模型中agr系统对金黄色葡萄球菌毒力的调控作用。

方法选取6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠作为本研究的实验对象，通过颅内定点注射金黄色葡萄球菌菌液的方法建立小鼠颅内感染模型，对照组小鼠注射等量的生理盐水。造模成功后，观察小鼠的症状，观察最早出现死亡的时间点及48h存活率。检测肛温、外周血白细胞计数及中性粒细胞百分比。取脑组织做病理切片，观察脑组织病理学改变。应用agr系统缺失的金葡菌菌株造模，观察不同菌株对小鼠致死性的差别。同时，在agr 系统缺失的金葡菌菌株中回复表达了α溶血素，并检测α溶血素在小鼠颅内感染模型的作用。全血杀伤实验检测金葡菌对全血的敏感性。

结果模型组小鼠出现反应迟钝、抽搐等症状，12h开始出现死亡，48h生存率为26.9%，中性粒细胞百分比明显增高，脑组织病理学显示感染处大量中性粒细胞浸润。对照组均未见上述症状和死亡，脑组织病理学检查正常。进一步的实验结果显示，由agr 系统缺失的金葡菌引起的颅内感染，小鼠死亡率明显降低。此外，还发现agr系统中调控分子RNAIII在颅内感染进程中至关重要。在agr系统缺失的金葡菌中回复表达了α溶血素之后，能部分恢复其致死性。

结论本文建立的小鼠金黄色葡萄球菌颅内感染模型特征稳定，可用于临床金葡菌颅内感染致病机制的研究。在小鼠颅内感染模型中，agr系统对金葡菌的毒力调控具有重要作用。

关键词：颅内感染，金黄色葡萄球菌，agr系统，RNAIII，α溶血素

The accessory gene regulator (agr) controls Staphylococcus aureus virulence in a murine intracranial infection model

ABSTRACT

Objective The purpose of this study is to construct the murine intracranial infection model induced by S.aureus and investigate the role of agr system in this model.

Methods S.aureus cells were injected with a micro-syringe into the mice frontal cortex to construct the animal model. The mice of control group were injected sterile saline instead of S.aureus. After injection, the vital sign and survival rate of mice were observed to evaluate the infection. The rectal temperature was monitored. At 4 hours and 8 hours after injection, hemogram was determined. Brain tissues were observed for pathology study at 12 hours. Histological examination was used to diagnose the pathological alterations of mouse tissues. The sensitivity of S.aureus to whole blood was evaluated by whole-blood killing assay.

Results The mice in the model group demonstrated clinical signs of illness including hunched posture, lethargy, spasm and finally dead. The earliest time point of death is 12h. Compared with saline group, the 48-hour mortality was significantly higher in model group which were injected S.aureus 8325-4. Meanwhile, neutrophil granulocyte infiltration in brain tissue has been observed in model group. Although the number of white blood cells and the rectal temperature of mice were not significantly altered in model group, the percentage of neutrophil was significantly increased at the different time points after injection of S.aureus.

In murine intracranial infection model, it was showed that the mortality caused by the accessory gene regulator (agr) locus deficient strain was significant decreased compared with its parent strain. Moreover, we found that RNAIII, the effector of agr system, was essential for the intracranial infection caused by S.aureus. In the further investigation, it was showed that restoration the expression of α-toxin in agr deficient strain could partially recover the mortality in the murine intracranial infection model.

Conclusion Here, we have constructed the murine intracranial infection model induced by S.aureus. Our data suggested that the agr system of S.aureus is an important virulence determinant in the induction and mortality of intracranial infection in mice.

KEYWORDS intracranial infection,S.aureus, agr, RNAIII, α-toxin

中英文缩写词

缩略语英文全文中文全文

Tet tetracycline 四环素

Cm chloromycetin 氯霉素

Kana kanamycin 卡那霉素

DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯

EDTA ethylene diamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸

ddH2O distilled deionized water 双蒸去离子水

dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷

Cfu clonal formation unit 菌落形成单位

DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇

mol moles 摩尔数

OD optical density 光密度

PAGE polyacrylamide gel eletrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠

PBS phosphate-buffered solution 磷酸盐缓冲液

PCR polymerase chain reaction 多聚酶链式反应

r/min revolutions per minute 每分钟转速

TAE tris acetate-EDTA buffer 三(羟甲基)氨基甲烷醋酸

盐缓冲液

目录

前言 (1)

材料和方法 (3)

结果 (13)

讨论 (22)

结论 (25)

参考文献 (26)

文献综述 (30)

综述参考文献 (36)

致谢 (40)

攻读学位期间发表的学术论文 (41)

前言

在古代，人类就有了通过简单的外科手段治疗疾病的行为。三国时期的名医华佗发明了麻醉技术，对外科的进步产生了重大的影响，被誉为我国的外科鼻祖。然而感染却成为了阻碍外科发展的一个重要因素。在现代医学中，无菌操作和抗生素的使用非常有效地控制了感染，但是完全根除术后感染还是无法做到的，术后感染仍被临床医生们视为重要问题。同时科学家们也在积极的研究术后感染的致病机制，希望能够进一步控制其发生，并针对不同病因的感染制定更有效的治疗方案。

颅脑手术后的感染根据其发生部位可以分为中枢神经系统感染（如脑膜炎、脑脓肿等）和中枢神经系统之外的感染（如切口感染等）。术后中枢神经系统感染也称为颅内感染，是严重的医院感染，是开颅手术的常见并发症，其发生率为2.6%[1]。颅内感染一般是由化脓性细菌所导致的，常见的致病菌有葡萄球菌、脑膜炎双球菌、大肠杆菌、肺炎球菌、链球菌等。临床上导致颅内感染的途径有以下几种：①直接感染；②病灶感染；

③血行感染；④经由脑脊液通路所引起的感染。颅内化脓性感染在很多情况下发病迅速，病情严重，其死亡率高达19-43%[2]，再加上血脑屏障阻断了大多数抗菌药物的通过，使其在临床上的治疗存在很大难度。由于神经系统的功能在遭到损害后恢复比较困难，因此早期、正确地诊断与及时恰当的处置，是拯救病人的生命和保护其神经系统功能的关键所在，也是神经外科医师们关注的重要问题。

众多文献报道，金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是一种引起颅内感染的主要致病菌[3-7]。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种兼性厌氧的革兰氏阳性球状细菌，可以引起医院感染和社区获得性感染。金葡菌广泛存在于自然界中，如空气、土壤和水中，也存在于大部分人和动物的皮肤及其粘膜表面，如鼻孔、咽喉、腋窝、腹股沟和肠道中。金葡菌可以引起人和动物的多种化脓性疾病，80%以上的化脓性疾病由它引起，从常见的皮肤局部感染如小脓疱、疖、毛囊炎，到颅内感染、败血症等。目前临床上治疗金葡菌感染多联合使用多种抗生素，但是其治疗效果并不理想，相反这种治疗方法可能很大程度加速了金葡菌株耐药性的出现。在自然界适者生存的环境中，产生耐药性的细菌得以生存，并且一代一代地将自己的各种耐药基因传递下去，最终产生了超级细菌

——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MASA）。MASA感染的治疗非常困难，原因就是它拥有对多种抗生素的耐药性，这可能使普通的感染发展成无药可治的绝症。目前万古霉素是已知的唯一对MASA有一定治疗效果的抗生素，但随着万古霉素的广泛使用，已经出现了耐万古霉素的MASA，这也是由万古霉素的滥用而突变产生的。耐万古霉素的MASA已成为临床上十分恐怖的杀手之一。因此必须在临床上酌情使用万古霉素的同时，把更多的精力放在金葡菌感染的致病机制及其调控因素的研究上，以便发现新的预防措施和治疗方法，从而将金葡菌对人类的危害降低到最小。

金黄色葡萄球菌中的RNAIII分子是调控其毒力表达的关键分子，长约514nt，可以调控金葡菌很多外毒素和表面蛋白的表达[8]。在几乎所有的金葡菌临床分离株中，RNAIII分子都有不同程度的表达，研究表明它可以通过影响多个毒力相关基因，参与调控金黄色葡萄球菌的致病性。在动物实验中把RNAIII 分子突变之后，金葡菌对动物的侵袭感染能力也明显降低[9-10]。RNAIII由agr系统编码并调控。agr系统，即附属基因调节因子，是金黄色葡萄球菌中重要的双原件调控系统，许多毒力因子的表达都受到它的调控，例如溶血素、丝氨酸蛋白酶、肠毒素等[11-13]。agr系统的激活由其自身编码的肽诱导，从而对许多附属的胞外蛋白和胞质蛋白基因具有重要的调控作用。国外学者最新的研究发现，RNAIII不仅可以通过与毒素mRNA的作用直接参与其调控，而且可能通过调节上游调控蛋白的表达间接地参与某些毒力因子的调控[14-15]。金葡菌的毒力调控系统是错综复杂且相互关联的，但是不可否认，RNAIII在其中是一颗耀眼的明星分子。

细菌的外毒素是指在细菌的生长和繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物。外毒素在金葡菌感染中起到非常关键的作用，包括溶血素、肠毒素等。在众多的金葡菌外毒素中，α溶血素是极其重要的一种，它的表达由RNAIII调控。α溶血素是一种打孔毒素，可以导致溶血反应和组织损伤。最新研究表明，在金葡菌感染中，α溶血素可能通过与其受体ADAM10相互作用来加重感染进程[16]。

本研究拟建立一种小鼠金黄色葡萄球菌颅内感染模型，并研究agr系统在本模型中对金葡菌毒力的调控作用。以期有助于金葡菌颅内感染的致病机制研究，为临床上制定颅内感染的控制措施和治疗方案提供依据。

材料和方法

1.细胞细菌的准备

在脑心浸液（BHI）培养基中37℃震荡培养过夜的金葡菌，划线接种于血琼脂平板培养基，24h后挑取单个菌落至5mlBHI培养基中，37℃震荡培养过夜。离心收取1ml

菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，用1ml无菌生理盐水重悬菌体。用紫外分光光度仪测OD600吸光值，然后将菌液稀释至1×109CFU/ml。我们实验中质粒构建时转化的最初受体是金葡菌菌株RN4220，它是由菌株8325-4的一个限制性内切酶系统缺陷衍生而来的。在不加特殊说明的情况下，所有金葡菌菌株的培养基为BHI（Brain Heart Infusion Broth）培养基。细菌的培养温度为37℃，为了保证充分的氧气供应，液体培养基培养的菌液是在摇动状态下生长的，转速为每分钟220转。实验中所有的大肠杆菌用LB培养基（Luria Bertani, Oxoid）培养。本实验中用到的细菌菌株如表1中所示。

胶质瘤U251细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。U251细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基置于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。DH5α感受态大肠杆菌购自TaKaRa公司，用BHI培养基于37℃，200r/min摇床培养。

表1. 菌株和质粒

Strain or plasmid Comments Source or reference

Strain

S. aureus

8325-4 Wild-type, rsbU-17

18

RN6390 Laboratory virulent strain derived

from 8325

RN6911 RN6390 with an agr mutation, tet R18

RN6911-hla RN6911 restoring hla activity, cmr R This study

19

?RNAIII Restriction-negative strain, 8325

derivative, kan R

19

?RNAIII-R?RNAIII restoring RNAIII activity

cmr R

E. coli

DH5α A host strain for cloning Transgene

2.主要工具酶及试剂配制

BHI 培养基：BHI37g，溶解于蒸馏水并定容至1L，高压灭菌。

LB培养基：酵母提取物10g，胰蛋白胨5g 和NaCl 10g，溶解于蒸馏水并定容至

1L，高压灭菌。

Kana＋BHI琼脂平板：BHI37g，琼脂粉15g，溶解于蒸馏水并定容至1L，高压灭菌。使用前微波炉加热融化，待冷却至50℃左右加入Kana＋至终浓度40μg/ml。混匀后倒在无菌的平皿中，冷却后放于4℃备用。

Kana＋培养基：高压灭菌的LB培养基中加入Kana＋至终浓度40μg/ml。

1×PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4溶解于蒸馏水，调pH值至7.4 并定容至1L，高压灭菌。

柠檬酸缓冲液：柠檬酸10.5g，磷酸氢二钠35.8g，调pH值至6.0，加蒸馏水定容到500mL。

Western Blot转膜缓冲液：2.9g Gly，5.8g Tris，0.37g SDS，溶解于800ml蒸馏水，搅拌溶解后加入200ml无水乙醇并定容至1L。

Western Blot 膜再生液：15g Gly，1g SDS，10ml Tween20，用800ml蒸馏水溶解，并用浓HCl调pH值至2.2，定容至1L。

Western Blot封闭液：5% 脱脂奶粉（体积比）溶解于PBS缓冲液中

5×SDS-PAGE loading buffer：250mM Tris-Cl（PH6.8），0.5M DTT，SDS10%，溴酚蓝0.5%，甘油50%。

6×DNA loading buffe：30mM EDTA，甘油36%，溴酚蓝0.05%

1×TAE:40mol/L Tris-Cl，20mol/L EDTA。

MOPS电泳缓冲液：MOPS 20mM（PH7.0），醋酸钠2mM，EDTA1mM（PH8.0）。

DEPC水：配置终浓度为0.1%DEPC的水, 放入高温烘烤（160℃，6h）的玻璃器皿然后经过高温蒸汽灭菌。

琼脂糖-甲醛凝胶:用MOPS缓冲液配置1%琼脂糖，微波炉加热至琼脂糖融化，加入1%甲醛，3%gold view。

琼脂糖凝胶:用TAE缓冲液配置1%琼脂糖，微波炉加热至琼脂糖融化，加入3%gold view。

血琼脂平板培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司，PCR试剂购自北京康润诚业生物科技有限公司，DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司，质粒提取试剂盒购自道普生物科技（北京）有限公司，其他工具酶及试剂：HiFi Taq酶、EcoR1酶、Xho1酶、T4 连接酶、lysostaphin、CN结合液、Wash buffer、10×HiFi Taq Buffer、dNTP、hla 5’primer、hla 3’primer、SolutionΙ、PMD-19T、感受态DH5α、Amp+抗性平板、resuspention buffer、lysis buffer、结合液、5×cut Buffer、胶溶解液、T4 连接buffer、四环素、无菌水、10%甘油。

3.主要仪器

江湾Ⅰ型立体定向器（第二军医大学）；HimacCR21 高速冷冻离心机（日本日立公司）；DF-D 恒流恒压电泳仪（北京东方仪器厂）；UV-120-02 紫外分光光度仪（日本岛津公司）；8823A-UV 紫外检测仪（北京新技术应用研究所）；洁净工作台（北京半导体设备一厂）；PYX-DHS-40×50 隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；PCR仪（东胜公司）；Western blot电泳仪及电泳槽（伯乐公司）；分析天平（德国赛多利斯公司）；Biofuge 22R 台式高速离心机（德国Heraeus）；HZQ-C 空气浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；电子温度计；血细胞分析仪；

4. 实验动物及分组

6-8周SPF级雌性C57BL/6J小鼠购自维通利华公司，根据随机分组法分为实验组和对照组（n=52）。小鼠分笼饲养于相互隔离的稳定环境中，室温25℃，保证所有小鼠自由充足的进食饮水。本实验中对小鼠的饲养和相关实验操作都严格按照中华人民共和国卫生部发布的实验动物管理条例进行。实验设计已被北京基础医学研究所实验动物管理使用委员会批准（BMS-130112）。为了减轻小鼠在实验过程中所受的痛苦，我们尽了最大努力在实验操作过程中动作尽量轻柔并且尽可能地降低使用小鼠的数量。

5. 颅内感染模型的制作

C57BL/6J小鼠用1%戊巴比妥钠（3-5 mg/100g）腹腔注射麻醉。小鼠麻醉后，用脑立体定向仪固定其头部，定位额叶颅骨穿刺点并做好标记，穿刺点位置选在前囟向前

1mm再向矢状线右侧旁开1mm处[20]。用酒精棉球消毒标记处头部皮肤和毛发，持清洁的50μl微量进样器吸取5μl准备好的菌液（5×106CFU），于穿刺点垂直进针，进针深度大约2mm。缓慢地注入菌液，等待两秒后小心地拔出针头，以确保细菌进入了脑组织。对照组小鼠用相同方法注射等量的无菌生理盐水。整个手术过程在5min内完成，造模结束后将小鼠放置在干净温暖的环境中。待小鼠复苏后，将其放置在室温并给予自由进食饮水。观察复苏后小鼠临床症状，观察出现死亡的时间及48小时存活率。

6. 小鼠肛温的测量

在接种细菌前测定小鼠基础肛温，然后分别测定接种细菌后5h、7.5h、10h、12.5h、15h的小鼠肛温。测量肛温时将小鼠固定，待其安静后，在电子温度计末端涂少许石蜡油起到润滑作用，缓慢地将温度计插入小鼠肛门约2cm，这时电子体温计的显示屏会显示温度变化，等待数秒直到温度计读数稳定并发出提示音，读取屏幕数值。在测量过程中尽量动作轻柔，这样可以保持小鼠镇静，避免其他因素对小鼠体温的影响。

7. 脑组织病理学检测

接种细菌12h后各组随机取2只小鼠断头处死，迅速开颅暴露脑组织并剥离，将脑组织置于10%中性福尔马林溶液固定24h。冠状切面取材，使穿刺针孔处包含在取材范围内。梯度乙醇处理12h，二甲苯浸泡2h，65℃石蜡浸泡4h，包埋制成蜡块。取5μm

石蜡切片进行HE染色。HE染色步骤：脱蜡：二甲苯Ⅰ脱蜡10min左右；二甲苯ⅡⅢ脱蜡5min左右；无水酒精（乙醇）Ⅰ洗去二甲苯1min；无水酒精（乙醇）Ⅱ洗去二甲苯1min；95%酒精1min；85%酒精1min；自来水洗片刻。染色：苏木素染色1-5min左右；自来水洗片刻；1%或0.5%或0.25%盐酸水分化3-5s；自来水洗，温水蓝化片刻；伊红酒精染液浸染20s-2min。脱水、透明、封固：85%的酒精脱水20s；95%的酒精1min；

无水酒精Ⅰ染1-2min；无水酒精Ⅱ染2min；二甲苯Ⅰ浸泡2min ；二甲苯Ⅱ浸泡2min；树胶封片。

8. 小鼠外周血血细胞分析

在造模前和造模后4h、8h分别取小鼠外周血做血细胞分析。我们采用的是断尾取血法，首先固定小鼠，将小鼠尾部浸泡在40℃水浴30s，这样可以充分促进尾部的血液循环。然后用酒精棉擦拭尾部末端，剪去末端的1-2mm组织。用移液器小心地收集20μl 血液，置于事先装有稀释液的EP管中，血细胞分析仪检测。

9. pOS1-hla-flag构建

pOS1-hla-flag构建流程图如下：

HiFi-PCR 8325基因组中的hla小片段

zhi ku quan 20150721

胶回收hla小片段

双酶切hla小片段和pOS1质粒

连接hla小片段和pOS1片段

转化DH5α

9.1：从金黄色葡萄球菌8325中PCR钓取hla基因

金葡菌8325基因组提取：

①从血平板上挑金葡菌8325单克隆于无抗BHI培养基，过夜培养；

②10000r/min离心1min收菌；用300ul ddH2O重悬细菌，加5ul lysostaphin 37℃摇床

培养30min；

③加CN结合液，室温放置5min，然后13000r/min离心10min；

④将上清转移到收集管中，13000r/min离心1min；

⑤600ul Wash buffer洗涤收集管两次，每次13000r/min离心1min；然后13000r/min

空转2min；

⑥超静台吹干5min去掉多余乙醇；

⑦加50ul ddH2O于收集管中，室温静置1min，13000r/min离心1min。

25ul PCR体系：基因组模板2ul

10x Buffer 2.5ul

HiFi Taq酶0.25ul

dNTP 0.5ul

zhi ku quan 20150721

hla 5’primer 0.5ul

hla 3’primer 0.5ul

ddH2O 18.75ul

9.2：胶回收hla小片段

①100V电泳15-20min，紫外线下切胶，称重；

②加3倍体积胶溶解液，56℃水浴，直到胶完全溶解；

③将胶溶解液转移到收集管中，13000r/min离心1min；

④600ul Wash buffer洗涤收集管两次，每次13000r/min离心1min；然后13000r/min

空转2min；

⑤超静台吹干5min去掉多余乙醇；

⑤加50ul ddH2O于收集管中，室温静置1min，13000r/min离心1min。

9.3：构建pOS1-hla-flag

双酶切hla和pOS1-Flag质粒

50ul 双酶切体系：EcoR1 1ul

BmH1 1ul

10X Buffer 5ul

质粒约700ng

DdH2O up to 50ul

胶回收hla小片段和pOS1-Flag：

①100V电泳15-20min，紫外线下切胶，称重；

②加3倍体积胶溶解液，56℃水浴，直到胶完全溶解；

③将胶溶解液转移到收集管中，13000r/min离心1min；

④600ul Wash buffer洗涤收集管两次，每次13000r/min离心1min；然后13000r/min

zhi ku quan 20150721

空转2min；

⑤超静台吹干5min去掉多余乙醇；

⑥加50ul ddH2O于收集管中，室温静置1min，13000r/min离心1min。

连接hla与pOS1-Flag：

20ul 连接体系：T4 连接酶1ul

5X T4 连接buffer 2ul

hla片断：pOS1-Flag 3：1

ddH2O up to 20ul

冰水混合物上连接过夜。

转化pOS1-hla-flag于大肠杆菌感受态DH5α中：

①将5ul连接产物与50ul感受态细胞混匀，置于冰上30min；

②42℃热激60-90s，立即置于冰上，不能晃动2min；

③加700ul 无抗LB培养基，37℃摇床培养1h；

④5000r/min离心5min，去掉一部分培养基，用剩余的培养基重悬细菌，并涂于Amp+

抗性平板上，37℃温箱倒置培养16h。

提取pOS1-hla-flag质粒：

①取过夜菌1ml，13000r/min离心1min收菌，250ul resuspention buffer（已加入

RNaseA）重悬细菌并充分混匀；

②加250ul lysis buffer，上下轻柔混匀6-10下，室温静置2-4min至溶液透亮；

③加Neutralization buffer 400ul，上下轻柔混匀6-10下，室温静置5min，13000r/min

离心10min；

④将试剂盒中的spin column安置于collection tube上，加入column preparation buffer，

13000r/min离心1min，弃滤液；

zhi ku quan 20150721

⑤将上清转移到处理过的收集管中，13000r/min离心1min；

⑥将500ul的protein remove buffer加入收集管中，13000r/min离心1min，弃滤液；

⑦600ul Wash buffer洗涤收集管两次，每次13000r/min离心1min；然后13000r/min

空转2min；

⑧超静台吹干5min去掉多余乙醇；

⑨加50ul ddH2O于收集管中，室温静置1min，13000r/min离心1min。

9.4：转化pOS1-hla-flag于金葡菌6911中

①转化pOS1-hla-flag于DH5α中；

②菌落PCR鉴定pOS1-hla-flag；

③提取质粒pOS1-hla-flag；

④电转化pOS1-hla-flag于金葡菌4200中；

⑤提取质粒pOS1-hla-flag；

⑥电转化pOS1-hla-flag 于金葡菌6911中。

菌落PCR鉴定pOS1-hla-flag：

25ul PCR体系：细菌模板10ul

10x Buffer 2.5ul

Taq酶0.25ul

dNTP 0.5ul

hla 5’primer 0.5ul

hla 3’primer 0.5ul

ddH2O 10.75ul

金葡菌感受态制备：

①从血平板上挑金葡菌6911单克隆于四环素抗性BHI培养基，过夜培养；

zhi ku quan 20150721

②1：100转接过夜菌于新鲜10ml BHI 培养基中，培养至OD=0.6；

③10000r/min离心1min收菌；

④无菌PBS洗涤细菌两次，4000r/min，离心10min。

④无菌水洗涤细菌两次，然后再用10%甘油洗涤两次。

⑤最后用10%甘油重悬细菌。

电转化pOS1-hla-flag于金葡菌6911和4200中：

①质粒pOS1-hla-flag20-30ul与感受态混匀；

②室温静置15-30min；

③将混合物移入电转杯中，电击一次（10wF，2.3V）；

④加1ml无抗BHI培养基洗涤电转杯，然后移入无菌Ep管中；

⑤37℃摇床培养1h；

⑥5000r/min离心5min，去掉一部分培养基，用剩余的培养基重悬细菌，并涂于Cm+

抗性平板上，37℃温箱倒置培养16h。

10.全血杀伤实验：

过夜菌用紫外分光光度仪检测OD600 吸光值，调整至10 OD，1：100 转接于新鲜的BHI 培养基中，放置37℃震动培养6h，6000 r/min离心5min，收取1ml 菌体，用无菌PBS 洗涤两次，用1ml无菌PBS重悬，测OD600吸光值后将细菌稀释至4×105CFU/ml，取25μl 菌液与75μl 新鲜的鼠血或人血（加肝素或柠檬酸钠等抗凝剂）混合，摇床中37℃震动培养4h。稀释涂板（TSA 或THA），37℃培养12h，计数。

https://www.sodocs.net/doc/a59064569.html,K-8法检测细菌外分泌蛋白毒力：

①接菌：从血平板上挑取RN6911、RN6390B、RN6911-hla单克隆至无菌试管，BHI培

养基中37℃震动培养过夜；

②收菌：取1mL过夜菌10000r/min离心5min，取上清至另一清洁的EP管中；

③细胞种板：培养状态良好的U251细胞计数并稀释后，种至96孔板中，

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1×104/well,100uL/well；

④过滤上清：用一次性无菌滤器将上清在超净台内滤至无菌EP管中；

⑤分别向所种的细胞中加入RN6911、RN6390B、RN6911-hla细菌上清1uL，每种上清

做三个平行孔，同时将部分细菌上清通过60度40min中煮沸后（煮沸后去除沉淀）同样加至细胞中1uL，三个平行孔，空白孔只有细胞，另外BHI培养基做对照组；

⑥观察细胞形态变化；

⑦24h后加入CCK-8，每孔7uL，2h后通过酶联仪读值，波长450nm

12. 统计学方法

本研究中的所有实验都进行过重复实验。实验数据表示为平均值±SEM（标准误差），组间比较用t检验，P值小于0.05时为差异具有统计学意义。我们使用软件GraphPad Prizm 5对各项实验结果进行统计学分析。

结果

1.小鼠颅内感染模型的建立

1.1 临床症状和生存率对比

实验组小鼠在麻醉复苏后，先后出现运动减少、反应迟钝、身体蜷缩和抽搐等症状，但是体温没有明显升高（图1）。出现死亡的最早时间是接种细菌后12h，48h内生存率为26.9%（图2）。对照组均无上述症状出现，无死亡。

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图1. 颅内注射金葡菌8325-4后不同时间点( 0h，5h，7.5h，10h，12.5h，15h)，测量小鼠肛温。（n=9）

图2. 两组小鼠颅内分别注射金葡菌8325-4和生理盐水，记录死亡数并绘制生存曲线。（n=52）

金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片 金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。 目录 简介 流行病学 引发病症 球菌检验 球菌控制 感染处理 限量存在 简介 金黄色葡萄球菌细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密，染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色，相反，阴性菌没有细胞壁结构，所以紫色被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色。金黄色葡萄球菌与青霉素的发现有很大的渊源。当年弗莱明就是在他的金黄色葡萄球菌的培养皿中发现有些球菌被杀死了，于是发现了青霉素。而研究也表明青霉素只对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌作用明显。这也是由肽聚糖层的厚度和结构造成的。新出现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，被称作超级细菌，几乎能抵抗人类现在所有的药物，但是万古霉素可以对付它。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm 左右，显微镜下排列成葡萄串状。

显微图像 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。 流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不密封，运输过程中受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：

金黄色葡萄球菌检测方法

金黄色葡萄球菌检测方 法 Revised as of 23 November 2020

金黄色葡萄球菌检测方法 1.纸片法 目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。 技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。 技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。 此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。使目视效果下降，导致计数偏低。 2.免疫学方法 各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。 免疫学方法包括下面两个部分： （1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。毒素抗体优势在于敏感度高，易于检查，缺点毒素种类多，检测其中几种不具有普遍性。毒素分离工艺复杂，要得到纯毒素成本比较高。 （2）免疫学方法技术分析：上述免疫学技术应用最多的是酶联免疫技术和胶体金侧向层析技术。酶联免疫技术广泛应用于实验室检测，由于一次可以检测多个样本，此技术多用于体外诊断，目前也广泛用于食品安全。胶体金技术由于操作简单，检测适度快等优势，在食品安全领域广泛用于现场快速检测。 基于免疫学方法的技术主要分为：酶联免疫技术、胶体金侧向层析技术、免疫荧光技术、免疫沉淀技术、乳胶凝集技术、免疫磁珠技术。 3.分子生物学方法 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：肠毒素、血浆凝固酶、溶血素、杀白细胞素、表皮溶解毒素、毒性体克综合重量毒素I 等。而这些致病因子基因的鉴定(包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多

农药常识之农药的毒性毒力药效

农药的毒性、毒力、药效 在使用农药时，必然要遇到毒性、毒力、药效三个问题。三者的含义不同，但又是经常容易被混淆的问题。 (一)毒性是指药剂对人、畜等的毒害程度。我国现行对农药毒性测定是用纯药原药或制剂在大白鼠、小白鼠、兔、狗等试验动物身上测定，分急性毒性和慢性毒性两种。 1.急性毒性是指药剂经皮肤或经口、经呼吸道一次性进入动物体内较大剂量，在短时间内引起急性中毒。 农药毒性分级标准是以农药对大白鼠“致死量”表示，目前国内外通常用“致死中量”或叫半数致死量(LD50)表示。致死中量是指毒死半数受试动物剂量的对数平均数，即每千克(公斤)体重的动物所需药物的毫克数，记作“mg/kg(毫克/千克)”。LD50愈小，药物毒性愈大。根据我国《农药安全使用规定》，依致死中量分高毒、中等毒、低毒3种。高毒农药的使用范围有一定限制，国家有规定，使用时要遵守。 最小致死量(MLD)：即受试动物开始出现中毒症状而死亡的剂量； 全致死量(LD100)：指受试动物全部死亡所使用的最低剂量； 无作用剂量(NoEL)； 致死中浓度(LC50)：即在一定时间内受试动物死亡50%吸入剂量(毫克/立方米)； 耐药中量(TLM)：表示农药对鱼的毒性，一般用48小时内引起鱼半数死亡的浓度。标记为TLM48小时LC50(毫克/升)或用ppm(百分之一)； 致死中时间(LT50)：在一定条件下能杀死被试生物群体中一半数量所需的时间；

击倒中时间(KT50)：一定量药剂能击倒50%被试昆虫所需要的时间； 每日允许摄取量(ADI)：每天按人的体重(公斤)计算所能摄取的农药重量，在人的一生中不会造成对人体有害，单位mg/kg体重/天； 农药的半衰期：是指农药在某种条件下分解或消失一半所需的时间； 农药量最大容许残留量：供人类食用的农副产品中允许的农药最高限度的残留浓度。 2.慢性毒性是指供试动物在长期反复多次小剂量口服或接触一种农药后，经过一段时间累积到一定量所表现出的毒性。 无论急性或慢性中毒药剂均需要注意其是否有三致(致畸、致癌、致突变)作用。 致畸：引起动物畸形； 致癌：引起动物产生肿瘤； 致突变：引发遗传上的突然变异。 凡有三致作用的，均不能做农药使用。另外还有些农药对水生动物和鱼类、蜜蜂以及有益的天敌等有毒或二次中毒问题，使用时也要特别注意，或者忌用。 (二)毒力是指药剂本身对有害生物的毒害程度，多在室内人为控制条件下精密测定。 毒力的选择性亦很重要。所谓选择性，一般是指农药对虫、鼠的毒力强而对人、畜弱。选择性越强，毒力间差别越大，对人、畜威胁就越小，使用也越安全。但选择性也不宜过强，如果仅对几种病虫或几种鼠类有毒，则使用范围就会受到很大限制。

金黄色葡萄球菌的危害评估

金黄色葡萄球菌的危害评估 （一）一般情况：葡萄球菌感染是一组常见的细菌感染性疾病，包括皮肤软组织感染、中毒性休克综合征、败血症、心内膜炎、肺炎、肠炎、脑膜炎及骨髓炎等。在医院感染的致病菌中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureus，金葡萄)仅次于大肠杆菌，处于第二位。金葡菌感染常对多种抗菌药物耐药。金葡菌以其存在的普遍性、致病的多样性及对抗菌药物的耐药性，已成为细菌性感染的主要病原之一。金葡菌感染一般呈散发，但也可呈流行或爆发，后二者多为毒力较强的菌株引起。全年均可发生，以夏秋季发病较多。目前血浆凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative staphylococcus, CNS)感染有逐渐增多的趋势。皮肤软组织感染、食物中毒、尿路感染及骨髓炎等预后良好。败血症在有效药物处理下病死率仍高，约30%。脑膜炎中死亡者可达50%～60%。治疗早晚对肺炎患者的影响较大，在积极治疗下病死率为15%～20%，否则可达50%左右，幼儿和老年患者的预后较差。当前TSS的病死率约3%。到目前为止，人类还未研制出有效的疫苗。 （二）致病性：金葡菌能产生金黄色色素，血浆凝固酶阳性，能分解甘露醇，致病性强。金葡菌产生多种外毒素和酶，如α溶血毒素除引起溶血外，尚可损伤血小板、巨噬细胞和白细胞，使血管平滑肌收缩而导致局部组织缺血坏死；杀白细胞素能破坏白细胞和巨噬细胞；血浆凝固酶可使血浆中纤维蛋白沉积于菌体表面，从而阻止吞噬细胞的吞噬和杀灭作用，并有利于血栓形成；透明质酸酶可溶解组织

间质中的透明质酸，易于病菌扩散。此外，某些菌株可产生肠毒素(有A、B、C1、C2、D和E6种)、剥脱性毒素、溶纤维蛋白酶、过氧化氢酶、磷酸酶及溶脂酶等。金葡菌主要寄殖于鼻前庭粘膜、腋下、腹股沟及会阴部等处，偶也寄生于皮肤、肠道、阴道及口咽部等，人群带菌者相当普遍，在一般人群中约15%正常人鼻咽部带菌，医护人员带菌率约30%，免疫缺陷疾病患者中带菌率也高。入侵途径主要为受损伤的皮肤粘膜，也可因进食含肠毒素的食物，或吸入染菌尘埃而致病。病房中凡可引起尘埃飞扬的操作(如整理床铺)，均易导致葡萄球菌的传播。染菌手直接接触易感者为传播金葡菌感染的重要途径，空气传播等其他途径较少见。医院中较易发生金葡菌感染的为有创伤的外科和烧伤科患者，还有营养不良，免疫缺陷、恶性肿瘤、肺部疾患、糖尿病及尿毒症等疾病患者，以及新生儿和老年人等。农民、工人、儿童因受伤机会多而易患金葡菌感染。病后免疫力不强，可反复感染。（三）抵抗力：本菌广泛分布于自然界，存在于正常人皮肤、鼻咽部及肠道等部位，对外界抵抗力较强，加热80℃30分钟可杀灭。金葡菌产生的肠毒素为一组热稳定性单纯蛋白质，能耐受100℃30分钟加热不被破坏。

金黄色葡萄球菌的测定

金黄色葡萄球菌的测定 1 卫生学意义 金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。 2 检验方法 2.1 术语与定义 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。 2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：37℃～65℃。 （4）天平：感量0.1g。 （5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 （6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。 （7）无菌培养皿：直径90mm。 （8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.3 培养基和试剂 （1）7.5%氯化钠肉汤 1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4； 2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。 （2）B－P琼脂平板 1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.2 2）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。 3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每

农药常识之农药的毒性 毒力 药效

农药的毒性、毒力、药效在使用农药时，必然要遇到毒性、毒力、药效三个问题。三者的含义不同，但又是经常容易被混淆的问题。 (一)毒性是指药剂对人、畜等的毒害程度。我国现行对农药毒性测定是用纯药原药或制剂在大白鼠、小白鼠、兔、狗等试验动物身上测定，分急性毒性和慢性毒性两种。 1.急性毒性是指药剂经皮肤或经口、经呼吸道一次性进入动物体内较大剂量，在短时间内引起急性中毒。 农药毒性分级标准是以农药对大白鼠“致死量”表示，目前国内外通常用“致死中量”或叫半数致死量(LD50)表示。致死中量是指毒死半数受试动物剂量的对数平均数，即每千克(公斤)体重的动物所需药物的毫克数，记作“mg/kg(毫克/千克)”。LD50愈小，药物毒性愈大。根据我国《农药安全使用规定》，依致死中量分高毒、中等毒、低毒3种。高毒农药的使用范围有一定限制，国家有规定，使用时要遵守。 最小致死量(MLD)：即受试动物开始出现中毒症状而死亡的剂量； 全致死量(LD100)：指受试动物全部死亡所使用的最低剂量； 无作用剂量(NoEL)； 致死中浓度(LC50)：即在一定时间内受试动物死亡50%吸入剂量(毫克/立方米)； 耐药中量(TLM)：表示农药对鱼的毒性，一般用48小时内引起鱼半数死亡的浓度。标记为TLM48小时LC50(毫克/升)或用ppm(百分之一)； 致死中时间(LT50)：在一定条件下能杀死被试生物群体中一半数量所需的时间； 击倒中时间(KT50)：一定量药剂能击倒50%被试昆虫所需要的时间； 每日允许摄取量(ADI)：每天按人的体重(公斤)计算所能摄取的农药重量，在人的一生中不会造成对人体有害，单位mg/kg体重/天；

金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌 一、生物学性状 1、形态与染色 革兰阳性，球形，呈葡萄串状排列。无芽孢、无鞭毛，体外培养时一般不形成荚膜，少数菌株的细胞壁外层可见有荚膜样黏液物质。在某些化学物质（如青霉素）作用下，可裂解或变成L型。 2、培养特性 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，在普通培养基中，37℃生长良好。属内不同菌种可产生金黄色、白色或柠檬色等不同颜色的脂溶性色素并使菌落着色。致病性葡萄球菌菌落呈金黄色，于血琼脂平板上生长后，在菌落周围还可见完全透明溶血环（β溶血环）。 3、生化反应 多数菌株能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气。致病性菌株能分解甘露醇，产酸。触酶阳性，可与链球菌相区分。 4、抗原 （1）葡萄球菌A蛋白（SPA）：90%以上金黄色葡萄球菌细胞壁表面存在SPA 蛋白。在体内，SPA与IgG结合后所形成的复合物还具有抗吞噬、促细胞分裂、引起超敏反应、损伤血小板等多种生物活性。 （2）荚膜多糖：利于细菌黏附道细胞或生物合成材料表面（如生物性瓣膜、导管、人工关节等）。 （3）多糖抗原：具有群特异性，存在于细胞壁。金黄色葡萄球菌中可提出A群的多种抗原，其化学组成为磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺核糖醇残基。 5、抵抗力 葡萄球菌对外界理化因素的抵抗力较强。在干燥的脓汁或痰液中科存活2～3个月；加热60℃1小时或80℃30分钟才能将其杀死；耐盐，于100～150g/LNaCl 培养基中仍能繁殖。对青霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感，对链霉素中度敏感，对磺胺、氯霉素敏感性差。该菌易产生耐药性，对青霉素G的耐药菌株已达90%以上，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），已成为医院感染最常见的致病菌。耐药性的产生机制与细菌的质粒或与细菌细胞壁成分改变和合

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。它在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，它很容易就能够污染一些食物来源，从而引发疾病。特别是金黄色葡萄球菌肠毒素，它是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生。误食金葡菌污染的食品,可引起呕吐和腹泻等症状。因此，在本篇文献中，我们选取了关于金黄色葡萄球菌肠毒素的一部分内容进行了较为细致的思考。 文中提到，肠毒素能够引起人和哺乳动物肠胃道毒性反应。但是，金葡菌肠毒素同时也是一种典型的超级抗原。在免疫反应中，只需极微量，就能通过一种独特的机制，使之产生大量细胞因子和细胞毒性物质。从而抑制异常分裂的癌症细胞生长而可能起到治疗癌症的效果。 那么，肠毒素治疗肿瘤的机制是什么呢？ 首先，肠毒素是一种超级抗原。超抗原是一类只需极低浓度就能激活大量T细胞克隆或B细胞克隆、产生极强免疫效应的物质。它远超普通抗原的多克隆激活能力，可视其为具非特异性免疫原性但无免疫反应性的抗原。它在体内能够活化CD4 + T细胞，这种细胞能分泌多种细胞因子。它们不仅能够直接或间接地杀伤肿瘤细胞，而且可以增加肿瘤细胞表达MHC 抗原分子，增强肿瘤细胞刺激宿主免疫系统的能力; 另一方面，这些细胞因子又刺激T细胞进一步增殖分化，而增殖分化的T细胞又将产生更多的细胞因子与细胞毒作用，共同导致肿瘤细胞的破坏溶解，从而形成级联效应，达到对肿瘤的治疗作用。 除了对肿瘤的治疗作用，肠毒素在一定浓度和不同途径给予时，还具备着非特异性促进人和哺乳动物细胞的有丝分裂效果。特别是对损伤部位的组织有促进分裂和生长作用，能够致使损伤组织快速愈合。故有利于对损伤组织的治疗。但这种反应作用的机制我们小组尚且还无法解释，希望在之后的课程中能够有所启发。

实验七--食品中金黄色葡萄球菌的检验

实验七食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、实验目的要求 1、了解食品的质量与金黄色葡萄球菌检验的意义。 2、掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。 3、掌握金黄色葡萄球菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、掌握食品中金黄色葡萄球菌检验的方法和技术。 二、原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个制生理盐水 3、250ml三角瓶3个制培养基等 4、10×100mm试管6支血浆凝固酶试验 5、1ml移液管2支 6、10ml移液管 2 支 7、直径为90 mm平皿12套制血平板B-P平板 8、250ml量筒1支 （二）应灭菌的其它器材 剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量 （三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1.无菌水50ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 2.0.85%生理盐水70ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 3.0.85%生理盐225ml/瓶1瓶500ml三角瓶 4.7.5%NaCl肉汤50ml/瓶1瓶250ml三角瓶

【开题报告】金黄色葡萄球菌产肠毒素的研究

开题报告 食品质量与安全 金黄色葡萄球菌产肠毒素的研究 一、选题的背景与意义 金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）(以下简称金葡)是动物和人类化脓感染中最常见的病原菌，在自然界中分布广泛，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可能存在［8］，因而食品特别是牛奶及奶制品受其污染的机会很多。金葡菌最常见的污染是通过化脓性皮肤疾病、上呼吸道炎症、口腔内疾病的人，以及健康人咽喉和鼻腔内带菌，经与食物接触或者通过空气传播而污染食物，并在其中繁殖和产毒。金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶的数量，当金葡菌污染了含淀粉和水分较多的食品时，在温度等条件适宜时，经10小时左右即可产生相当数量的肠毒素，据估计，进食者吃下约100g的肠毒素A即可出现食物中毒的症状。因此食品和食品原料中污染有金葡菌就有可能产生肠毒素，就有食物中毒的潜在危险。葡萄球菌毒素（SE）是食物中毒最常见的原因之一，它引起的食物中毒症状主要是呕吐和腹泄，这些毒素蛋白质的结构主要为金葡菌的次生代谢产物。 虽然热处理可破坏葡萄球菌，但致病毒素对热稳定，可在热处理过程中保持甚至增加活性，100℃加热30分钟仍不失去其活性，因此金葡菌一旦污染了食品并在其中产生了肠毒素，用一般的烹调方法将活菌体灭活后，也不能将肠毒素破坏，必须加热100℃两小时才能破坏其毒性。而对于冷冻食品，由于其制作及保藏处于温状态，所以更易感染金葡菌。金葡菌肠毒素还有一种特点是对蛋白酶有耐性，在活性阶段可抗蛋白水解酶水解，故在水货道中也不易被破坏，因而食品极易被金葡菌污染极易引起食源性疾病的爆发。 金葡菌繁殖、是否产毒和产毒程度与食品的性质和组分密切相关，金葡菌污染食品后，如果被污染食品具备产毒条件时，就会产生肠毒素，对产品造成更进一步的污染，一般地，在PH6.0- 8.0、水分含量较多、蛋白质或者淀粉比较丰富的食品中，在温度等条件合适的情况下，该菌最容易繁殖并产生毒素，并且当氧分压较低时肠毒素较易形成，而冻虾仁具备金葡菌的繁殖和生产的主要条件。即使通过物理或者化学的方法将产口中的金葡菌完全灭活，但其中肠毒素仍不容易被破坏，因此产品也你存在肠毒素污染的危险。 如今，国内外贸易增多，国外食品和食品原料大量进入我国市场，检验局经常从进口的冷冻虾仁中检验出金葡菌，因此该产品也有存在金葡菌肠毒素的危险，而对于此肠毒素未做过相应的检测。因此研究冻虾仁中金葡菌和产生金葡菌肠毒素之间的关系，研究虾仁中金葡菌的产肠毒素条件，对于预示冷冻虾仁中是否有肠毒素，防止金葡菌产生肠毒素和改进虾仁后加工工序步骤有指导

金黄色葡萄球菌危害程度评估报告

金黄色葡萄球菌的危害程度评估报告 一、生物学特性 金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。 二、危害程度分类 根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。 三、致病性和感染剂量 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，有报道目前出现越来越多的耐药菌株，MRSA即耐甲氧西林金黄色葡萄球，菌致病性也随着变强。 四、暴露的潜在后果 暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员出现皮肤软组织感染、全身性感染、呼吸道感染、中毒、肠炎等。被感染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到治疗和控制。 五、感染途径 通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播。 六、微生物在环境中的稳定性 葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，而干燥可达数月，加热80℃30min才被杀死。5％石炭酸，0.1％升汞10～15min死亡。1:100000～1:200000龙胆紫溶液能抑制其生长。对磺胺增效剂、青霉素、红霉素等较敏感，但耐药株逐年增多，MRSA即为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 七、浓度和浓缩标本的容量

金黄色葡萄球菌及其检验

我们以SN标准中的最近似值(MPN)测定法来进行讲解： 这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色葡萄球菌。 1、样品制备： 固体或半固体食品: 以无菌操作称取25g样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液。 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成1:10样品匀液。 供计数检验时,可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。 2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1 mL稀释样品液，接种3管含10％氯化钠why?还记得么？金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。因此，这事实上是一种选择性的增菌。胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置36±1℃培养48 h。 3、用3 mm接种环,从有细菌生长的各管中移取1 环,划线接种于表面干燥的Baird- Parker琼脂平板,置36±1℃培养45～48h。 4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,移种到肉汤培养基中,置36±1℃培养20～24 h。 5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm×100mm试管内充分混合,置36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验{如耐热核酸酶试验等} 加以证实。 6、报告结果：根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表,报告金黄色葡萄球菌的MPN/g (mL)。 附：怎样在平板上进行细菌的划线分离。 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法

金黄色葡萄球菌感染的病因有哪些

如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 生活常识分享金黄色葡萄球菌感染的病因有哪些 导语：金黄色葡萄球菌感染是皮肤化脓性感染的最常见致病菌，也是四种最常见的医院获得性感染的病原之一。其传播方式在医院内部主要是经健康医务人 金黄色葡萄球菌感染是皮肤化脓性感染的最常见致病菌，也是四种最常见的医院获得性感染的病原之一。其传播方式在医院内部主要是经健康医务人员暂时寄居细菌的手进行传播，尤其是在新生儿童症监护病房(NICU)金葡菌是最常见的毒力最强的致病原。那么金黄色葡萄球菌感染的病因有哪些呢？看过下面的文章相信你就会明白。 金黄色葡萄球菌脑膜炎是指由金黄色葡萄球菌引起的脑膜炎，起病急，常有全身感染中毒症状，如畏寒、发热，伴持久而剧烈的头痛，颈强直较一般脑膜炎明显，除有脑膜炎症状外，尚有局部感染病灶，败血症患者还有其他迁徙性病灶，出现皮疹，如荨麻疹样、猩红热样皮疹或小脓疱疹，皮肤可见出血点，很少融合成片。 金黄色葡萄球菌引起的脑膜炎多继发于金葡菌败血症，尤其多见于合并左心内膜炎的患者，通过细菌栓子经血流侵袭脑膜。面部痈疖并发海绵窦血栓性静脉炎可进一步导致脑膜炎，颅脑损伤、颅脑手术后及腰椎穿刺时消毒不严也可并发脑膜炎。脑膜附近的感染病灶如中耳炎，乳突炎、鼻窦炎等亦可引起本病，新生儿脐带和皮肤的金葡菌感染也可继发脑膜炎，发病时间多在产后2周左右。 金黄色葡萄球菌感染的病因有哪些呢？上面的内容已经让我们知道了答案.为了您和家人的健康，如有发现类似感染的症状请及时就医，如果您还有什么需要咨询的请随时向我们提问，我们的专家24小时在线回答您的问题接军您的疑惑给您提供一个最佳的治疗方案，相信一定能给您满意的答复。

实验5 金黄色葡萄球菌的检验

实验5 金黄色葡萄球菌的检验 1 目的和要求 （1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法 （2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理 2 基本原理 金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。 3 实验材料 3.1 检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料 3.2 菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。 3.3 培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基 3.4 试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。 3.5 仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。 4 检样程序 5 操作步骤 5.1 5.1.1样品的处理

称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 5.1.2 增菌和分离培养 5.1.2.1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。 5.1.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 5.1.3 鉴定 5.1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。 5.1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1℃培养18 h～24 h。 取新鲜配臵兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，臵36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒臵时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ℃±1℃培养18 h～48 h，重复试验。 病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。 5.2 金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数 5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或臵盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 5.2.1.4 按5.2.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 5.2.2 样品的接种

金黄色葡萄球菌的检查

金黄色葡萄球菌的检查 同学们，这一节我们一起来学习一下第四章微生物限度检查法中的金黄色葡萄球菌的检查。 金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种。本菌在自然界分布甚广，空气、土壤、水和日常用具，人的皮肤。看，这就是金黄色葡萄球菌，它是一种革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。 该菌是葡萄球菌中致病力最强的一种，可经皮肤、粘膜侵入人体引起化脓性病变等局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。 所以，国家规定外用药品和一般滴眼剂、眼膏剂、软膏剂等规定不得检出金黄色葡萄球菌，检验金黄色葡萄球菌有重要意义。 金黄色葡萄球菌的操作流程如图所示，与之前讲述过的其他控制菌的检查一样： 在完成培养基的配制和供试品的处理后，用营养肉汤于30～35℃增菌培养18～24小时，必要时可延至48小时。增菌培养的目的使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。 接着，进行分离纯化，其目的是使被检菌从混合菌中分离出来。以接种环沾取以接种环沾取1～2环培养液，划

线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30～35℃培养24～72小时。 当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表中所列特征，可判为未检出金黄色葡萄球菌。 若供试品分离平板生长的菌落与表中所列特征相似疑似时，应选取2～3个以上菌落，分别接种于营养琼脂斜面上，于30～35℃培养18～24小时，取其培养物做以下检查。 1. 革兰染色镜检 革兰染色镜检观察显微镜下的细菌结构是否符合金黄色葡萄球菌的形态特征：金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，无荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列，菌体较小。 2. 血浆凝固酶试验 金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能将血浆里的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血浆凝固。

木糖葡萄球菌与金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌的基因组比较(阐述毒力、侵染性,样本是健康人的鼻腔)副本

LETTER TO THE EDITOR Genome of Staphylococcus xylosus and Comparison with S.aureus and S.epidermidis Staphylococci are Gram-positive,AT-rich cocci,and often stick together in grape-like clusters.The genus can be classi-?ed into two groups based on their ability to produce coagu-lase,an enzyme that causes clotting of blood plasma (Otto,2004).Coagulase-positive Staphylococci include Staphylo-coccus aureus ,a common pathogen of community-acquired and nosocomial infections (Smith et al.,2009).Their inva-siveness is associated with the ability to adhere to host sur-faces (Vuong et al.,2003).Among coagulase-negative Staphylococci (CNS),S.epidermidis is the most frequently found pathogen in humans,and is also a common cause of nosocomial infections (Nostro et al.,2007;Wang et al.,2009).S.epidermidis is believed to account for most of the infections caused by CNS and is highly resistant to many antibiotics including penicillins and cephalosporins (Al-Shuneigat et al.,2005).S.xylosus is also a CNS.It is naturally present in raw meat and milk and is commonly used in starter culture for fermentation (Planchon et al.,2006,2007).This species is normally regarded as non-pathogenic,but a few strains are related to human opportunistic infections (Akhaddar et al.,2010).In addition,some S.xylosus strains have the ability to form bio?lm (Planchon et al.,2006). Bacterial virulence genes can be regulated by diffusible signal molecules termed autoinducers (AIs).Because the control of gene expression by AIs is cell-density dependent,this phenomenon has been called quorum sensing (Brelles-Marino and Bedmar,2001;Antunes et al.,2010).In Staphy-lococci,there are two quorum sensing systems,P2and P3.Their regulatory mechanism was described earlier by Liu et al.(2012).Other regulatory genes and virulence factors shared by S.epidermidis and S.aureus have also been reported (Frebourg et al.,2000;Gelosia et al.,2001).However,it is still not clear whether these virulence related genes are also present in non-pathogenic S.xylosus genome. In this study,we isolated S.xylosus NJ from a nasal sample of a healthy person at Jiangsu People’s Hospital in China and determined its genome sequence using whole-genome shotgun sequencing strategy with a Hiseq2000(Illumina,CA,USA)sequencer.The project generated a total of w 2739Mb sequences and w 927folds coverage of the genome.The draft genome data were assembled using the Velvet assembly pro-gram.The assembly generated 45contigs with a size of >200bp,22of which were longer than 500bp with the N 50length of 396,400bp.These 45contigs were deposited in GenBank and annotated using Rapid Annotation using Sub-system Technology (RAST)server.In addition,96tandem repeat sequences were found in these contigs.The draft genome contained a chromosome of 2,940,053bp with a 32.40%G tC content.The general features are listed in Table 1.There are 6predicted rRNA genes and 22tRNA genes,and 83.64%nucleotides are predicted to encode proteins.By a combination of coding potential prediction and homology search,2783coding DNA sequences (CDSs)with an average length of 884bp were identi?ed on the draft genome (Table 1).The 2199CDSs annotated by speci?c Clusters of Orthologous Groups (COG)function groups can be classi?ed into 21COG categories,and 2456CDSs can be annotated into 1221KEGG orthology by KAAS (Moriya et al.,2007).The organization of the genome of S.xylosus NJ was shown in a circular map in Fig.1A.In addition,phylogenetic dendrogram based on a comparison of 16S rRNA sequences for S.xylosus NJ with members of the Staphylococcus was shown in Fig.S1.There is another S.xylosus draft genome,S.xylosus DMB3-Bh1,in GenBank.Therefore,we compared S.xylosus NJ with S.xylosus DMB3-Bh1using BLAST (version 2.2.26).The result showed that there are 2319CDSs in S.xylosus DMB3-Bh1(89.30%)similar to S.xylosus NJ (Fig.S2). The metabolic network of S.xylosus NJ was constructed using the RAST server with the 411subsystems identi?ed in the genome.There are many carbohydrate subsystem features,including genes involved in organic acids,fermentation,sugar alcohols,di-and oligo-saccharides,central carbohydrates,monosaccharides,and one-carbon metabolisms.Many protein metabolism features are also present,including protein biosynthesis machinery such as the small subunit (SSU)and large subunit (LSU)of the bacterial ribosome.Moreover,we prepared the comparative analysis of this genome with other staphylococcal genomes (S.aureus subsp.aureus N315( S. Available online at https://www.sodocs.net/doc/a59064569.html, ScienceDirect Journal of Genetics and Genomics 41(2014)413e 416 JGG 1673-8527/$-see front matter Copyright ó2014,Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,and Genetics Society of China.Published by Elsevier Limited and Science Press.All rights reserved.https://www.sodocs.net/doc/a59064569.html,/10.1016/j.jgg.2014.03.007