同型半胱氨酸酶法和色谱法

同型半胱氨酸酶法和色谱法

同型半胱氨酸的检测方法主要有两种，分别是酶法和色谱法。

1.酶法：氧化型的Hcy被还原为游离Hcy，游离的Hcy 在Hcy-甲基转移酶催化下与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)反应生成甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），SAH被SAH-水解酶水解形成腺苷和Hcy，形成的Hcy进入Hcy-甲基转移酶催化的转化反应，形成循环反应，这个循环反应导致了检测信号的明显放大，形成的腺苷立即脱氢转化为次黄苷和氨，氨进一步在谷氨酸脱氢酶催化下和NADH反应，将NADH转变为NAD+。在340nm处检测NADH减少造成的吸光度下降量与样品中同型半胱氨酸的浓度成比例。

2.色谱法：高效液相色谱法(HPLC)是测定血中Hcy的水平的方法。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同，因此流动相将其洗脱下来的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物质分开，以荧光检测器检测洗脱下Hcy-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品／内标的比值进行比较和计算，就可以测定血中Hcy的水平。

血液中同型半胱氨酸的检测及意义讲述讲解

血液中同型半胱氨酸的检测及意义 由于同型半胱氨酸检测技术的发展，对其研究逐渐深入，近年来的研究表明同型半胱氨酸可以作为判断心务管疾病危险性的独立指标，并认为与传统的指标相比，同型半胱氨酸具有更高的应用价值。本文综述了同型半胱氨酸的测定方法和临床意义。 1 同型半胱氨酸的代谢过程 人体内同型半胱氨酸作为蛋氨酸代谢的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成。蛋氨酸分子含有S甲基；在与ATP作用生成S腺苷蛋氨酸后，可通过各种转甲基作用为体内已知的约50多种具有重要生理活性的物质提供甲基。S腺苷蛋氨酸在甲基转移酶作用下将甲基转移至另一物质后，生成S腺苷同型半胱氨酸，后者进一步脱去腺苷，生成同型半胱氨酸。而同型半胱氨酸则可通过N5甲基四氢叶酸转甲基酶（EC1.1.1.68）及其辅酶维生素B12的催化作用，接受N5甲基四氢叶酸提供的甲基，重新生成蛋氨酸。而此过程又是已知的体内能利用N5甲基四氢叶酸的唯一反应。故同型半胱氨酸与体内一碳单位代谢有着密切关系。另外，同型半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶（EC4.2.1.22）催化下也可与丝氨酸缩合生成胱硫醚，后者近一步生成半胱氨酸和α酮丁酸。 2 影响同型半胱氨酸水平的因素 血浆中的同型半胱氨酸约70%与白蛋白结合，为结合型。其余的游离型则主要以二硫同型半胱氨酸和以二硫键结合的同型半胱氨酸-半胱氨酸化合物形式存在，只有少量以还原型同型半胱氨酸存在于血浆中。我们通常所指的是总的同型半胱氨酸浓度。 影响同型半胱氨酸水平最主要的因素莫过于遗传与食物营养缺乏。遗传因素主要包括N5甲基四氢叶酸转甲基酶及胱硫醚-β-合成酶的基因发生突变，引起酶的活性降低，从而导致高同型半胱氨酸血症。现在已经证明N5甲基四氢叶酸转甲基酶的缺陷，在体内叶酸缺乏的情况下，可以引起同型半胱氨酸浓度的明显升高。而根据Mudd等的研究，由遗传缺陷引起的胱硫醚-β-合成酶的活性降低，可导致血浆中同型半胱氨酸的浓度超过正常值的十倍左右。 对近1200名老人的研究表明，体内同型半胱氨酸的水平与饮食有着密切的关系，血浆中维生素B6、B12和叶酸的浓度越低，其同型半胱氨酸的浓度越高。由于动物蛋白中蛋氨酸的含量比植物蛋白约高三倍左右，可以产生较多的同型半胱氨酸，因此可对人体的动脉组织造成损伤。 其它因素包括性别、年龄、肾功能的损害、以及服用影响叶酸和B族维生素的药物，都可影响同型半胱氨酸的水平。尤其是肾功的损害，会严重影响那些含硫氨基酸的排出，因为肾小

hcy综述资料

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法） 综述资料 1、产品的预期用途： 1.1产品的预期用途 同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）用于定量测定人体血清或血浆中同型半胱氨酸的含量。 1.2与预期用途相关的临床适应症背景情况 同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）又称高半胱氨酸，是蛋氨酸去甲基后形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物。有关其代谢紊乱的报道最早来源于先天性胱硫醚合成酶缺乏导致出现同型半胱氨酸尿患者的观察。此后，又相继发现其他几种参与HCY代谢的酶或辅酶改变所引起的代谢紊乱。近几年来，随着测定技术方法的改进，已经能够对正常人血浆中以各种形式存在的HCY进行测定，并且发现在心、脑及外周血管疾病、慢性肾功能不全、牛皮癣、维生素B12缺乏等疾病的患者中存在HCY的代谢紊乱。对同型半胱氨酸的研究始于20世纪70年代，1969年首次提出高同型半胱氨酸血症可致动脉粥样硬化并可形成血栓后，人们逐渐发现人体血清中同型半胱氨酸的含量与冠心病、脑血管疾病、外周血管疾病和静脉血栓的发生和发展有着密切的关系，而且随着同型半胱氨酸含量的增加发生血管疾病的危险也呈递增趋势。 高同型半胱氨酸通过氧自由基介导引起血管内皮损伤，不同浓度的血清Hcy还可通过抑制内皮细胞DNA的合成，影响内皮功能及细胞形态改变，并促使血管平滑肌细胞增殖，导致动脉粥样硬化。血清Hcy可使血小板受损，使血小板的黏附性和聚集性增加。血清HCy尚能改变花生四烯酸代谢，使血栓素A2合成增加，血栓素A2具有收缩血管和促血小板聚集的作用。血清Hcy还通过抑制凝血酶调节蛋白在内皮细胞表面的表达及活性，进一步抑制蛋白C的激活，影响凝血酶的灭活。血清Hcy还能增加组织因子的活性，激活凝血酶，导致血管系统的血栓少形成。 目前越来越多的资料显示Hcy与脑血管病有着紧密的联系。甚至有人认为Hcy水平升高是脑血管病的一项独立危险因素和重要危险因子。研究分析表明，随着血浆Hcy水平的增高，患缺血性脑血管病的相对危险度逐渐增加，与非Hcy患者相比，Hcy患者患缺血性脑血管病相对危险度增加。此外，研究还发现，不论是缺血性脑血管病患者，还

同型半胱氨酸

同型半胱氨酸的代谢及测定 1. 代谢过程 同型半胱氨酸：又称为高半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)，是甲硫氨酸的中间代谢产物，在体内由甲硫氨酸转甲基后生成。有两种去路，一是Hcy 可在胱硫醚缩合酶(CBS)和胱硫醚酶的催化下生成半胱氨酸，需要维生素B6的参与，或经巯基氧化结合生成高胱氨酸，另外Hcy还可在叶酸和维生素B12的辅助作用下再甲基化重新合成甲硫氨酸，此过程需甲硫氨酸合成酶(MS)的催化，并且必须有N5-甲基四氢叶酸作为甲基的供体，后者是四氢叶酸经5，10-甲烯四氢叶酸还原酶(MTHFR)催化而产生。 2. 存在形式及测定 高半胱氨酸在体内主要以还原型、胱氨酸(氧化型)、高半胱氨酸-高半胱氨酸及高半胱氨酸-胱氨酸二硫化物混合氧化型等形式存在，在血浆中有游离和蛋白结合体两种，前者占20%，后者与清蛋白结合，占70%～80%，所有统称为总Hcy。有人发现不同情况下游离形式和蛋白结合体可重新分布，较高的温度或储存时间较长，则高半胱氨酸迅速与蛋白结合，而游离体含量很少。血液离体后红细胞仍可不断地释放Hcy到细胞外液中，因此一般研究均以测定血浆标本为主，并且采血后应及时分离测定或冰冻。Hcy 测定过去曾用氨基酸分析仪测定，比较复杂且不稳定，八十年代开始应用高压液相色谱技术(HPLC)检测，质控稳定，应用广泛。Hcy的正常参考值随测定方法和种族人群的不同而有所不同，一般正常空腹血浆总Hcy水平为5～15μmol/L。 3. 影响因素 (1)性别和年龄：血浆总高半胱氨酸水平存在男女性别差异，可能与雌激素调节Hcy的代谢有关，研究发现女性的水平低于男性。Jacobsen等人应用HPLC检测健康男性血浆总Hcy水平为9.26±1.88μmol/L，女性水平为7.85±2.29μmol/L。绝经前女性水平(8.9±1.0μmol/L)低于绝经后女性水平(10.2±2.5μmol/L)，因此有人认为绝经前女性较低的同型半胱氨酸水平为防止动脉粥样硬化和心血管疾病的预防因素之一。年龄越大其高半胱氨酸水平越高。 (2)饮食和药物：高动物蛋白饮食中甲硫氨酸含量较高，摄入过多易引起Hcy水平升高，蔬菜和水果中叶酸和维生素B含量高，往往有助于降低Hcy水平。药物中如长期口服避孕药的女性易致维生素B6缺乏，氨甲喋呤、三乙酸氮尿苷等抗肿瘤药物由于抑制叶酸代谢可引起同型半胱氨酸水平升高，而青霉胺可降低血浆Hcy水平。

同型半胱氨酸的检测及临床意义

同型半胱氨酸的检测及临床意义 一、同型半胱氨酸 同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）是一种人体内的含硫氨基酸，为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，部分以同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物存在，微量以还原型同型半胱氨酸存在，大部分通过二硫键与白蛋白结合而存在。 大量对Hcy的研究表明Hcy是心脑血管疾病的独立危险因素，危险度随着浓度的升高而增加。Boushey等的研究结果显示，血浆总Hcy水平每升高5umol/L，相当于胆固醇升高500umol/L。伴有血浆Hcy升高(>10umol/L)的原发性高血压定义为H型高血压。 二、影响血液Hcy水平的因素 1、遗传因素： C667T点突变可引起Hcy升高。CBS基因多态性。蛋氨酸合成酶基因多态性。 2、性别与年龄： 国内外不少研究发现，Hcy随年龄增长而升高，而且男性>女性。女性在绝经前的水平较低，绝经后显著升高，认为其机制可能与雌激素水平的变化有关。 3、营养因素： ①VitB6、VitB12、叶酸等Hcy代谢辅酶摄入不足时，则Hcy升高。 ②饮酒：长期饮酒可引起肝细胞蛋氨酸合成酶活性下降，从而造成Hcy血症。 ③饮食中蛋氨酸过高：有报道认为高动物蛋白饮食可能是Hcy血症的危险因素之一。 三、同型半胱氨酸致病机理 1、内皮毒性作用。 2、刺激血管平滑肌细胞增生。 3、致血栓作用：Hcy可促进血栓调节因子的表达，激活C蛋白和凝血因子Ⅻ、Ⅴ，血小板内前列腺素合成增加，从而促进血小板粘附和聚集。 4、脂肪、糖、蛋白代谢紊乱：Hcy可促进脂质沉积于动脉壁，泡沫细胞增加，还可改变动脉壁糖蛋白分子纤维化结构，促进斑块钙化。 5、干扰谷胱甘肽的合成：谷胱甘肽是一种重要的高氧化剂，它能防止很多细胞成分的氧化互相作用，对血管产生保护作用。Hcy干扰谷胱甘肽的合成，从而对机体造成危害。

血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义

血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义 摘要同型半胱氨酸是人体内含硫氨基酸的一个重要的代谢中间产物，可能是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的一个独立危险因子。血浆中同型半胱氨酸含量与遗传因素、营养因素、雌激素水平、年龄因素等有关，与同型半胱氨酸代谢有关的N5N10-亚甲基四氢叶酸还原酶和胱硫醚-β-合成酶的基因突变，酶活性下降，也可引起高同型半胱氨酸血症。同型半胱氨酸的测定方法有：气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法（HPLC）、全自动的荧光偏振免疫测定（Fluorescence polarization immunoassay FPIA）、高效毛细管电泳法。HPLC最常用，而高效毛细血管电泳最有发展前途。 同型半胱氨酸（homocysteine, hCY）是一种人体内的含硫氨基酸，为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成。近年来，国内外许多学者均认为血液同型半胱氨酸含量升高已成为动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子，遂成为基础医学和临床医学研究的新热点。本文综述血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义。 1 同型半胱氨酸的代谢过程 1.1 人体内同型半胱氨酸是蛋氨酸脱甲基后的产物，蛋氨酸是重要的“一碳单位”供体，蛋氨酸在S-腺苷蛋氨酸合成酶崔化下与ATP结合生成S-腺苷蛋酸（SAM），SAM在供出甲基后，水解生成同型半胱氨酸和腺苷。相反，体内的同型半胱氨酸在蛋氨酸合成酶的作用下，以维生素B12为辅助因子，接受N5-甲基四氢叶酸携带的甲基，再形成蛋氨酸。此反应必须有N5-甲基叶酸作为甲基的供体，N5-甲基四氨叶酸是四氢叶酸经N5N10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methyleneterahydrofolatereductase mTHFR）催化而产生的。同型半胱氨酸另一代谢途径是在胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-beta-synthase cBS）催化下，与丝氨酸缩合成胱硫醚。因此，血浆同型半胱氨酸浓度的升高与遗传因素和营养因素有关，MTHFR和CBS基因发生突变，导致酶活性降低，产生高同型半胱氨酸血症。 1.2 人MTHFR基因定位在lp36.3上，cDNA全长约 2.2kb，大鼠的MTHFR基因的cDNA 与人MTHFR基因有85％同源性。人MTHFR基因有多个等位基因，经流行病学分析，纯合子与高同型半胱氨酸血症之间呈现很强相关性。Frosst等应用PCR-SSCP分析证明MTHFR 基因在667位发生的突变与心血管疾病密切相关。由于T代替了C，编码的氨基酸已由缬氨酸代替了丙氨酸，而缬氨酸可能与MTHFR活性中心密切相关，MTHFR酶活性大大降低。 1.3 CBS是一个63kD均一四聚体蛋白，定位于染色体21q2 2.3，可编码551个氨基酸，目前已鉴定出33个突变位点，与心血管疾病可能有关的是位于287密码子T283c，由编码的异亮氨酸代替了苏氨酸。另一个突变位点为307密码子上的G919A，由编码的甘氨酸取代丝氨酸。CBS这两个位点的突变均可使CBS酶活性降低，发生高同型半胱氨酸血症。 2 血液中的同型半胱氨酸 2.1 由于氨基酸分析仪器的灵敏度限制，过去一般认为血液中不存在同型半胱氨酸。Wicken等首先报道，男性血浆中同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物总量为 3.3±0.8μmol/L，女性为2.4±0.7μmol/L，男性显著高于女性。他们使用磺基水杨酸沉淀蛋白质，层析用离子交换柱，氨基酸分析仪进行测定。还发现，血浆同型半胱氨酸水平受雌激素水平、高脂饮食、维生素B12。叶酸缺乏、年龄等因素的影响较大。 2.2 wu等发现正常人和高同型半胱氨酸血症患者血浆中，同型半胱氨酸大部分是与蛋白质结合，可达70％，血浆中与同型半胱氨酸结合的蛋白是白蛋白。动物试验和人体试验表明，半胱氨酸不能取代同型半胱氨酸在血浆白蛋白上的结合位点，可能原因是同型半胱氨酸有更大的亲和力。同型半氨酸在血液中的存在方式是，部分以同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫

同型半胱氨酸

同型半胱氨酸 别称同型半胱氨酸中文名高半胱氨酸 1化学性质高半胱氨酸，或称为同型半胱氨酸或同半胱氨酸，是氨基酸半 胱氨酸的异种，在旁链部份硫醇基（-SH）前包含一个额外的亚甲基（-CH2-）。 高半胱氨酸的额外亚甲基使硫醇基更接近羧基，令它能起动化学反应形成一个五元环，称为高半胱氨酸硫内酯。当氨基酸正常地与它的毗邻形成一个肽键就 会产生这种反应。高半胱氨酸所以是不适合与蛋白质混合，这是因含有高半胱氨 酸的蛋白质会自行分解。 高半胱氨酸是从S-腺苷基蛋氨酸透过两个反应步骤途径形成，并能回转成蛋氨酸，或经过转硫途径而回转为半胱氨酸或牛磺酸。虽然高半胱氨酸可以回转 为半胱氨酸，但没有证据显示人类直接食用高半胱氨酸会转化为半胱氨酸。[1] 2生化机制1969 年Mccully 从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检 中发现, 其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化（AS）的病理表 现，由此提出高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia,HHCY）可导致 动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。此后，各国学者对HCY 与心脑血管疾病

的相关关系做了大量研究。Hcy 是一种含巯基的氨基酸，主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。在体内，约1/2 的Hcy 和甲基四氢叶酸在蛋氨酸合成酶（Methionine Synthase reductase,MS）的作用下，生成蛋氨酸和四氢叶酸，四氢叶酸在N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶 （Methylenetetralydrofolate,MTHFR）的作用下生成甲基四氢叶酸；其余约 1/2 的Hcy 通过转硫基途径，即Hcy 与丝氨酸在胱硫醚β合成酶（Cystathionineβ-synthase,CBS）作用下形成胱硫醚，一部分在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸，最后生成丙酮酸、硫酸和水，此过程需维生素B6为辅酶及丝氨酸羟甲基转移酶，另一部分则生成同型丝氨酸。任何原因引起前两条代谢途径障碍时，升高的Hcy 在氨基酰-tRNA合成酶的作用下，生成同型半胱氨酸硫内酯（homocysteine thiolactone,HTL），HTL 是Hcy 在氨基酰 -tRNA合成酶编辑或校正过程中形成的反应产物，属一种环硫酯。Hcy可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成。[2] 3检测方法 编辑 最早检测同型半胱氨酸是氨基酸分析法，Ueland等测定血清中同型半胱氨酸，后经改良，目前常用方法包括以下几种。 同位素法：由Refsum等1985年建立的方法。该方法通过14C标记的腺苷与HCY缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来测HCY浓度。该方法灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，未能推广使用。 色谱法：1987年Stabler首先报道了气相色谱―――质谱法测定同型半胱氨酸。该法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质。虽

高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法在血清同型半胱氨酸含量检测中的应用

高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法在血清同型半胱氨酸 含量检测中的应用 杨元好;肖静;蒋艺勤;吴永国;唐娟 【期刊名称】《中国医学创新》 【年(卷),期】2016(13)24 【摘要】目的:比较高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法对血清同型半胱氨酸含量测定效果.方法:选取2013年12月-2015年9月于本院健康体检的体检者120例作为研究对象,将其分为高效液相色谱法组和L-蛋氨酸γ-裂解酶法组,每组60例.比较两组变异系数、回收率及准确度.结果:两组不同浓度批内和日间变异系数比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);两组不同浓度回收率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);两组检测同型半胱氨酸含量比较,差异无统计学意义(P＞0.05),L-蛋氨酸γ-裂解酶法组检测准确率为99.24％,高于高效液相色谱法组的89.63％,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:在同型半胱氨酸含量的测定中,两组检测稳定性无明显差异,相对高效液相色谱法而言,L-蛋氨酸γ-裂解酶法检测准确率较高.在临床检验中,可以根据检测工作需求选择合适的检测方法. 【总页数】4页(P50-53) 【作者】杨元好;肖静;蒋艺勤;吴永国;唐娟 【作者单位】广东省深圳市宝安区松岗人民医院广东深圳518105;广东省深圳市宝安区松岗人民医院广东深圳518105;广东省深圳市宝安区松岗人民医院广东深圳518105;广东省深圳市宝安区松岗人民医院广东深圳518105;广东省深圳市宝安区松岗人民医院广东深圳518105

【正文语种】中文 【相关文献】 1.高效液相色谱法与容量分析法测定发酵液中L-赤藓酮糖含量的比较 [J], 葛驰宇;张君丽 2.高效液相色谱法同时测定水果蔬菜中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、脱氢抗坏血酸及总维生素C的含量 [J], 杨媛;冯晓元;石磊;杨军军;张莹莹;张开春 3.高效液相色谱法同时测定发酵液中木糖醇和L－木酮糖的含量 [J], 葛驰宇;蒋洁;翁旭;张君丽 4.反相高效液相色谱法安培检测器快速测定人血清中维生素C含量 [J], 卓海通;高允生 5.血清同型半胱氨酸、α-L-岩藻糖苷酶、血清铁蛋白检测在原发性肝癌诊断中的应用 [J], 卓雪芽; 吕微风 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买

摘要 目的： 建立测定血浆同型半胱氨酸的高效液相色谱(HPLC)方法

摘要目的：建立测定血浆同型半胱氨酸的高效液相色谱（HPLC）方法。方法：血浆同型半胱氨酸经巯基乙醇还原后用碘乙酸封闭巯基，再与邻苯二甲醛（OPA）反应完成衍生化；以磺基同型半胱氨酸为内标，经C18反相柱进行色谱分离，荧光检测器测定结果。结果：测定线性范围达150μmol/L，最低检测限为1.0 μmol/L，日内不精密度3.7%～4.2%；日间不精密度3.8%～4.3%；方法回收率93%～102%。结论：本方法可用于临床实验室测定血浆同型半胱氨酸水平。关键词：同型半胱氨酸；邻苯二甲醛；高效液相色谱同型半胱氨酸（HCY）为含巯基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。自60年代初在尿中首次被发现以来，同型半胱氨酸被认为与多种先天性代谢缺限有关，如胱硫醚β合成酶（EC4.2.1.22）缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿症的原因。最近，人们又发现高同型半胱氨酸血症是发生外周血管、脑血管和冠状动脉血管疾病的危险因素之一，这是因为同型半胱氨酸不仅可影响脂类代谢，还可通过多种其他途径诱发心血管疾病［1］。据调查，相当大比例的人群面临高同型半胱氨酸血症的危险，尤其是当食物中叶酸和维生素B12摄入不足时更是如此。这些说明，遗传因素、环境因素、叶酸及VB12摄取量都与同型半胱氨酸血症有关。测定同型半胱氨酸的常用方法是高效液相色谱（HPLC），对还原型同型半胱氨酸的荧光衍生物或使用电化学检测器直接测量。目前，同型半胱氨酸的测定方法还有荧光偏振免疫分析（FPIA）和酶联免疫吸附实验（ELISA）。这两种方法是通过特异性的S腺苷同型半胱氨酸水解酶催化同型半胱氨酸转变为S腺苷同型半胱氨酸，再利用单克隆抗体技术进行检测。本实验在参考国外有关文献的基础上［2，3］，对样本处理和色谱条件进行了适当的改进，筛选出适宜的内标物，建产立了血浆同型半胱氨酸测定的HPLC方法，并已试用于临床。材料与方法一、仪器 Waters 510液相色谱泵，Shimadzu RF551荧光检测器，Waters nova-Pak ODS色谱柱（3.9 mm×150 mm）及保护柱，PC800色谱工作站；Millipore过滤器及0.45μm滤膜。 二、试剂 β巯基乙醇、同型半胱氨酸、碘乙酸、邻苯二甲醛（OPA）为Sigma公司产品；磺基同型半胱氨酸（Homocysteic acid）为Aldrich公司产品；四硼酸钠、乙腈（色谱纯）、乙酸钠、冰乙酸为北京化学试剂公司产品。上述化学试剂均为分析纯。3.4%碘乙酸工作液：碘乙酸3.4 g溶于0.5 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 11.0）100 ml。OPA衍生化试剂：OPA60 mg溶于1.0 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 11.0）8 ml，加甲醇1 ml，巯基乙醇1 ml。 三、流动相 流动相A：0.05 mol/L乙酸盐缓冲液，pH 6.8，含8%乙腈；流动相B：100%乙腈。流动相在使用前需经Millipore过滤器处理。 四、内标 1.0 mmol/L磺基同型半胱氨酸水溶液。 五、样本采集与处理 样本采用EDTA抗凝的静脉血，样本采集后10 min内离心分离血浆（4℃，2500 g×10 min）；如在8 h内不能完成分析，样本应置-20℃保存。样本前处理：取血浆150μl，加入10%巯基乙醇水溶液10 μl及内标液4 μl，混匀，2 min后加入100 g/L三氯乙酸溶液100 μl，混匀，离心（5 000 g×15 min）。取离心上清液50μl，加碘乙酸工作液50 μl，混匀；2 min后，加1.55 mol/L氢氧化钠溶液10μl和OPA衍生化试剂40 μl，混匀；1 min后取5 μl进样分析。 六、色谱条件 样本分析采用梯度洗脱程序，初始状态：A相为100%，B相为0；第6～8 min：A相由100%降至10%，B相由0升至90%；第12～13 min：A相由10%升至100%，B相由90%降至0，恢复初始状态。泵流速为1.3 ml/min，荧光检测器的激发波长为335 nm，检测波长为455 nm。 结果 1.色谱结果：在上述色谱条件下，样本中的内标和同型半胱氨酸的保留时间分别为 2.8和4.9 min，能与其他峰有效地分离（图1，2）。

HPLC在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用

HPLC在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用 【摘要】目的:探讨高效液相色谱法(HPLC)在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用。方法:血浆同型半胱氨酸用邻苯二甲醛(OPA)衍生,经 色谱柱(×200mm,5μm),用mol·L-1NaAc∶乙腈∶四氢呋喃=56∶∶的流动相洗脱,柱温40℃,检测波长330nm,流速·min-1。结果:线性范围为~μg·mL-1,回归方程为A=+,r=;平均回收率为%,RSD=(n=6),日内及日间相对标准偏差均小于5%。结论:该法准确、简便、快捷,适用于大多数实验室。 【关键词】同型半胱氨酸; 高效液相色谱法 【ABSTRACT】 Objective: To set up the method for determining the content of Homocysteinein Human Plasma with HPLC. Methods: Column was μ anced Solution as mobile phase and detective wavelength at 330nm,the fiowing speed was ·min-1,and Column temperature was 40℃.Results: The calibration curve was linear in the range of ~ μg·mL-1 and ,The linear correlation equation was A=+(r=)The average recovery rate was %,and RSD was Between %(n=6). The standard relative difference within a day and between two days was lower than 5%. Conclusion: The method is simple、accurate,and fast,which is suitable for the most lab test. 【KEY WORDS】 Homocysteinein;HPLC 同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸,是蛋氨酸循环中腺苷基高半胱氨酸水解酶水解反应的产物。研究表明, 血中 Hcy 升高可致流产、新生儿缺陷、中风、老年性痴呆及其它老年性疾病如骨质疏松等,维生素B12及叶酸缺乏、心脑血管疾病等都可反映出血浆Hcy浓度异常变化。血浆中Hcy 测定已成为国外诊断维生素B12及叶酸缺乏、早期心脑血管疾病监控疗效的常规方法。 同型半胱氨酸的测定常用放射免疫法、荧光偏振免疫分析法及HPLC法等[4~6]。本研究在参考有关文献的基础上,对色谱条件进行了适当的改进,使测定更加简便、快速,应用于实际样品测定,效果良好。 1 仪器与试剂 仪器 HP1100高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、柱温箱、

同型半胱氨酸测定标准操作程序

同型半胱氨酸测定标准操作程序 1. 摘要 同型半胱氨酸是心脑血管疾病重要独立的危险因素,因此作为心脑血管疾病的辅助诊断用。 2. 适用范围 程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中HCY 的浓度。 3. 职责 使用日立7600自动生化分析仪进行测定HCY 浓度的工作人员要严格按照本SOP 程序进行,室负责人监督管理；本SOP 的改动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。 4. 检测方法 上海科华生物工程股份有限公司生产的同型半胱氨酸（HCY ）试剂盒采用的是循环酶法。 5. 原理 利用还原剂将结合型同型半胱氨酸还原成游离型后，通过同型半胱氨酸甲基转移酶(HMTase)与共价底物S-腺苷甲硫氨酸（SAM ）作用，转化为S-腺苷同型半胱氨酸（SAH ）和甲硫氨酸(Met)。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)将S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解为腺苷(Ado)和同型半胱氨酸(HCY)。生成的HCY 进入HMTase 催化的转化反应，形成循环反应。检测信号在循环过程中被放大。腺苷立即脱氨为次黄嘌呤核苷(Inosine)和氨，氨在谷氨酸脱氢酶(GLDH)作用下，引起NADH 还原成NAD +，从而引起340nm 处吸光度的下降。 O H NAD Glutam ate te Oxoglutara NADH NH NH e Ino Ado HCY SAH Met SAH SAM HCY GLDH ADA SAHase HMTase 2332sin ++−−→−-+++−−→−+−−→−++−−→−++ 6. 仪器 日立7600自动生化分析仪 7. 试剂 7.1 试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供 7.2 试剂瓶内主要成分：S-腺苷甲硫氨酸、三(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐、α-酮戊二酸、谷 氨酸脱氢酶、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氢酶、同型半胱氨酸甲基转移酶、

柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中同型半胱氨酸

柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中同型半胱氨酸唐秀芳;甄乾娜;樊子勉;冯成亚;丁敏 【摘要】A precolumn derivatization-high performance liquid chromatographic method for the determination of homocysteine (Hey) in plasma was established. Tris (2-carboxyethyl) phos-phine hydrochloride (TCEP) and N-( 1-pyrenyl) maleimide (NPM) were used as the reduced reagent and derivatization reagent, respectively. The separation was carried out on an Agilent Hypersil C-18 column (250 mm x4. 0 mm, 5μm) in gradient elution mode. The mobile phase consisted of A (15 mmoI/L sodium acetate solution), B (acetonitrile) and C (300 mL water containing 1 mL acetic acid and 1 mL phosphoric acid). The eluate was monitored by the fluorescence detector at an excitation wavelength of 330 nm and an emission wavelength of 380 nm. The mean recovery of Hey was (102.08 ±4.94)%. The linear range was from 0.500 μmol/L to 100μmol/L, with a detection limit of 0. 016μmol/L. The intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) for Hey were less than 5%. Seven plasma samples of patients with hypertension and seven plasma samples of healthy controls were tested, and the results demonstrated that the Hey in the plasma from the hypertension group was significantly different from that of the control group (p < 0. 05). The developed method is simple, fast, accurate, and suitable for clinical measurement.%建立了一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法用于测定血浆中同型半胱氨酸(Hcy).使用三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)为还原剂,N-(1-芘)马来酰亚胺(NPM)为衍生剂进行样品预处理,Agilent

液相色谱串联质谱法和循环酶法测定血清中同型半胱氨酸的相关性

液相色谱串联质谱法和循环酶法测定血清中同型半胱氨酸的相 关性 赵瑞;李鹏飞;于伟越;杜萍;赵志霞;刘洪川;刘丽宏 【摘要】Objective To analyze the correlation between LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay for determination of homocysteine concentration in human serum,and the application of two methods in the determination of homocysteine concentration.Methods Homocysteine concentrations of 63 serum samples were collected and determined by LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay,respectively.The correlation between the concentrations by different methods was analyzed and evaluated.Results The concentrations were(19.11 ± 15.69) μmol/L by LC-MS/MS method and(16.95 ± 14.41) μmol/L by enzymatic cycling assay,the P value evaluated by paired-samples T test showed that there was statistical difference among the concentrations determined by two different methods (t =6.25,P ＜ 0.05).The conversion formula was YLC- MS/MS method =1.074Xenzymatic cycling assay + 0.892,R =0.987.Conclusion There is good correlation between LC-MS/MS method and enzymatic cycling assay for the determination of homocysteine concentration in serum,providing a theoretical basis for estimating the concentrations in the same serum sample by the two methods.%目的分析液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法与循环酶法测定人血清中同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)浓度的相关性.方法收集63例患者的血清样本,用LC- MS/MS法和循环酶法分别测定相同样本的HCY浓度,并评价2种方法的相关性.结

液相色谱-串联质谱法检测干血点中的同型半胱氨酸

液相色谱-串联质谱法检测干血点中的同型半胱氨酸 韩吉春;李广林;王小臣;骆亦奇 【摘要】A high-throughput method to measure homocysteine( Hcy ) in dried blood spots ( DBS) by liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( LC-MS/MS ) was established. The DBS sample processing includes adding homocystine-D8 as internal standard,dithiothreitol ( DTT)as reducing agent for bound Hcy forms,acetonitrile containing 0. 1%( v/v)formic acid and 0. 05%( v/v)trifluoroacetic acid for Hcy extraction. This procedure was carried out in a 96-well plate format in an automated liquid handling platform to facilitate high-throughput analysis. The processed samples were separated on a Phenomenex CN column and quantitated by LC-MS/MS in multiple reaction monitoring( MRM)mode. The limit of detection was 0. 12μmol/L( S/N=3)and the limit of quantification was 0. 46 μmol/L( S/N=10). The linear range was 1. 16-148. 00 μmol/L ( R2 = 0. 994 ). The average recoveries were ( 103. 0 ± 4. 97 )% -(112. 0±2. 13)%. The intra-day relative standard deviations( RSDs)were 1. 9%-4. 6% and the inter-day RSDs were 1. 5%-7. 1%. DBS sample stability was confirmed by measuring same DBS samples stored for 0,1,2,3,4,5,6 and 14 days at -4,-20,22 and 37 ℃,and an overall sample RSD﹤15% was found under each temperature. Processed sample stability within 48 hours was also confirmed with an overall sample RSD﹤5%. The comparison of this method with conventional biochemistry assay was made by measuring 47 blood samples both in an automa-ted biochemistry analyzer( samples

同型半胱氨酸检测方法性能评价研究

同型半胱氨酸检测方法性能评价研究 李元宽 【摘要】目的：对比高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、循环酶法与酶比色法在同型半胱氨酸检测中的性能，了解和评价同型半胱氨酸检测方法。方法对HPLC、ELISA、循环酶法与酶比色法4种检测方法的线性范围、准确度、精密度以及抗干扰能力等指标进行分析。结果 HPLC回归方程为Y＝ 1．21×105 X－7．00×104，R2＝0．9998；ELISA回归方程为Y＝0．991 X＋0．6031，R2＝0．9996；循环酶法回归方程为Y ＝0．998 X＋0．6055，R2＝0．996；酶比色法回归方程为Y ＝0．993X＋0．6057，R2＝0．9994。HPLC、ELISA、循环酶法、酶比色法试剂实际测试精密度变异较小。胆红素（200 mg／L）、乳糜微粒（0．5％）、血红蛋白（1．5 g／L）、抗坏血酸（300 mg／L） 均不会对 HPLC、ELISA、循环酶法与酶比色法造成干扰。HPLC平均回收率为91．4％；ELISA平均回收率为86．0％；循环酶法平均回收率为89．9％；酶比色法平均回收率为80．2％。4种方法测定结果具有较好一致性。结论在同型半胱氨酸检测中，4种方法线性范围有所不同，精密度较佳，回收率较高，且有着较强的抗干扰能力。%Objective To compare the performance of high performance liquid chromatography (HPLC) ,enzyme‐linked immu‐nosorbent assay (ELISA) ,enzymatic cycling method and enzyme colorimetric method in the detectio n of homocysteine (Hcy) for un‐derstanding and evaluating the Hcy detection method .Methods The indicators of linear range ,accuracy ,precision and anti‐interfer‐ence ability in the four methods of HPLC ,ELISA ,cyclic enzyme and enzyme colorimetry were ana lyzed .Results The HPLC re‐gression equation was Y=1 .21 × 105

血清总同型半胱氨酸候选参考测量程序(液相色谱串联质谱法)的建立及性能评估

血清总同型半胱氨酸候选参考测量程序(液相色谱串联质谱法) 的建立及性能评估 沈敏;杨晓东;王琳;邹继华;张曼;邹炳德 【摘要】目的建立一种基于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术的血清总同型半胱氨酸(Hcy)候选参考测量程序并对其性能进行评价.方法采用一种简单的蛋白沉淀方法对血清样本进行前处理,然后采用LC-MS/MS定量检测总Hcy,参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)C62-A文件和C50-A文件对建立的候选参考方法进行线性、检测限与定量限、基质效应、精密度、正确度等基本分析性能验证.结果LC-MS/MS检测总Hcy的线性范围为0.5～200.0μmol/L.定量限和检测限分别为0.31 nmol/g、0.06 nmol/g.3种不同比例(1:1、80:20、20:80)的血清与溶液混合物的相对基质效应分别为1.94％、1.91％、1.78％.批内、批间变异系数(CV)分别为<2％和<1％.3种浓度(30.58、49.21、65.42 nmol/g)的加标样本平均加标回收率分别为99.8％、100.2％、100.8％.测定NIST SRM 1950标准物质的结果偏移<1％.样本处理后分别在室温[(23±2)℃]和自动进样器(温度为10℃)中放置24 h,检测结果均非常稳定.结论成功建立了基于LC-MS/MS技术的血清总Hcy候选参考测量程序.该参考测量程序准确度高、精密度好,能够用于常规临床检验方法的量值溯源,保证测定结果的准确性. 【期刊名称】《检验医学》 【年(卷),期】2018(033)011 【总页数】8页(P1018-1025) 【关键词】总同型半胱氨酸;同位素稀释液相色谱串联质谱;参考测量程序;性能评估

关于同型半胱氨酸

血同型半胱氨酸检测临床意义 同型半胱氨酸理论 虽然早在20世纪30年代就有人提到同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy），但Hcy理论的真正奠基人是美国哈佛大学的病理学家McCully。McCully在翻阅麻州总医院历史资料时偶然发现一个奇特的病例，一名8岁的男孩死于动脉粥样硬化造成的颈动脉狭窄。基于历史中有关该男孩尿中含有大量Hcy的记载引起了McCully的注意。经过大量实验研究，McCully于1969年首次向外界公布了他的研究成果：造成心脑血管疾病的真正原因不是脂质代谢紊乱而是血中Hcy过高，即氨基酸代谢紊乱。遗憾的是，McCully的理论整整被忽略了26年，McCully本人也因为哈佛大学禁止他以哈佛的名义发表“异端邪说”而辞去了其在哈佛大学和麻州总医院的职务。90年代，在哈佛公共卫生学院对8万人跟踪研究14年得出的结论证明了McCully的理论之后，1995年以McCully论述Hcy的理论专著《心脏革命》的出版和第一届Hcy国际学术会议的召开为标记，Hcy理论正式被医学界接受。 最近10年有关同型半胱氨酸的研究论文,在MEDLINE数据库中就有7000篇之多；研究证实,高浓度的Hcy是冠状动脉疾病、脑血管疾病、外周血管疾病独立的危险因子。血Hcy增高与多种疾病相关,如动脉硬化相关疾病(冠心病、中风、糖尿病等),静脉栓塞,肾脏疾病,骨质疏松,老年性痴呆,肿瘤,妊娠并发症,习惯性流产及新生儿缺陷等。因此监测和降低同型半胱氨酸的浓度，具有十分重要的临床意义。 同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫分子的氨基酸。在体内经蛋氨酸脱甲基化生成,主要通过再甲基化和转硫途径代谢。需蛋氨酸合成酶、胱硫醚β合成酶(CBS)及维生素B12、叶酸、维生素B6参与。酶功能障碍或维生素的缺乏等均可导致同型半胱氨酸升高。 同型半胱氨酸致病机理:①损伤血管壁导致血管阻塞;②损伤血管内皮细胞;③促进血小板激活;④增强凝血功能;⑤促进平滑肌增值;⑥细胞毒化作用;⑦刺激LDL氧化等。 高同型半胱氨酸血症治疗：叶酸400-800μg/d加维生素B6、维生素B12适量，2-4周复查；或甜菜碱6g/d,4-6周复查。理想的Hcy含量<10μmol/L【国外医学·老年医学分册，2005，26（1）：11】。善存(centrum)1粒/d 长期服用可用于预防高Hcy血症，减少动脉硬化性疾病患病率【Chines J of Clinical Nutrition,2002;10(1):60】。各科不同疾病用法用量遵医嘱。 同型半胱氨酸检测的临床意义 【心脑血管病防治】 美国一项对近万名25-74岁无心血管疾病美国人历时20年之久的研究发现，每天从食用中摄取至少300μg叶酸，可使中风的发生率降低20%，使心血管疾病发生率降低13%。叶酸能保护心血管系统是由于它能降低Hcy水平，而Hcy是引起动脉硬化最终导致心脏病和中风的罪魁祸首【Stroke,2002;33:1182-1188】。美国心脏协会建议成人摄取400μg叶酸/天，孕妇每600μg叶酸/天。 Stamfer等对14916例40-49岁美国男性医生进行Hcy检测，随访5年【JAMA,1992,268(7):877】。Perry 等对5661例40-59岁英国男性进行了为期11年的前瞻性研究【Lancet,1995,346(8987):1395】。结果：冠心病、MI、中风者的总Hcy显著高于对照组，血Hcy每增加1μmol/L，患MI危险增加18.2%，Hcy高于15.8者比低于14.1者患MI的相对危险性增加3.13倍。Hcy是中风的一个强烈独立的危险因素。研究还证实：中度Hcy升高是TIA与脑卒中的独立的危险因子【Stroke，1990，21：572】，叶酸可通过降低Hcy 防止出血性卒中的发生【Stroke，2005；36：1426】。 张氏等研究1698例经冠脉造影确诊的CHD患者,302例冠脉造影阳性及500名健康国人血浆总Hcy、血脂、血糖及其他危险因素的关系，证实高Hcy血症是国人CHD，尤其是MI的独立危险因素，且Hcy水平与CHD严重程度一致。【中国分子心脏病杂志，2003，3（4）：215】