LAMP技术原理和引物设计

LAMP技术原理和引物设计

LAMP技术（Loop-mediated isothermal amplification），中文称

为环介导等温扩增技术，是一种于2000年由Eiken Chemical Co. Ltd.

日本公司开发的基于异十四链聚合酶反应（Bst聚合酶）的异源DNA快速

扩增技术。LAMP技术通过引物设计和反应条件的优化，实现在等温条件

下对目标DNA的高效扩增。下面将分别介绍LAMP技术的原理和引物设计。

LAMP技术的核心原理是通过酶的协同作用，在等温条件下进行DNA

的扩增。它利用一种特殊的DNA聚合酶（Bst聚合酶），能够在不需要高

温退火的情况下，具有高度特异性和高效率地进行DNA合成。LAMP技术

本身具有极高的扩增速度，优势在于其在等温下，不需要复杂的设备和严

格的实验条件，可以简化扩增过程。同时采用特殊设计的引物组合，能够

提高扩增特异性。

1.初始化反应：将反应体系中的DNA片段与引物（包括2个外端引物

和2个补体引物）结合；

2. 引物扩增：引物与Bst聚合酶作用，反应体系中的DNA得到扩增；

3.聚合物合成：一种特殊的引物结合到目标DNA的5'末端，通过内

端引物和内部位点进行扩增；

4.循环放大：扩增产物作为新的模板参与反应，进行连续循环扩增。

通过这种等温扩增的方法，LAMP技术可以在短时间内获得大量的目

标DNA，且具有很高的扩增特异性和灵敏度，可以用于分子生物学、诊断

医学和病原检测等领域。

引物设计：

引物设计是LAMP技术成功应用的重要因素之一、LAMP技术使用了4

个单链引物，包括2个外端引物（forward outer primer，F3和reverse outer primer，B3）和2个内端引物（forward inner primer，FIP和reverse inner primer，BIP）。

外端引物负责扩增DNA的初始段，内端引物负责扩增DNA的中间段。

在引物设计中，需要注意以下几个方面：

1.引物的特异性：要求引物能够有高度特异地结合到目标DNA的区域，确保扩增的目标是准确的；

2.引物的长度和碱基组成：引物的长度通常为20-24个碱基，碱基组

成要尽量避免重复序列和形成组内结构，以保证扩增效率和特异性；

3.引物的位置和方向：合理选择引物的位置和方向，以确保扩增产物

的特异性和有效性；

4.引物的浓度：引物的浓度需要进行优化，以获得最佳的扩增效果。

在引物设计的过程中，可以借助计算机软件进行模拟和分析，以提高

引物的特异性和效率。同时，根据具体的研究目的和实验条件，可以对引

物进行一定程度的修改和优化，以获得更好的扩增结果。

总结起来，LAMP技术的原理是通过酶的协同作用，在等温条件下进

行DNA的高效扩增；而引物设计是LAMP技术成功应用的关键因素，需要

考虑引物的特异性、长度和碱基组成、位置和方向等因素，以提高扩增的

特异性和效率。

LAMP技术原理和引物设计

LAMP原理及引物设计与实例 ．LAMP引物的设计 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同. B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 2．扩增原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 https://www.sodocs.net/doc/ac19240339.html,MP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产

lamp的工作原理

lamp的工作原理 LAMP是一种用于网站和Web应用程序开发的技术栈，它由 四个主要组成部分组成：Linux、Apache、MySQL和PHP。 本文将介绍LAMP的工作原理，包括每个组件的功能和它们 如何协同工作来构建和运行网站和Web应用程序。 LAMP的第一个组件是Linux操作系统。Linux是一种开源的、免费的操作系统，它提供了一个稳定而强大的基础来运行网站和Web应用程序。 Linux操作系统可以在各种硬件设备上运行，并提供了一套丰富的命令行工具来管理和配置系统。通过使用Linux操作系统，LAMP技术栈可以在各种平台上使用， 并且具有很高的灵活性和可移植性。 LAMP的第二个组件是Apache Web服务器。 Apache是一个 广泛使用的、开源的Web服务器软件，它可以接收来自客户 端的HTTP请求，并将请求的Web内容发送回客户端。Apache还支持许多功能，如虚拟主机配置、URL重写和安全 认证。通过配置Apache，开发人员可以将网站和Web应用程 序的文件和目录映射到特定的URL，并实现动态内容生成和 处理。Apache还支持PHP和MySQL的集成，使得LAMP技 术栈的组件可以无缝地协同工作。 LAMP的第三个组件是MySQL数据库。 MySQL是一种开源的、关系型数据库管理系统，它可以存储结构化数据，并提供高效的检索和管理功能。开发人员可以使用SQL语言来创建 和管理数据库，并使用MySQL与Web应用程序进行交互。 由于MySQL是跨平台的，可以在各种操作系统上运行，并具

有高可用性和可伸缩性，它成为了LAMP技术栈的首选数据库。 LAMP的第四个组件是PHP编程语言。 PHP是一种广泛使用的、开源的服务器端脚本语言，它可以用于创建动态网页和Web应用程序。 PHP可以与HTML混合使用，从而使开发人 员能够在网页中嵌入动态内容。 PHP还提供了许多内置的函 数和库，用于处理数据库和文件、生成图像和加密数据等任务。由于PHP是开源的，它具有很高的灵活性和可扩展性，可以 通过插件和扩展来增强其功能。 当使用LAMP技术栈开发网站或Web应用程序时，以下是基 本的工作流程： 1. 配置Linux操作系统：首先，需要安装和配置Linux操作系统。这包括选择合适的Linux发行版，如Ubuntu、Fedora或Debian，然后进行系统设置和网络配置。 2. 安装和配置Apache服务器：接下来，需要安装Apache服 务器，并进行必要的配置。这包括设置虚拟主机，指定文档根目录和访问权限，以及配置URL重写和其他扩展功能。 3. 安装和配置MySQL数据库：然后，需要安装MySQL数据库，并进行必要的配置。这包括创建数据库和用户，设置权限和安全性，以及配置数据库服务器参数。 4. 编写PHP代码：然后，通过编写PHP代码来创建网站或

LAMP技术原理和引物设计

LAMP技术原理和引物设计 LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）技术是一种基于等温扩增的核酸放大技术，具有高度特异性和灵敏度。其原理是通过一种酶体系，在恒温条件下，同时进行DNA链合成和DNA降解，实现靶DNA的指数级扩增。LAMP技术主要包括四个特点：温育，DNASA酶，硫酸镁和比色。 LAMP技术的核心引物设计包括首末引物、携带引物和环引物。首末引物是用于导向DNA合成的引物，具有特异性序列，可同时结合目标序列的两个扩增位点，使合成的DNA形成带环结构。携带引物则是用于携带首末引物，其中一个端通过末端退火与首末引物结合，另一个端通过内部部位退火与目标序列结合。环引物则是富含寡聚核苷酸，可与合成的DNA的循环结构结合，形成DNA环。 1.反应体系准备：将首末引物、携带引物、环引物、dNTPs（脱氧核苷三磷酸盐）、荧光素和DNASA酶等加入反应管中，并加入模板DNA。 2.反应液混合：充分混合反应液，使其均匀分布。 3.等温扩增：将反应管放入恒温水浴中进行等温扩增，通常温度为60-65摄氏度。 4.结果判断：观察扩增产物是否有荧光生成，可用裸眼观察或借助实时荧光PCR仪进行观测。同时，也可根据扩增产物的数量和大小来判断目标序列的存在与否。 1.高度特异性：通过引物的设计，能够实现对目标序列的高度特异性扩增，避免非特异性放大。

2.高灵敏度：引物结构的设计使得扩增产物形成大量的环结构，进一步促进扩增反应，提高灵敏度。 3.简易操作：LAMP技术无需特殊设备和复杂条件，只需常规实验室设备和简单的温度控制即可完成扩增反应。 4.短时间：由于不需要PCR步骤，LAMP技术的扩增反应时间一般在1-2小时内就可以完成。 5.可视化检测：扩增产物可以通过荧光素染料或草铁蓝等染料进行可视化检测，便于结果判断和数据分析。 总结起来，LAMP技术是一种快速、高效、特异性强和操作简便的核酸放大技术，引物的设计是实现该技术的关键。通过合理设计首末引物、携带引物和环引物，能够实现目标序列的高特异性扩增，并且能够进行可视化检测，广泛应用于生物医学领域。

LAMP

LAMP（环介导等温扩增）技术 2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩 增 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。 2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。 可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。 目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。详见：https://www.sodocs.net/doc/ac19240339.html,/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=1 1. 优缺点介绍： LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就

lamp

通用型RT-LAMP反应液试剂盒 使用说明书 1.产品编号：LR001 2.产品规格：25次 3.中文名：通用型RT-LAMP反应液试剂盒 4.技术背景： 环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。反应的过程主要分为循环扩增反应起始物的形成和循环扩增反应。其基本原理是采用4/6条特异引物和具有链置换功能的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行等温扩增。目前，该技术已经应用于人类及动植物细菌、真菌、寄生虫、病毒等病原体的快速检测。LAMP技术具有下面的优点： 1）在恒温的条件下实现核酸的扩增，不需要热循环仪； 2）特异性高，采用4/6条特异引物识别目的基因上的6/8个区域； 3）扩增速度快，效率高，可在30-60min内获得结果； 4）结果判定简单，无需电泳即可实现肉眼可见的扩增效果。 5.适用范围： 可用于一切与LAMP相关的快速RNA等温扩增技术。 6.组成及保存条件： 7.使用方法： 使用时，取17.6 μL RT-LAMP反应液，加入LAMP DNA 聚合酶、反转录酶、引物、模板，并加入无核酸酶H2O补足体积至25μL即可进行反应。 8.反应举例： 注意：以下举例多数情况下可供参考。实际反应条件因模板、引物等的不同而有所差异，应根据实际情况，设定最佳反应条件。 制备反应液：

融解RT-LAMP反应液，混匀，短暂离心。在反应管中加入以下组分： *：实验引物、模板自备，加入量根据实际引物、模板浓度确定。 如在反应管中加入SYBR Green Ⅰ1μL，可直接在荧光定量PCR仪中进行荧光定量检测。 等温扩增： 混匀，置于60～65℃保温30～90min，80℃10min灭活LAMP DNA 聚合酶，产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。 扩增产物的检测： 向扩增管中直接加入1μL的显色剂，混匀，观察颜色的变化，阳性样品变呈浅绿色，阴性样品仍为橙色。建议在黑色背景下观察。 另外，还有以下几种常用的检测方法： ?琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物5μL，1～2%的琼脂糖凝胶电泳，可见LAMP特征性电泳图谱。 ?荧光定量PCR检测。 ?根据反应生成的白色焦磷酸镁沉淀，直接用肉眼进行检测判断。 9.注意事项： 1）首次融解后轻轻混匀，然后适量分装，于-20℃保存，以避免多次反复冻融及造成污染。 2）引物设计对成功扩增十分关键。除用于SNP分型外，尽量以保守区 设计引物。引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物Floop/Bloop可以使反应速度大大提高。应优化引物序列，GC含量和尽量避免二级结构。反应中各个引物的浓度及比例对扩增的效果有一定的影响。3）LAMP扩增具有特异性强、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区（试剂准备区、标本制备区、反应区、分析区）、添加UNG和dUNG（可能导致反应效率下降）、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换。 4）反应管冷却至室温后开盖加入显色剂观察结果能有效避免反应产物外逸，建议反应结束后置室温冷却。5）严防操作环境、使用的容器耗材和试剂的RNase污染，所用器具与耗材需进行无RNase处理，操作过程中勤换手套。 6）本产品仅供科研使用。 10.保存条件： 所有试剂-20℃保存。 11.有效期：

LAMP技术原理和引物设计

LAMP技术原理和引物设计 LAMP技术（Loop-mediated isothermal amplification），中文称 为环介导等温扩增技术，是一种于2000年由Eiken Chemical Co. Ltd. 日本公司开发的基于异十四链聚合酶反应（Bst聚合酶）的异源DNA快速 扩增技术。LAMP技术通过引物设计和反应条件的优化，实现在等温条件 下对目标DNA的高效扩增。下面将分别介绍LAMP技术的原理和引物设计。 LAMP技术的核心原理是通过酶的协同作用，在等温条件下进行DNA 的扩增。它利用一种特殊的DNA聚合酶（Bst聚合酶），能够在不需要高 温退火的情况下，具有高度特异性和高效率地进行DNA合成。LAMP技术 本身具有极高的扩增速度，优势在于其在等温下，不需要复杂的设备和严 格的实验条件，可以简化扩增过程。同时采用特殊设计的引物组合，能够 提高扩增特异性。 1.初始化反应：将反应体系中的DNA片段与引物（包括2个外端引物 和2个补体引物）结合； 2. 引物扩增：引物与Bst聚合酶作用，反应体系中的DNA得到扩增； 3.聚合物合成：一种特殊的引物结合到目标DNA的5'末端，通过内 端引物和内部位点进行扩增； 4.循环放大：扩增产物作为新的模板参与反应，进行连续循环扩增。 通过这种等温扩增的方法，LAMP技术可以在短时间内获得大量的目 标DNA，且具有很高的扩增特异性和灵敏度，可以用于分子生物学、诊断 医学和病原检测等领域。 引物设计：

引物设计是LAMP技术成功应用的重要因素之一、LAMP技术使用了4 个单链引物，包括2个外端引物（forward outer primer，F3和reverse outer primer，B3）和2个内端引物（forward inner primer，FIP和reverse inner primer，BIP）。 外端引物负责扩增DNA的初始段，内端引物负责扩增DNA的中间段。 在引物设计中，需要注意以下几个方面： 1.引物的特异性：要求引物能够有高度特异地结合到目标DNA的区域，确保扩增的目标是准确的； 2.引物的长度和碱基组成：引物的长度通常为20-24个碱基，碱基组 成要尽量避免重复序列和形成组内结构，以保证扩增效率和特异性； 3.引物的位置和方向：合理选择引物的位置和方向，以确保扩增产物 的特异性和有效性； 4.引物的浓度：引物的浓度需要进行优化，以获得最佳的扩增效果。 在引物设计的过程中，可以借助计算机软件进行模拟和分析，以提高 引物的特异性和效率。同时，根据具体的研究目的和实验条件，可以对引 物进行一定程度的修改和优化，以获得更好的扩增结果。 总结起来，LAMP技术的原理是通过酶的协同作用，在等温条件下进 行DNA的高效扩增；而引物设计是LAMP技术成功应用的关键因素，需要 考虑引物的特异性、长度和碱基组成、位置和方向等因素，以提高扩增的 特异性和效率。

lamp环介导等温扩增技术

lamp环介导等温扩增技术 LAMP环介导等温扩增技术是一种用于检测DNA或RNA的方法，具有快速、高度敏感和特异性等优点。下面我们来详细介绍一下这种技术的原理和应用。 一、原理 LAMP技术是一种环介导等温扩增方法，与PCR不同的是，LAMP不需要高精度的温度控制和特异性引物，只需要4-6个引物就可扩增目标序列。LAMP反应的基本步骤为：首先，在等温条件下，外部引物（F3和B3）和内部引物（FIP和BIP）结合在DNA目标序列上，形成一个环形结构；然后，在BIP的3'端内部引物（LF和LB）的作用下，DNA目标序列不断的进行扩增，最终形成一个由数以百万计的拷贝构成的扩增产物。在反应中，LF和LB作为内部补体引物，增强了反应的特异性和扩增效率。 二、优点 1、高度敏感：在LAMP扩增反应中，由于不需要复杂的环境条件和反应体系，扩增过程高效，形成的扩增产物数量极多，可以检测到非常微弱的目标DNA或RNA信号。 2、特异性强：LAMP反应需要多个引物结合于目标序列，而且引物是从多个区域的序列中选择设计的，所以扩增的产物只会与目标序列高度特异结合，不会出现交叉反应的问题。 3、环境友好：LAMP扩增只需要一个热水浴，不需要PCR反应所需的高精密温控仪器，同时反应体系中不含有有毒有害的物质，对环境及实验者均无危害。

三、应用 LAMP技术已广泛应用于临床医学、食品安全、环境检测和生物技术等领域。 1、临床医学：LAMP技术可以高效、快速、准确地检测病原微生物、基因突变和药物耐药性等，对于疾病的快速诊断和精准治疗提供了有力支持。 2、食品安全：LAMP技术可以检测微生物、病毒和其他有害物质，对于食品安全监管起到了重要作用。 3、环境检测：LAMP技术可以应用于环境污染的检测、植物病害的检测以及水质检测。 4、生物技术：LAMP技术可以用于基因组学、遗传学和分子病理学等领域的基础科研。 总之，LAMP技术作为一种新兴的DNA或RNA检测技术，具有快速、高效、经济和特异性强等优点，已成为分子生物学和生命科学领域的焦点研究。

等温扩增原理

等温扩增原理 等温扩增（LAMP）是一种用于DNA的体外扩增技术，由Eiken Chemical Co. Ltd.的Notomi等人于2000年首次报道。相较于PCR技术，LAMP技术具有操作简便、成本低廉、扩增效率高等优点，因此在临床诊断、食品安全监测、环境微生物检测等领域得到了广泛的应用。 LAMP技术的原理基于异热核酸酶的作用，通过四种核酸酶的协同作用，在等温条件下扩增DNA。下面将详细介绍LAMP技术的原理及其特点。 1. 引物设计。 LAMP技术使用6个引物，包括两对外向引物（F3和B3）、内向环引物（FIP 和BIP）以及两个外向环引物（LF和LB）。这些引物能够在等温条件下特异性地识别目标DNA序列，并启动扩增反应。 2. 异热核酸酶的作用。 LAMP技术中使用的异热核酸酶具有多种酶活性，包括DNA依赖DNA聚合酶活性、融合酶活性和核酸内切酶活性。这些酶的协同作用使得LAMP技术在等温条件下能够高效地扩增目标DNA。 3. 扩增过程。 在LAMP技术中，引物结合到目标DNA上，形成环状结构，然后通过异热核酸酶的作用，进行DNA聚合反应，最终产生大量的扩增产物。这一过程在等温条件下进行，无需复杂的温度变化步骤，因此操作简便。 4. 特点及应用。

LAMP技术具有操作简便、扩增效率高、特异性强等特点，因此在临床诊断、食品安全监测、环境微生物检测等领域得到了广泛的应用。同时，LAMP技术还可以用于快速检测病原微生物、农作物病害和害虫等，具有重要的应用前景。 综上所述，LAMP技术是一种操作简便、成本低廉、扩增效率高的DNA扩增技术，其原理基于异热核酸酶的作用，在等温条件下进行。由于其独特的优势，LAMP技术在临床诊断、食品安全监测、环境微生物检测等领域有着广泛的应用前景。随着技术的不断发展，LAMP技术将在更多领域展现出其重要的应用价值。

lamp实验流程

lamp实验流程 lamp实验流程是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因转录的调控机制。LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种在等温条件下进行核酸扩增的方法。下面将详细介绍LAMP实验的流程。 一、实验前的准备工作： 1. 准备实验所需的试剂和材料，包括引物、引物探针、模板DNA、核酸扩增酶等。 2. 根据实验需要，设计引物和引物探针，并进行合成或购买。 3. 清洁实验台面、仪器设备和试剂瓶，消毒操作区域，确保实验环境的洁净。 4. 使用无菌工艺准备试剂和培养基。 二、核酸提取： 1. 根据实验样品的特性，选择适宜的核酸提取方法，并按照该方法进行提取操作。 2. 根据实验需要，将提取的核酸溶解在合适的溶解液中，得到模板DNA。 三、LAMP引物设计与合成： 1. 根据需要扩增的目标序列，使用生物信息学软件进行引物序列的设计。 2. 根据引物设计结果，对引物进行合成或购买。 四、LAMP反应体系的准备：

1. 准备一份LAMP反应体系通用配方：主反应液（包括模板DNA、引物和引物探针）、聚合酶酶液、酶活化缓冲液等。 2. 根据实验需要，调整反应体系中各组分的浓度和比例。 五、LAMP反应条件的优化： 1. 通过对不同反应条件（如温度、时间等）的优化，确定最佳的LAMP反应条件。 2. 进行LAMP反应条件优化的方法包括逐步检测法、一次性试管法、电泳法等。 六、LAMP反应的操作步骤： 1. 在无菌条件下，将LAMP反应组份依次加入反应管中，轻轻混匀。 2. 将反应管放入恒温培养箱中，在合适的温度下进行反应。 3. 根据实验需要，可以选择观察反应体系中荧光信号、浓度变化、反应时间等指标。 七、LAMP产物的分析： 1. 从LAMP反应体系中取出反应产物，可以进行多种分析方法，如电泳分析、比色法、荧光实时PCR等。 2. 根据分析结果，判断LAMP反应是否成功，检测目标序列的扩增情况。 八、实验结果的分析与验证： 1. 根据LAMP反应的结果，分析目标序列的扩增情况，判断目标基因的表达水

lamp引物设计原则

lamp引物设计原则 LAMP引物设计是快速测定体外或者体内某类特定微生物的基因序列和数量的方法。它是通过构建重复序列检测（Loop-mediated isothermal amplification），利用特定的引物对特定序列进行适应温度条件的扩增，从而迅速反应特定的微生物的基因序列标志物。因此LAMP引物的设计是一个关键。 LAMP引物设计的基本原则是确保布雷克体（Balaureate）的精确性和密度。布雷克体必须精准地对应到所研究的目标物，并且每个布雷克体在聚合酶体系统中的比例必须保持一定的程度，以确保引物交联有效。此外，布雷克体也必须满足其他标准，例如，GC含量高于50％，最大高于70％；碱基序列中引发扩增最大应当是锡调序列；布雷克体大小（20～25个碱基）适合于LAMP反应，以避免太多的自结构化；引物温度Tm应该在60～65℃，以提高其渗透反应活性；该引物的碱基序列中，最坏的拓扑结构必须被避免，如死角、完成二聚体、死角、活动簇等；引物内的自结合应当是最低的，关联酶的活性是自结合低活性的前提；引物不应含有重复序列；引物标准形式及义项要求；引物末端锌离子结合站。 要满足这些标准，需要在设计引物时确保设计规则严格有效。一般来说，根据LAMP 引物设计要求，引物设计应具备以下几方面：一是确保布雷克体的表达，二是建立高GC 含量的布雷克体序列，三是对每个布雷克体碱基序列和拓扑结构进行优化，四是控制锡离子结合站站点的位置，五是控制Tm温度，以及在前后游离靶序列中确保高渗透性。但是除此之外，专家还建议有步骤尽量增加探针的保守性，及减少重复序列，避免一次检测多种不相干的特征的可能性。

实验丨LAMP荧光探针方案最佳伴侣,非FEN1莫属!

LAMP荧光探针方案最佳伴侣，非FEN1莫属! 环介导等温扩增(LAMP) 技术是一种在恒温条件下进行的DNA扩增技术之一，具有高灵敏度、扩增快速等优点，结合微流控技术和多种终点检测手段方案，在医学诊断、生物安全、农业和环境监测等领域都有广泛的应用前景。 但基于LAMP扩增技术需要精准检测，还是荧光探针法更为合适，目前市面产品，某些厂商推出的主要基于Taqman探针法，而殊不知Bst DNA Polymerase具有极强的链置换功能，即便是具有5’端外切功能的Bst DNA Polymerase,LF也是会先推起退火上去的探针，而先非切割，导致荧光信号曲线不能真实反映扩增过程，所以导致LAMP扩增跑胶结果与荧光曲线表现大相径庭。 那么我们思考发现探针退火模板后，被Bst DNA Polymerase遇到推起，但在那一瞬间会形成一个瓣状结构flap，另一方面FEN1正好具有切割5’flap的酶学功能，这两者之间似乎可以联系在一起。接下来的一些实验和理论依据更加佐证了这两者具有极高的匹配度。 1.热稳定性实验结果表明，FEN1在65℃下具有最高活性(Table 1) Table 1. 不同温度下FEN1活性 TEMPERATURE ACTIVITY% 25°C< 1 % 37°C< 5 % 45°C20 % 50°C50 % 60°C90 % 65°C100 % 70℃95 % 2.我们再基于扩增引物设计探针，后续扩增过程中Bst DNA Polymerase就会遇到已形成二级结构的引物 型探针，将其推起形成5’flap结构不就可以被FEN1直接切割，从而发出荧光(Fig. 1)。 Fig. 1 LAMP结合FEN1荧光探针检测原理示意图

LAMP技术原理和引物设计

LAMP技术原理和引物设计 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因 3'端的F3c、F2c和Flc区以及5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点 设计4种引物。 FIP(ForwardInnerPrimer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5'端的Flc区域序 列相同。 F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3区组成，并与 靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5'端的Blc 区域序列相同. B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。 2．扩增原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动 态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依 靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基 配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序 列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下

向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出 完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的 Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为 模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状 结构的单链。迅速以3'末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA 合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c 区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速 以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产 物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。https://www.sodocs.net/doc/ac19240339.html,MP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只 需要水浴锅即可，产 物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增 只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊 的试剂及仪器。 (2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成的时间损失．核酸扩增在lh内均可完成，添加环状引物后时间可 以节省1／2，多数情况在20。30rain均可检测到扩增产物。且产物可以 扩增至109倍，达0.5mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。

思路丨LAMP 等温扩增技术常见问题总结

思路丨LAMP 等温扩增技术常见问题总结 Q1：LAMP有哪些特点？ ●仅需一种酶Bst DNA Polymerase参与； ●恒温60-65℃，30-60 min完成扩增反应； ●灵敏度高，比传统的PCR高2～5个数量级； ●操作的简便性及对仪器设备和人员要求低。 Q2：LAMP扩增引物如何设计？ Fig 1. 扩增引物设计位置示意图 设计要点： ●引物区域之间的距离： F2和B2的5'端之间的距离为120-180 bp； F2和F3以及B2和B3之间的距离是0-20 bp； 环形区域（F2的5'端到F1的3'端，B2的5'端到B1的3'端）的距离为40-60 bp。 ●引物区域Tm值： 富含GC和常规的引物Tm值为60-65°C； 富含AT 的引物Tm值为55-60°C。 ●GC含量： 在富含GC或通常区段一般为50-60%； 在富含AT区段一般为40-50%。 ●3'端避免富含AT，以避免二级结构形成。

Q3：LAMP的环引物LF或LB有什么作用？ 环引物可以结合环区域，增强扩增效率。据实验结果表明，使用环引物扩增所需的时间仅是 不使用环引物的三分之一到二分之一，可在30 min内实现扩增。 Q4：如何对RNA进行RT-LAMP检测？ 可以通过在反应体系中添加适量的逆转录酶，巨匠生物已推出耐高温逆转录酶二代（A TG#R111），耐受72℃，利于复杂长链RNA在高温下打开二级结构，进行高效逆转录。 Q5：为什么做LAMP实验经常会有假阳性产生？如何避免？ ●同一区域移液高拷贝（10^6 copies/μl 或更高）的模板，则可能会发生污染； ●由于灵敏度过高，导致引物试剂在容易污染的环境下反复开盖，极易污染气溶胶后，产 生假阳性； ●样本制备区/试剂准备区/加样区/反应区等尽可能做到分区； ●每次试验前后或者步骤之间对空气和工作区以及移液器，要用核酸清除剂或10%漂白 剂消毒清除气溶胶污染； ●引物设计设计多套作为备选，通过实验测试挑选最佳引物组。 Q6：SNP可以用LAMP法区分嘛？ 可以。可结合RNase HII（A TG#E207）酶学功能，以LF或LB为基础，在SNP位点设计MB荧光探针: /FAM/DNA-rN-DNA/Dab/，通过荧光信号检测，高灵敏度区分WT和MT。 Q7：LAMP有些哪些产物检测方式 琼脂糖凝胶电泳；荧光探针检测；核酸染料可视化显色。 Q8：LAMP荧光探针法检测是否有较好的方案？ 由于Bst DNA polymerase具有较强的链置换活性，经实验测试发现，一般Taqman探针适配

裂口pcr原理 -回复

裂口pcr原理-回复 裂口PCR（LAMP-PCR）是近年来被广泛应用于遗传学与分子医学研究领域的一项基因扩增技术。它是由糖核苷酸酶酶链式反应（LAMP）和聚合酶链式反应（PCR）相结合而形成的一种高效快速的DNA扩增技术。该技术的原理相对复杂，本文将逐步介绍裂口PCR的原理，并剖析其步骤与应用。 裂口PCR的原理是在DNA扩增的过程中，引入糖核苷酸酶的聚合酶链式反应，使PCR中的目标序列更加灵敏和特异性。糖核苷酸酶通过将核酸酶切割DNA模板，形成一条断开的DNA链，从而使聚合酶链式反应失去进一步扩增的能力。裂口PCR的基本原理如下所述： 1.引物设计 裂口PCR引物的设计是整个实验的关键步骤之一。引物需要选择在目标序列上保有特异性且能产生张力，引起荧光信号。此外，引物序列应避免目标序列中存在多个相邻的DNA碱基，以确保酶链断裂。 2.反应体系准备 将裂口PCR反应所需的试剂准备好，包括引物、PCR缓冲液、DNA模板和聚合酶等。缓冲液的组成应能提供合适的pH值和离子强度，以保证反应在最佳条件下进行。同时，聚合酶必须具备较高的热稳定性和扩增效率。

3.扩增反应进行 将反应体系置于加热的PCR仪中，进行多次循环的加热和降温处理，以实现DNA序列的扩增。裂口PCR一般包括两个主要的过程：首先是LAMP 过程，其次是链断裂过程。LAMP过程通过引物与DNA模板的特异性酶链反应产生大量的复制产物。而在链断裂过程中，糖核苷酸酶会在一定程度上将DNA链切割，并形成短的DNA片段。这种链断裂的现象将糖核苷酸酶链由碱基很好的表现出来。 4.结果分析 完成PCR扩增后，对反应产物进行分析。可以利用电泳技术将产物进行分离和检测。同时，通过应用特定的荧光染料与反应体系相结合，可以实现实时的监测与记录。 裂口PCR技术的优势在于其高效快速的DNA扩增特性和较低的检测限度。该技术能够在短时间内获得大量的DNA产物，且能够使用极低浓度的DNA模板进行扩增。此外，裂口PCR也可以应用于复杂样品中的稀有DNA检测。因此，该技术在临床和科研中具有广泛的应用前景。 总结来说，裂口PCR技术通过引入糖核苷酸酶酶链切割反应增加了PCR 扩增的特异性和敏感性。通过精确的引物设计和合适的反应条件，裂口PCR能够在短时间内获得大量的特异性DNA产物，从而为遗传学和分子

lamp等温扩增技术原理

lamp等温扩增技术原理 LAMP等温扩增技术是一种高灵敏度的基于序列特异性寡核苷酸探针的新型核酸检测方法，由于其极高的灵敏度、特异性和快速性，广 泛应用于疾病的诊断与研究中。该技术的原理可以分为以下步骤：第一步：沙门氏菌DNA引物的特异性结合并扩增 LAMP等温扩增技术采用一组详细的引物设计，使其具有高度特异性，能够在目标核酸序列的正常条件下，加速酶间反应来扩增目标序列。针对沙门氏菌的DNA扩增，引物组成为2个反向外部引物、2个内部引物和一个环引物。反向外部引物的特异性结合在目标DNA序列的 外侧，内部引物则在外部引物结合后依次将产物扩增。环引物在推进 反向内外部引物的条件下，促进并加速扩增反应的进行。该技术最大 的优势在于，即使非特异性的DNA序列存在，也能在反应系统中抑制 它们的扩增，从而提高扩增产物的特异性。 第二步：单管内扩增反应 LAMP等温扩增技术在单个反应管中完成扩增，因此省去了扩增过程中由于分离和清洗产物所需的步骤，从而能够提高扩增的效率。同时，该技术利用因特异性扩增反应而产生的大量产物来实现放大反应 信号。由于其不需要复杂的设备，仅需要水槽温度控制器和能够给温 度控制提供稳定电源的仪器即可完成。整个扩增过程中，所有反应物 成分的变化均与恒定温度下运行。 第三步：利用Dye负电荷的反应性质 由于在反应中引物的选取和调额完全根据目标DNA的序列比对所 进行，因此LAMP等温扩增技术具有绝对的特异性。同时，其采用的是 特殊的Dye（反应染色），具有负电荷和荧光反应性质，在在反应完成后，在阳性结果的情况下，消耗成本非常低。而在负性结果的情况下，由于该Dye信号使读取结果清晰方便。由此，LAMP等温扩增技术结果 得到广泛的应用，例如疾病的检测、环保检测等领域，得到了广泛应用。

lamp扩增原理

lamp扩增原理 LAMP扩增原理 LAMP是一种用于DNA扩增的方法，它的全称是Loop-mediated isothermal amplification，即环介导等温扩增。与PCR（聚合酶链式反应）相比，LAMP具有更高的扩增效率和更好的特异性，因为它只需要一个酶（Bst DNA polymerase）和四个特异性的引物来进行扩增。本文将介绍LAMP的扩增原理及其基本步骤。 一、LAMP的扩增原理 LAMP的扩增原理是通过“环式扩增”来实现的，其基本过程可以分为两个阶段：第一阶段是DNA的线性扩增，第二阶段是DNA的环式扩增。LAMP的基本原理如下： 1. 首先，一组称为F3和B3的特异引物与DNA靶标结合，形成一个F3/B3复合物。该复合物在特定的温度下，通过Bst DNA polymerase的催化作用，进行线性扩增。在该过程中，F3引物与B3引物结合的区域就会形成一个双链DNA结构，该结构具有一个单股环形DNA的结构，称为“DNA花环”。 2. 在第一阶段完成后，第二组引物（FIP和BIP）与F3/B3复合物结合，即形成FIP/F3/B3/BIP的四元复合物。在特定的温度下，FIP 引物与BIP引物结合的区域就会形成一个新的DNA花环结构，这

个花环嵌套在第一阶段的DNA花环中。这个过程被称为“环式扩增”，在这个过程中，产生大量的DNA产物。 3. 在LAMP反应结束时，可以通过如凝胶电泳、荧光探针或颜色指示剂等多种方法来检测扩增产物。 二、LAMP的基本步骤 LAMP的基本步骤包括：制备反应体系、扩增反应、检测扩增产物等。 1. 制备反应体系 LAMP反应需要一个含有DNA靶标、Bst DNA polymerase、四组引物（F3、B3、FIP、BIP）和一些缓冲剂的反应体系。反应体系的配制需要考虑到反应的温度、pH值等因素。 2. 扩增反应 将反应体系加热到适当的温度，通常为60-65℃，进行扩增反应。反应时间通常为1-2小时。 3. 检测扩增产物 可以通过如凝胶电泳、荧光探针或颜色指示剂等多种方法来检测扩增产物。其中，颜色指示剂是最常用的方法之一。如果扩增产物存