【细胞分子生物学】第九章 基因诊断

第九章基因诊断

基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。

基因诊断的主要技术：

1、核酸分子杂交

2、聚合酶链反应（PCR）

3、基因芯片技术

第一节核酸分子杂交技术

核酸杂交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。

一、核酸杂交的基本原理

DNA的变性和复性：

在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，DNA的双链可解开成为单链，这一过程称为DNA的变性（Denaturatioin）。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。

Tm值是反映DNA的热稳定性的一个参数，称为DNA的熔化温度，系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度。

DNA的热稳定性或Tm值直接与其碱基组成特别是GC碱基对含量有关，GC碱基对含量越高，Tm值也越高。

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DNA的杂交即复性（Renaturation）是变性的单链DNA在一定的条件下（低于Tm的温度下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm值相关。

影响杂交的主要因素：

温度：一般在低于Tm约15至２５度的温度下杂交速率最快。

盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M时，对复性速度和Tm值影响不大。

甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。常用50%甲酰胺硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。

二、核酸探针的选择和标记

核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段，它必须具有高度的特异性，并且带有某种适当的标记以便被检测。

（一）核酸探针的类型

1、克隆的DNA片段，常用cDNA探针。

2、RNA探针（Riboprobe）

RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。

3、寡核苷酸探针可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。

4、聚合酶链反应扩增产物是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。（二）核酸标记的类型

放射性同位素目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低

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丰度mRNA检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。

核酸探针标记常用的同位素有以下几种：

１、３２P：其放射性强，自显影时间短，灵敏度较高，缺点是半衰期短（14.3天），放射线散射较严重，因此对分辩率有影响。

２、35S ：放射性较低，半衰期长（87.1天），灵敏度较高；低散射，因此在用Ｘ－光片自显影时分辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等

实验。

３、33P ：是一种较理想的同位素，它的放射性较低，灵敏度高，分辩率好，半衰期也较长(25.4天)，适用范围较广。但价格偏高。

非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。

优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。

（三）核酸探针的标记

1、随机引物法（Random priming）

随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，因此可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。

标记酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－klenow片段。

特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交。

2、缺刻平移法(Nick translation0

标记酶：大肠杆菌DNaseⅠ（极微量）和DNA聚合酶Ⅰ。

用缺刻平移法制备的探针较短，较适合于原位杂交。

3、RNA探针的制备和标记

RNA探针可用RNA聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高，所得产

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分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

第九章生化与分子遗传学(答案)

第九章生化与分子遗传学（答案） 选择题 （一）单项选择题 1．基因突变对蛋白质所产生的影响不包括： 影响活性蛋白质的生物合成B．影响蛋白质的一级结构 C．改变蛋白质的空间结构D．改变蛋白质的活性中心 E．影响蛋白质分子中肽键的形成 2．原发性损害指： A．突变改变了protein的一级结构，使其失去正常功能 突变改变了糖元的结构，使糖元利用障碍 突变改变了脂肪的分子结构，使脂肪动员受阻 D．突变改变了核酸的分子结构，使其不能传给下一代 E．突变主要使蛋白质的亚基不能聚合 *3．苯丙酮尿症的发病机理是苯丙氨酸羟化酶缺乏导致： A．代谢底物堆积B．代谢旁路产物堆积C．代谢中间产物堆积 D．代谢终产物缺乏E．代谢终产物堆积 4．半乳糖血症Ⅰ型的发病机理是由于基因突变导致酶遗传性缺乏使： A．代谢底物堆积B．代谢旁路产物堆积C．代谢中间产物堆积 D．代谢终产物缺乏E．代谢终产物堆积 5．色氨酸加氧酶缺乏症的发病机理是由于基因突变导致： A．5-羟色胺增多B．色氨酸不能被吸收C．色氨酸吸收过多 D．烟酰胺生成过多E．代谢终产物堆积 6．下列何种疾病不属于分子病? A. 肝豆状核变性 B. 先天性睾丸发育不全综合征 C. 血友病 D. 镰形细胞贫血 E. 家族性高胆固醇血症 7．关于苯丙酮尿症(PKU)，下列哪项说法是不正确的? 可进行新生儿筛查 B. 可进行产前检查 C. 不通过DNA分析不能确定出携带者 D. 是一种表现为智力低下的常染色体隐性遗传病 E. 是由于遗传性缺乏苯丙氨酸羟化酶所致 8．人类珠蛋白基因包括： A. 位于16p13上的类α珠蛋白基因簇，包括α和δ基因 B. 位于llpl5上的类β珠蛋白基因簇，包括α、β、γ、ε和δ等基因 C. 位于llpl5上的类α珠蛋白基因簇 D. 位于16p13上的类β珠蛋白基因簇 E. 位于Xp21的STR序列 *9．镰状细胞贫血是由于血红蛋白β链上的第6位氨基酸被下列哪种氨基酸替代? A. 脯氨酸 B. 色氨酸 C. 苏氨酸 D. 缬氨酸 E. 亮氨酸 *10．正常HbA的α链为141个氨基酸，有一种称为Hb Constant Spring的突变型，其α链为172个氨基酸，推测可能发生了： A. 无义突变 B. 终止密码突变 C. 移码突变 D.错义突变 E. 同义突变 11．一个溶血性贫血病人，经检查Hb A2为30%，肽链裂解后见有α、γ、δ三种肽链，其最可能被诊断为： A.α—地中海贫血 B.β-地中海贫血 C. HbS病 D. 高铁血红蛋白病

分子生物学课后题

第一章 1、简述细胞的遗传物质，怎样证明DNA是遗传物质？ 答：核酸是细胞内的遗传物质，包括脱氧核糖核酸(|DNA)和核糖核酸（RNA）两类，DNA是主要的遗传物质，具有储存遗传信息，将遗传信息传递给子代，物理化学性质稳定，有遗传变异能力适合作为遗传信息的特性，T2噬菌体侵染实验证明了DNA是遗传物质，将蛋白质被35S标记和DNA被32P 标记的T2噬菌体分别侵染E.coli后，发现进入宿主细胞的只有32P标记的DNA，而无35S标记物，所产生的子代噬菌体只含有32P标记的DNA，无S标记的蛋白质，因此证明DNA是遗传物质。 2、研究DNA的一级结构有什么重要的生物学意义？ 答：DNA的一级结构是指DNA分子中的核苷酸排列顺序，它反映了生物界物种的多样性和复杂性，任何一段DNA序列都可以反映出它的高度的个体性和种族特异性，另外DNA一级结构决定其高级结构，研究DNA一级结构对阐明遗传物质结构、功能及表达调控都极其重要。 3、简述DNA双螺旋结构与现在分子生物学发展的关系。 答：DNA双螺旋结构具有碱基互补配对原则具有极其重要的生物学意义，它是DNA复制、转录、逆转录等基因复制与表达的分子基础。DNA为双链，维持了遗传物质的稳定性。 4、DNA双螺旋结构有哪些形式？说明其主要特点和区别。 答：主要有B-DNA，A-DNA,E-DNA形式 B-DNA：每一螺周含有10个碱基对，两个核苷酸之间夹角为36度 A-DNA：碱基对与中心倾角为19度，螺旋夹角为32.7度 E-DNA：左手螺旋，每圈螺旋含12对碱基，G=C碱基对非对称地位于螺旋轴附近。 第二章 1、简述DNA分子的高级结构。 答：1、单链核酸形成的二级结构（发夹结构）2、反向重复序列（十字架结构，每条链从5'--3'方向阅读）3、三股螺旋的DNA（一条链为全嘌呤核苷酸链，另一条链为全嘧啶核苷酸链）4、DNA的四链结构5、DNA结构的动态性与精细结构6、DNA的超螺旋结构与拓扑学性质。 2、什么是DNA的拓扑异构体，它们之间的相互转变依赖于什么？ 答：DNA不同的空间分子构象又称拓扑异构体它们之间转换依赖于连环数L。连环数是指双螺旋DNA中两条链相互缠绕交叉的总次数。 3、简述真核生物染色体的组成，它们是如何组装的？ 答：真核生物的染色体在间期表现为染色质，染色质是以双链DNA作为骨架与组蛋白和非组蛋白及少量各种RNA等共同组成的丝状结构的大分子物质、 组装的顺序：DNA—核小体链—纤丝—突环—玫瑰花结—螺旋圈—染色体 4、简述细胞内RNA的分布结构特点 答：成熟的RNA主要分布在细胞质中，无论是真核或原核细胞质中，成千上万种的RNA都分为三大类：1、转运RNA 2、信使RNA 3、核蛋白体RNA。细胞核内的RNA统称为nRNA. 5、简述细胞内RNA的结构特点以及与DNA的区别。 答：1、碱基组成不同，RNA分子主要是A G C U 而DNA以T代替U。 2、RNA分子中的核糖都是D-核糖，而DNA则是D-2-脱氧核糖。 3、RNA分子中有许多稀有，微量碱基，而DNA除个别外，不含有稀有碱基 4、RNA分子中嘌呤碱基与嘧啶碱基不一定相等。 5、RNA分子具有逆转录作用，RNA翻译成蛋白质是遗传物质，是遗传信息的传递结合表达者。 6、RNA分子具有催化功能。 6、引起DNA变性的主要因素有哪些？核酸变性后分子结构和性质发生了哪些变化？ 答：①加热②极端PH值③有机溶剂，尿素和酰胺等 核酸变性后氢键被破坏而断裂，双链变为单链，而磷酸二酯键并未锻裂在A260nm 处呈现增色效应。DNA溶液的黏度大大下降、沉淀速度增加、浮力密度上升。紫外吸收光谱升高。酸碱滴定曲线改变，生物活性丧失等。 7、检测核酸变性的定性和定量方法是什么？具体参数如何？ 答：在DNA变性过程中，紫外吸收光谱的变化时检测变性最简单的定性和定量方法。核酸在260nm 处具有特征的吸收峰，便是为A260nm。以50ug/ml DNA溶液在A260下测定，三者的A260数值为：

分子生物学实验复习题附答案(最新整理)

分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？

第九章染色体

第九章人类染色体 一、教学大纲要求 1．掌握人类染色体的结构形态、类型和数目； 2．掌握人类非显带核型和G显带核型分析及描述方法； 3．掌握染色体多态性概念及其在医学研究中的应用； 4．熟悉细胞分裂过程中染色体的传递； 5．熟悉性染色质和莱昂假说； 6．了解人类细胞遗传学研究方法和进展。 二、习题 （一）A型选择题 1．真核细胞中染色体主要是由________组成。 A．DNA和RNA B．DNA和组蛋白质C．RNA和蛋白质 D．核酸和非组蛋白质E．组蛋白和非组蛋白 2．染色质和染色体是 A．同一物质在细胞的不同时期的两种不同的存在形式 B．不同物质在细胞的不同时期的两种不同的存在形式 C．同一物质在细胞的同一时期的不同表现 D．不同物质在细胞的同一时期的不同表现 E．两者的组成和结构完全不同 3．异染色质是间期细胞核中 A．螺旋化程度高，有转录活性的染色质 B．螺旋化程度低，有转录活性的染色质 C．螺旋化程度高，无转录活性的染色质 D．螺旋化程度低，无转录活性的染色质 E．以上都不是 4．常染色质是间期细胞核中 A．螺旋化程度高，有转录活性的染色质 B．螺旋化程度低，有转录活性的染色质 C．螺旋化程度高，无转录活性的染色质 D．螺旋化程度低，无转录活性的染色质 E．螺旋化程度低，很少有转录活性的染色质 5．经检测发现，某个体的细胞核中有2个X小体，表明该个体一个体细胞中有________条X染色体。 A．1 B．2 C．3 D．4 E．5 6．根据ISCN，人类C组染色体数目为 A．7对B．6对C．7对+X染色体D．6对+X染色体 E．以上都不是 7．胞增殖周期是 A．从一次细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束时为止所经历的全过程

细胞分子生物学

细鳞斜颌鲴种群的遗传分化及系统发生生物地理学研究 武震M100102115水生生物学 摘要：细鳞斜颌鲴（Xenocypris microlepis）属鲤形目，鲤科，鲴亚科，鲴属。俗称：沙姑子、黄片。我们将以中国各水系细鳞斜颌鲴种群为研究对象，以基因组微卫星标记和线粒体D-loop标记为线索，研究细鳞斜颌鲴种群的遗传分化及系统发生生物地理学特征，探讨相互间的遗传结构、亲缘关系和系统进化关系，为进一步开发和利用细鳞斜颌鲴资源奠定基础。 关键字：细鳞斜颌鲴，线粒体D-loop标记，微卫星标记，遗传分化, 亲缘关系, 系统进化 1．研究背景 细鳞斜颌鲴属中下层鱼类，平时喜生活于江河干支流水域，到了产卵季节，有一定的短距离洄游现象，上溯至适合条件的产卵场进行集群产卵。产后，亲鱼分散游动，离开产卵场，至秋季有一部分群体进入干流附属的湖泊或支流中进行索饵、育肥，冬季则又返回干流水深的潭穴中越冬。细鳞斜颌鲴的食性很杂，自全长2厘米以上的夏花鱼种开始，除摄食少量浮游生物外，主要是腐屑、底泥以及底生硅藻和摇蚊幼虫等底生生物。它在不同类型的水体中，均以腐殖质有机碎屑、腐泥及着生藻类为主要食物。其生长在头两年速度较快，2龄鱼的平均体重可达479克。细鳞斜颌鲴通常2冬龄性成熟，生殖季节在华中和华南地区为4―6月。成熟雌鱼的体重变化在415―1100克以上。平均每千克体重的鱼怀卵量为20万粒左右。产粘性卵，呈浅黄色。产出时卵径为0.8―1.2毫米。雄鱼在生殖季节，有珠星出现。广泛存在于东部各水系之中。故各水系之间的种群长期存在地理隔离，基因交流困难，是一个良好的进化生态学研究材料。国内对此鱼的研究也不多，且多为形态学方面的资料，研究其分子进化和群体遗传，有助于了解该种的资源状况，同时能够为生态学相关理论提供依据。 2．方法 2.1采样 分别采钱塘江，长江，珠江水系细鳞斜颌鲴，每条水系定5—7个点，如钱

分子生物学习题集第九章

第九章真核生物的基因表达调控 一、名词解释 1.操纵子 2. 顺式作用元件 3. 反式作用因子 4、启动子 5、增强子 6、基因表达 二、简答题 1、真核细胞表达外源基因的条件？ 2、简述真核生物转录水平的调控机制？ 3、简述真核生物转录后水平的调控机制？ 4、受体的特点？ 5、表皮生长因子介导的信号传导途径？ 6、cAMP信号转导途径？ 7、简述IP3-Ca2+信号途径： 8、原核生物与真核生物启动子的主要差别？ 9、比较原核生物与真核生物基因组结构的异同，并指出真核生物细胞的RNA 内含子剪接的主要方式。 10、比较原核生物与真核生物基因表达调控的异同点。 答案： 一、名词解释 1.操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。 2. 顺式作用元件：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 3. 反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。 4、启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。 5、增强子：位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特

殊DNA序列。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。 6、基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。 二、简答题 1、真核细胞表达外源基因的条件？ 答：首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；其次注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性；最后要注意选择适当的选择标记。2、简述真核生物转录水平的调控机制？ 答：真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA 聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程。A、转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。转录起始复合物的形成过程为：TFⅡD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFⅡD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物。在这个过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFⅡD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFⅡD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。B、反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性调控作用。3、转录起始的调控：⑴反式作用因子的活性调节：A.表达式调节——反式作用因子合成出来就具有活性；B.共价修饰——磷酸化和去磷酸化，糖基化；C.配体结合——许多激素受体是反式作用因子；D.蛋白质与蛋白质相互作用——蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。⑵反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。⑶反式作用因子的作用方式——成环、扭曲、滑动、Oozing。⑷反式作

分子生物学课后习题答案

第一章绪论 ?DNA重组技术和基因工程技术。 DNA重组技术又称基因工程技术，目的是将不同DNA片段（基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。 DNA重组技术有着广泛的应用前景。首先，DNA重组技术可以用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体，提高产量，降低成本。其次，DNA重组技术可以用于定向改造某些生物的基因结构，使他们所具有的特殊经济价值或功能成百上千倍的提高。 ?请简述现代分子生物学的研究内容。 1、DNA重组技术(基因工程) 2、基因表达调控(核酸生物学) 3、生物大分子结构功能(结构分子生物学) 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二章遗传的物质基础及基因与基因组结构 ?核小体、DNA的半保留复制、转座子。 核小体是染色质的基本结构单位。是由H2A、H2B、H3、H4各两分子生成八聚体和由大约200bp的DNA构成的。核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一步。 DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。 转座子是存在染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。转座子分为两大类：插入序列和复合型转座子。 ?DNA的一、二、三级结构特征。 DNA的一级结构是指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。分为左手螺旋和右手螺旋。 DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA 高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。 ?DNA复制通常采取哪些方式？ 1、线性DNA双链的复制：复制经过起始、延伸、终止和分离三个阶段。复制是从5’端向3’端移动，前导链的合成是连续的，后随链通过冈崎片段连接成完整链。 2、环状DNA双链的复制 (1)θ型：是一种双向复制方式。复制的起始点涉及DNA的结旋和松开，形成两个方向相反的复制叉，复制从定点开始双向等速进行。 (2) 滚环型：是单向复制的一种特殊方式，发生在噬菌体DNA和细菌质粒上，首先对正链原点进行专一性的切割，形成的5’端被单链结合蛋白所覆盖，3’端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。

分子生物学实验

分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；

细胞和分子生物学实验重点知识点汇总

细胞和分子生物学实验重点知识点汇总 Experiment1细胞有丝分裂 间期：有明显的细胞核，染色质分布较均均，由于染色质易与碱性染料结合，故细胞核的染色比细胞质深。核中可见1～3个染色较浅的呈球状的核仁 前期：细胞核膨大，染色质逐渐螺旋化为丝状的染色丝，其后染色丝进一步缩短变粗，形成一定形态和书目的染色体（这时候的每条染色体由两条染色单体组成，但在光镜下一般不易看清），核膜、核仁逐渐消失 中期：每条染色体中的成对染色单体逐渐分开（但着丝粒仍未分离）全部染色体（2n=16）移向细胞中央的赤道面上，形成赤道板。在赤道板到两面有许多纺锤丝连接细胞两极和染色体的着丝点，成为纺锤体，但不易观察到，此时染色体形态最典型 后期：着丝粒纵裂为二。这是，每条染色体的两条染色单体已完全分开，由于纺锤丝的牵引，分别向细胞的两极移动，形成了数目相等的两组染色体（这是所观察到的染色体数目比原来增加1倍，是由于S期内DNA含量倍增的结果） 末期：染色体移到两极并解旋为染色质，细胞中部出现细胞板，并逐渐向边缘发展。当染色质构成核网时，核膜、核仁重新出现。细胞板达到两边，分裂结束，形成两个子细胞，细胞又进入间期状态。 Experiment2动物染色体的制备 原理：染色体只有在分裂期的细胞，特别是中期细胞中表现出典型形态便于观察和计数，所以必须采取特殊的技术方法，从发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备。骨髓细胞数量多、分裂旺盛，不需体外培养和无菌操作，便于取材。 秋水仙素的作用：抑制纺锤体的形成，使细胞停留在分裂中期 KCl低渗溶液：使细胞膨胀，促使中期染色体散开 固定液：有固定作用，对染色体还有一定的分散作用 Giemsa染色液：染色 结果：低倍镜下，可见到许多大笑不等被染成紫红色呈圆形的间期细胞核以及分散在它们之间的中期分裂象。小鼠染色体一般呈“U”形，染色体2n=40

分子生物学试验基础知识

分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶

第九章基因工程和基因组学

第九章基因工程和基因组学 本章习题 1．什么是遗传工程？它在理论上和实践上有什么意义？ 答：遗传工程是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动物和植物新品种、工业化生产生物产品、诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。 广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、基因工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本章只涉及狭义的遗传工程，即基因工程。 理论意义：遗传工程（基因工程）中的DNA重组主要是创造自然界中没有的DNA分子的新组合，这种重组不同于精典遗传学中经过遗传交换产生的重组。 实践意义：遗传工程（基因工程）技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。在工厂化生产药品、疫苗和食品；诊断和治疗遗传疾病；培养转基因动植物等方面都有非常重大的意义，即基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。（详见第10题）。 2．简述基因工程的施工步骤。 答：基因工程的施工由以下这些步骤： ⑴.从细胞和组织中分离DNA； ⑵.利用能识别特异DNA序列的限制性核酸内切酶酶切DNA分子，制备DNA 片段； ⑶.将酶切的DNA片段与载体DNA（载体能在宿主细胞内自我复制连接），构建重组DNA分子； ⑷.将重组DNA分子导入宿主细胞，在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆； ⑸.重组DNA随宿主细胞分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝； ⑹.从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子； ⑺.使克隆的DNA进一步转录成mRNA、翻译成蛋白质，分离、鉴定基因产物。

3．说明在DNA克隆中，以下材料起什么作用。 (1)载体；(2)限制性核酸内切酶；(3)连接酶；(4)宿主细胞；(5)氯化钠 答：⑴. 载体：经限制性酶酶切后形成的DNA片段或基因，不能直接进入宿主细胞进行克隆。一个DNA片段只有与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌和酵母人工染色体等。 ⑵. 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶是基因工程的基石。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制或阻止病毒侵染。这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一序列内将双链DNA分子切断。 ⑶. 连接酶：将外源DNA与载体相连接的一类酶。 ⑷. 宿主细胞：能使重组DNA进行复制的寄主细胞。 ⑸. 氯化钠：主要用于DNA提取。在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加入一定浓度的氯化钠，使钠离子中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。另外，氯化钠也是细菌培养基的成分之一。 4．有一个带有氨苄青霉素和四环素抗性的质粒，在其四环素抗性基因内有一个该质粒惟一的EcoRI酶切点，今欲用EcoRI位点克隆果蝇DNA，构建一个基因库，连接的产物转化大肠杆菌菌株DH5 ，试问：⑴. 在培养基中加入哪一种抗生素用于选择阳性克隆？⑵. 对哪一种抗生素有抗性的质粒携带外源果蝇DNA片段？⑶. 如果有的克隆可抗两种抗生素，如何解释？ 答：⑴.在培养基中加入四环素结合影印法可用于选择阳性克隆。 ⑵.对氨苄青霉素有抗性的质粒携带外源果蝇DNA片段。 ⑶.这种克隆是没有受到EcoRI酶解的原始质粒或这些克隆都是自连形成的非重组体。 5．在构建一个真核生物核DNA库时，需要考虑哪些因素？ 答：核基因库是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。通常方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度（大于15kb）的DNA片断，与适宜的载体连接构成重组DNA分子，

细胞分子生物学名词解释最全版

, 内膜系统的膜结构破裂后自己重新封闭起来的小囊泡(主要 是内质网和高尔基体), 是异质性的集合体, 形态、大小及功能常因生物种类和细胞类型不同而异。据微体内含有的酶的不同可分为过氧化物酶体、糖酵解酶体和乙醛酸循环体。在蛋白质合成过程中,同一条mRNA分子能够同多个核糖体结合，同时合成若干条蛋白质多肽链，结合在同一条mRNA上的核糖 叠的多肽链相互作用的蛋白质，能够加速正确折叠的进行或提供折叠发生所需要的微环境。动物体细胞在体外可传代的次数，与物种的寿命有关，它们的增殖能力不是无限的， DNA在核小体连接处断裂成核小体片 色体末端的特殊结构，即染色体末端DNA 序列的多个重复，其作用是保护和稳定染色 RNA 依赖性DNA 聚合酶，为一种核糖核蛋白酶，是合成端粒必需的酶。在双线期中,交叉数目逐渐减少,在着丝粒两侧的交叉向两端移动.这个现象称为 成染色体联会的两条同源染色体互相紧靠，进而缠绕在一起，基质开始附着到染色丝上，成为一条短而粗的染色体。据染色体被拉向两极所受到的力的不同，后期可分为后期A 和后期B,此时的染色体 启动DNA复制的关键因子,是真核细胞DNA M期促进因子。

能够促使染色体凝集，使细胞由G2期进入M 物质多肽的形式合成，其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列。引导前体多肽 是指具有摄取、处理及提呈抗原能力的细胞，能摄取病原体蛋白并将其加工将成短肽段，呈递给T细胞。 ,从中 于高等真核细胞中，是内层核被膜下纤维蛋白片层，纤维纵横排列整齐呈纤维网络状。 成串排列在一起，主要集中在染色体的着丝 DNA和组蛋白构成，是染色质的基本结构 在一定时期的特种细胞的细胞核内, 它由不表达的DNA序列组成， 分裂过程中,核仁出现周期性变化。一般在分裂前期逐渐消失，其纤丝和颗粒成分散失于核质之中；在分裂末期又重新出现。核仁的形成常与特定染色体的一定区域密切相关。 色体片段, 通过次缢痕与染色体主要部分相连。 指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、 是卵母细胞进行第一次减数分裂时, 停留在双线期的染色体。含4条染色单体,形似灯刷。 由核内有丝分裂产生的多股染色单体平行排列而成。

分子生物学课后习题答案

第一章绪论 ?DNA重组技术与基因工程技术。 DNA重组技术又称基因工程技术,目得就是将不同DNA片段(基因或基因得一部分)按照人们得设计定向连接起来,在特定得受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞得新得遗传性状。 DNA重组技术就是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究得结晶,而限制性内切酶DNA连接酶及其她工具酶得发现与应用则就是这一技术得以建立得关键。 DNA重组技术有着广泛得应用前景。首先,DNA重组技术可以用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低得多肽,如激素、抗生素、酶类及抗体,提高产量,降低成本。其次,DNA重组技术可以用于定向改造某些生物得基因结构,使她们所具有得特殊经济价值或功能成百上千倍得提高。 ?请简述现代分子生物学得研究内容。 1、DNA重组技术(基因工程) 2、基因表达调控(核酸生物学) 3、生物大分子结构功能(结构分子生物学) 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二章遗传得物质基础及基因与基因组结构 ?核小体、DNA得半保留复制、转座子。 核小体就是染色质得基本结构单位。就是由H2A、H2B、H3、H4各两分子生成八聚体与由大约200bp得DNA构成得。核小体得形成就是染色体中DNA压缩得第一步。 DNA在复制过程中,每条链分别作为模板合成新链,产生互补得两条链。这样新形成得两个DNA分子与原来DNA分子得碱基顺序完全一样。因此,每个子代分子得一条链来自亲代DNA,另一条链则就是新合成得,这种复制方式被称为DNA得半保留复制。 转座子就是存在染色体DNA上得可自主复制与移位得基本单位。转座子分为两大类:插入序列与复合型转座子。 ?DNA得一、二、三级结构特征。 DNA得一级结构就是指4种脱氧核苷酸得连接及其排列顺序,表示了该DNA分子得化学构成。 DNA得二级结构就是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成得双螺旋结构。分为左手螺旋与右手螺旋。 DNA得高级结构就是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成得特定空间结构。超螺旋结构就是DNA高级结构得主要形式,可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。 ?DNA复制通常采取哪些方式？ 1、线性DNA双链得复制:复制经过起始、延伸、终止与分离三个阶段。复制就是从5’端向3’端移动,前导链得合成就是连续得,后随链通过冈崎片段连接成完整链。 2、环状DNA双链得复制 (1)θ型:就是一种双向复制方式。复制得起始点涉及DNA得结旋与松开,形成两个方向相反得复制叉,复制从定点开始双向等速进行。 (2) 滚环型:就是单向复制得一种特殊方式,发生在噬菌体DNA与细菌质粒上,首先对正链原点进行专一性得切割,形成得5’端被单链结合蛋白所覆盖,3’端在DNA聚合酶得作用下不断延伸。 (3) D-环复制:也就是单向复制得一种方式。就是在线粒体DNA中发现得。两条链得合成就是高度不对称得,最初只以一条母链为模版合成,迅速合成互补得新链,另一条则成为游离得

细胞与分子生物学考题

细胞与分子生物学考题 Chapter 3 Protein Structure & Function 1. The primary, secondary, tertiary and quaternary structures of proteins. N972010028 黄琴淑 (1) 一级结构 (primary structure) :蛋白质的序列称之为蛋白质的「一级结构」。 (2) 二级结构 (secondary structure) : 一级结构上的胺基酸间可交互作用，利用醯胺键上的C=O键与胺基形成氢键。这样形成的简单又有规则的结构，称之为二级结构 (secondary structure)。蛋白质有α螺旋 (helix)与 beta 折曲平面 (pleated sheet); 两种主要 而且规则的二级结构，由这些简单的结构又可组合成一些独立折叠的单元，称之为模组（motif）。 (3) 三级结构 (tertiary structure) :蛋白质的三级结构是由一条多月生(polypeptide)链组成，可包含一个或多个模组。 (4) 四级结构 (quaternary structure)：蛋白质的三级结构是由一条多月生(polypeptide)链组成，可包含一个或多个模组。一个含有多个次单元蛋白质中，每个次单元都是一个三级结构，次单元间可能有疏水性作用，盐桥等交互作用而形成四级结构，所以含有多个次单元的蛋白质才有四级结构 (quaternary structure)。 第壹题参考资料 蛋白质的一级结构 将蛋白质中胺基酸顺序视为整体构造，是一种用有机化学词语来描述分子的完全方法。自很多不同蛋白质的顺序分析中可以看出，每种蛋白质都有其独特的结构，而顺序排列即是该种系的特性。在少数的情形中，特殊的器官或组织也具有特定结构的蛋白质，更进一步的，蛋白质可以如细胞分裂一般很正确地被复制出相同顺序的蛋白质。我们可以参考牛的胰岛素(Bovine insulin)；更正确地说，是参考proinsulin。Proinsulin为生物活性贺尔蒙的先质(precursor)，藉着正常牛的胰脏岛状细胞仔，细地做成的一种特定构造。牛的胰岛素和其他哺乳类的胰岛素几乎是相同的，通常只有一个胺基酸不同，即A链中第8，9或10位置胺基酸的改变。这些相似性使得这方面的研究迅速扩展，虽然在不同种类中，胺基

分子生物学实验指导-3

北京化工大学分子生物学实验指导

实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部

802 细胞与分子生物学考试大纲2015版

802细胞与分子生物学考试大纲(2015版) 细胞生物学部分 1 绪论 细胞生物学的主要研究内容与当前细胞生物学研究的根本问题,细胞学说的创立及其内容要点与意义。 2 细胞的统一性与多样性 细胞的基本特征,原核细胞与古核细胞、真核细胞以及非细胞生命体的基本知识。 3、细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法与相关仪器的原理与应用范围,细胞化学组成及其定位与动态分析技术的原理与应用范围,细胞培养及细胞工程的相关概念与方法原理,细胞及生物大分子动态变化研究方法的概念及原理,细胞生物学研究中常用的模式生物,功能基因组学的基本研究思路与方法。 4、细胞质膜 细胞质膜结构模型的基本要点,细胞质膜的基本组成成分及其特点与意义,细胞质膜的基本特征、功能与研究方法。 5、物质的跨膜运输 物质的跨膜运输的基本概念,跨膜运输的主要途径、转运装置、运输的基本过程。 6、线粒体与叶绿体。 线粒体的基本形态,动态特征及其分子细胞生物学基础,线粒体超微结构组成及其功能特点,氧化磷酸化的分子结构基础与转化机制,线粒体的半自主性与起源。 7、细胞质基质与细胞内膜系统 细胞质基质的含义与功能。 内膜系统的概念及其组成成员;内质网的基本类型及其功能,内质网应激及其信号调控;高尔基复合体的形态结构、标志性酶以及功能;溶酶体与过氧化物酶体的结构特点,发生与功能。

8、蛋白质分选与膜泡运输 信号假说与蛋白质分选信号。蛋白质分选的基本途径与类型。蛋白质向线粒体与过氧化物酶体的分选途径与机制。膜泡运输的途径与机制,细胞结构体系的组装方式及意义。 9、细胞信号转导 细胞信号转导的基本知识与基本概念,各种类型信号传递的通路,细胞信号转导的整合与控制。 10、细胞骨架 细胞骨架的基本概念。 微丝的组成及其组装,网格结构的调节与细胞运动,依赖于微丝的分子马达,以及肌细胞收缩运动结构基础与机制模型;微管的结构组成及其极性,组装与去组装,微管组织中心,微管的动力学性质,微管网格结构的调节,微管的功能(包括对细胞结构的组织作用,物质运输,纤毛与鞭毛的结构与功能,纺锤体);中间丝的一般形态与类型及其细胞特异性,中间丝的组装与表达,中间丝与其她细胞结构的联系。 11、细胞核与染色体 核被膜的结构特点、崩解与组装、生物学意义;核孔复合体的结构模型及功能;核纤层的蛋白组成与功能。染色质的概念及其化学组成,基因组DNA的类型,染色质蛋白的的类型与特性;核小体的发现与结构;染色质的组装;染色质的类型及其特性。染色质复制与修复、表达的基本概念与调控机制。染色体的形态结构及其相关概念,染色体DNA的功能元件。核仁的超微结构分部与各部分的结构组成特点,核仁的功能,核仁周期性。 12、核糖体 核糖体的结构成分及其功能,核糖体的本质,RNA在生命起源中的作用。13、细胞周期与细胞分裂 细胞周期与分裂的相关的基本概念;细胞周期的时相划分及各时相的主要事件,以及研究细胞周期的最基本方法,早期胚胎与细菌细胞周期的特点。细胞有丝分裂的形态学过程,时相划分及各时相的变化标志,早中期染色体的移动与纺锤体的形成与结构,姐妹着丝粒的分离与后期染色体的移动,胞质分裂;减数分裂的形态学过程,时期划分与各期的主要变化特征,重要事件,特殊结构及其变化。