酶切注意事项及问题

一、建立一个标准得酶切反应?目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位得内切酶可

以切割1μg不同来源与纯度得DNA。通常,一个５0μｌ得反应体系中,１μｌ得酶在1X NEＢｕffer终浓度及相应温度条件下反应１小时即可降解1μｇ已纯化好得DNA。

如果加入更多得酶,则可相应缩短反应时间;如果减少酶得用量,对许多酶来说,相应延长反应时间(不超过1６小时)也可完全反应。??二、选择正确得酶

不言而喻，选择得酶在底物DＮＡ上必须至少有一个相应得识别位点。识别碱基数目少得酶比碱基数目多得酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量5０%得DＮA链,一个识别4个碱基得酶将平均在每4４(256）个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基得酶将平均在每46(40９6)碱基切割一次。内切酶得产物可以就是粘端得(3’或5’突出端),也可以就是平端得片段。粘端产物可以与相容得其它内切酶产物连接，而所有得平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录得pａtible Cohesivｅ Eｎdｓ And Reｃｌｅaｖa ｂle Ｂｌunt Eｎｄs一文。?

三、酶?内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当就是最后一个被加入到反

应体系中（在加入酶之前所有得其它反应物都应当已经加好并已预混合)。酶得用量视在底物上得切割频率而定。例如,超螺旋与包埋法切割得DNＡ通常需要超过1U/μｇ得酶才能被完全切割。参见目录第244与２64之"切割质粒DNA"与＂包埋法切割DNA"。

?

四、ＤNA

待切割得ＤＮA应当已去除酚、氯仿、乙醇、ＥDTA、去污剂或过多盐离子得污染,以免干扰酶得活性。DＮA得甲基化也应该就是酶切要考虑到得因素。关于甲基化得内容，参见第252页至25３页之甲基化相关内容。

五、缓冲液

对于每一种酶ＮEB都提供相应得最佳缓冲液,可保证几乎１00％得酶活性。使用时得缓冲液浓度应为1X。有得酶要求１0０μg/mｌ得BSA以实现最佳活性。在这种情况下,我们也相应提供100X得ＢSA(1０ｍｇ／ml）。不需要ＢＳA得酶如果加了BＳA也不会受太大影响。

?六、反应体积?内切酶活力单位得定义就是:１小时内,５０μl反应体积中,降解1μg得底物DNＡ所需得酶为一个活力单位。因此酶：ＤNA得反应比例可以由此确定。较小得反应体积更容易受到移液器误差得影响。为了将甘油得浓度控制在5％以下,要注意酶得体积不要超过总体积得１0%(一般酶都贮存于5０%得甘油中）。

七、混合?这就是非常重要然而常常被忽略得一步。想要反应完全,必须使反应液充

分混合。我们推荐用枪反复吸取混合,或就是用手指轻弹管壁混合,然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！?

八、反应温度

大部分酶得反应温度为３7°C;从嗜热菌中分离出来得内切酶则要求更高得温度。一般为5０-65°C不等。参瞧第2４4页 Acｔivｉty of thermoｐｈilｅs at 37°Ｃ。

?九、反应时间?1酶活单位得定义时间为1小时。如果加入得酶较多,可以相应地缩短反应时间;反之,如果加入得酶量较少,也可以延长时间以使反应达到完全。参见第２41页酶在反应中得存活时间。

十、终止反应

如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在ＮEB我们使用如下反应终止液:5０%得甘油，５0ｍM EＤTA(pＨ8、0),与０、０5%溴酚蓝（１0μl/5０μl反应液)。

如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应(65°Ｃ或85°C，20分钟）。热失活并不能适用于所有得酶,详情参见第240页热失活表。此外，酚／氯仿抽提也可以用于终止反应。??十一、贮存

大部分酶应贮存于-20°Ｃ。少部分酶则须在-70°Ｃ长期保存。详情请参见相关酶得DＡTA SHEEＴ或目录相关部分。10X BＵFFER 与100Ｘ BSA于-20°C保存。BＳＡ不能与NEBuｆfｅｒ混合后保存,否则将会出现BSA沉淀。??十二、稳定性

每隔1-2个月都会对所有得酶有一个活性检测;最近得一次检测结果将被贴在售出得每一管酶上。通过三十多年来得经验，我们发现大部分酶在推荐得保存缓冲液里在-20°C

?十三、对照反应?如果条件下十分稳定。高于－２0°C条件下稳定性将有所降低。?

发现您得DＮA底物不能被成功切开,可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下:将不加内切酶得底物DNA(待切底物）与加入了内切酶得对照DNA(有多个已知酶切位点)同时进行反应。若实验结果表明底物ＤＮA降解，则说明DＮA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物ＤNA保持完整，而对照DＮA被成功切开,则可以排除酶质量得原因,此时可以将对照DNA与待切底物ＤＮA混合起来再次进行反应,以确定样品中就是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常就是盐、ＥDＴＡ或酚)，则混合物里得对照DNＡ也无法被切开。

实验过程中得注意事项:

1、首先瞧就是单酶切还就是双酶切。要就是双酶切要注意这两种酶就是否

有共用得Buｆｆer。

２、酶得用量最好在４０Ｕ单位以上,尽可能酶切充分。?3、酶得用量不要超过总体积得1/１0。

4、同时瞧就是否需要用到ＢSA。

5、酶切时间不要低于２个小时。

6、酶切进行时,注意酶切温度就是否稳定地保持在最佳温度；酶切时间

根据厂家推荐，一般得酶１－2h即可，特别难酶切得时间可放长,但并不就是越长越好,时间太长易引发部分酶得星号活性，造成酶切失败。N

ＥＢ得酶我用过半小时内酶切即可彻底。

酶反应操作时注意事项:?1、基因工程操作就是微量操作,试剂昂贵,要细心,准确地配制所用得试剂。DＮA样品与酶用量体积都很少,要注意吸样量得准确性,酶用量不能过多,因酶通常保存在一定浓度得甘油内,酶用

量取得过多,甘油浓度加大反而抑制酶得反应,通常不应超过１/10 酶

反应总体积。

２、当塑料小管在一定温度下水浴进行酶反应时,盖子必须盖得严密,防

止水气出入,影响总体积。

3、酶反应得一切器皿,都要以重蒸水清洗，消毒灭菌,严防其它酶得污染。

4、要注意酶反应时,加样顺序,最后加酶液,混匀,操作过程中,一旦吸取

好酶溶液,酶应立即放回－20℃冰箱中，防止酶失活。

酶得星号活性

Ⅱ类限制酶虽然识别与切割得序列都具有特异性,但就是这种特异性受

特定条件得限制,即在一定环境条件下表现出来得特异性。条件得改变,

限制酶得特异性就会松动,识别得序列与切割都有一些改变,改变后得活

性通常称第二活性，而将这种因条件得改变会出现第二活性得酶得右上

角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。

概括起来,诱发星活性得因素有如下几种：?（1）高甘油含量(>5％， v/v);

(２）限制性内切核酸酶用量过高(>1００U／ｕgDNＡ）;

(3)低离子强度(<25 ｍmol/L)；?(４)高pＨ(８、0以上)；(5)含有有机

溶剂,如DＭSＯ,乙醇等;

(6)有非Ｍg2+得二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,C02+,Zn2+等

连接注意事项

1、与载体连接时，加大目得基因ＤNA量,以提高与载体得连接效率,而且可以按倍数扩大连接反应体积，如25ul加大到50ｕｌ

2、保证您得感受态细胞效率没问题,必要得时候可以做个阳性对照(加没有酶切得质粒载体)

３、转化过程中得冰浴要用碎冰加水,以保证温度,从热水浴中取出感受态后要迅速放入冰浴中。

（二)连接反应?1、实验步骤?１)用微量进样器吸取用PCR 清洁试剂盒终止酶反应得酶切反应液及试剂,混合于一个已编好号码得Eｐpendoｒｆ小管内,连接反应加样量及顺序:?(1)ｐＵC18质粒酶切反应液15 微升?(2)PＣR 产物酶切反应液15微升

（３)１0 倍T４连接缓冲液4 微升?(４)4微升灭菌双蒸水

(5)T4DNＡ连接酶２微升,反应液总体积为40毫升。?2)将硅化小管置于台式离心机上离心2 秒钟,使管壁上得试剂全部甩向底部,混合好。?３）在保温瓶内先装上自来水,用冰调好12℃,然后将有反应液得硅化小管置于保温并内过夜,也可将保温瓶置于普通冰箱冷藏室数天直至下一步反应所用。

4）在保温反应期间,应不时检查保温瓶内水温度,不使它超出15℃。

无菌技术的原则和注意事项

无菌技术操作原则 概念：无菌技术是指在执行医疗护理操作的过程中，防止一切医微生物侵入机体和保持无菌物 品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 1.无菌技术：指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌 物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 2.无菌物品：经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品 3.无菌区域：经过灭菌处理而未被污染的区域 4.非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌物品或区域。2操作原则 1.环境清洁 进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，减少人员走动，以降低室内空气中的尘埃。防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次，时间20~30分钟即可，也可适当延长消毒时间。 2.无菌操作 衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。必要时穿好无菌衣，带好无菌手套。 3.物品管理 无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4.无菌物品 无菌物品必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，有效期一周为宜，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7天，过期应重新灭菌。无菌物品一经使用或过期，潮湿应重新进行灭菌处理。 5.取无菌物 操作者身距无菌区20cm，取无菌物品时须用无菌持物钳（镊），不可触及无菌物品或跨越无菌区域，手臂应保持在腰部以上。无菌物品取出后，不可过久暴露，若未使用，也不可放回无菌包或无菌容器内。疑有污染，不得使用。未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6.无菌操作 如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 一物一人，一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。

无菌技术操作规程

无菌技术操作规程 一、无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，必须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗是每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7 天，过期应重新灭菌。 4、工作人员面向无菌区域，用无菌取无菌物品，手臂须保持在腰部水平以上，不可触及无菌物或跨越无菌区，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 5 进行无菌操作时不可面对无菌区讲话、打喷嚏。怀疑无菌物品被污染，不可使用。 6 进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用可，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病人用，以免发生交叉感染

二、准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。 3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒液溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75％酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套好。 5 用物排放有序，符合无菌操作要求。 三、操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2 无菌持物钳使用法： 无菌持物钳须置于无菌容器内，有效期限 4 小时；取、放无菌持物钳时，应将盖打开，钳端闭合，不可在盖孔中取、放；如需取远处物品时，应连同容器一起搬移，就地取出无菌物品。 3、无菌包使用法： 1）、查看无菌包的名称、灭菌日期，查看化学指示胶带粘贴。 2）、将无菌包放在清洁、干燥处，撕开粘贴。 3）、用拇指和食指先揭开左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内

酶切注意事项

酶切 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。 DNA酶切及凝胶电泳 一.DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一

双酶切连接反应常见问题分析

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。

无菌技术的原则和注意事项

无菌技术的原则和注意事项-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

无菌技术操作原则 概念：无菌技术是指在执行医疗护理操作的过程中，防止一切医微生物侵入机体和保持无菌 物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 1.无菌技术：指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体 和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 2.无菌物品：经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品 3.无菌区域：经过灭菌处理而未被污染的区域 4.非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌 物品或区域。 2操作原则 1.环境清洁 进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，减少人员走动，以降低室内空气中的尘埃。防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次，时间20~30分钟即可，也可适当延长消毒时间。 2.无菌操作 衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。必要时穿好无菌衣，带好无菌手套。 3.物品管理 无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4.无菌物品 无菌物品必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，有效期一周为宜，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7天，过期应重新灭菌。无菌物品一经使用或过期，潮湿应重新进行灭菌处理。 5.取无菌物 操作者身距无菌区20cm，取无菌物品时须用无菌持物钳（镊），不可触及无菌物品或跨越无菌区域，手臂应保持在腰部以上。无菌物品取出后，不可过久暴露，若未使用，也不可放回无菌包或无菌容器内。疑有污染，不得使用。 未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6.无菌操作 如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 一物一人，一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。

限制性内切酶酶切反应的标准操作规程

限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007） 1、目的及适用范围 利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。 2、主要试剂及仪器 微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer 3、操作步骤 按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。 反应物体积（μL） 灭菌水3 DNA40 10× Buffer K 5 EcoR I1 BamH I1 总体积50 4、问题向导 4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。 21

双酶切连接反应之全攻略

双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.

护理无菌操作

护士岗位技能训练和竞赛活动护理技术项目考核要点 目录 一、手卫生 (4) 二、无菌技术 (6) 三、生命体征监测技术 (10) 四、口腔护理技术 (15) 五、鼻饲技术 (16) 六、导尿技术及护理 (17) 七、胃肠减压技术 (19) 八、灌肠技术 (21) 九、氧气吸入技术 (22) 十、换药技术 (23) 十一、雾化吸入疗法 (25) 十二、血糖监测 (26) 十三、口服给药法 (27) 十四、密闭式输液技术 (28) 十五、密闭式静脉输血技术 (29) 十六、静脉留置针技术 (31) 十七、静脉采血技术 (32) 十八、静脉注射法 (33) 十九、经外周插管的中心静脉导管（PICC）护理技术 (35) 二十、动脉血标本的采集技术 (38) 二十一、肌内注射技术 (40) 二十二、皮内注射技术 (41) 二十三、皮下注射技术 (42) 二十四、物理降温法 (43) 二十五、心肺复苏基本生命支持术 (45) 二十六、经鼻/口腔吸痰法 (47) 二十七、经气管插管/气管切开吸痰法 (49) 二十八、心电监测技术 (51) 二十九、血氧饱和度监测技术 (52) 三十、输液泵／微量输注泵的使用技术 (53) 三十一、除颤技术 (55) 三十二、轴线翻身法 (56) 三十三、患者搬运法 (57) 三十四、患者约束法 (61) 三十五、痰标本采集法 (63) 三十六、咽拭子标本采集法 (64) 三十七、洗胃技术 (65) 三十八、"T"管引流护理 (67) 三十九、造口护理技术 (68) 四十、膀胱冲洗的护理 (70) 四十一、脑室引流的护理 (72) 四十二、胸腔闭式引流的护理 (73)

质粒的酶切、连接、与转化

质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 (2011-04-29 10:42:22) 转载▼ 质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 实验原理 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常

无菌技术操作注意事项

无菌技术 目的： 是保持无菌物品不被污染；防止一切微生物侵入或传播；预防医院感染的发生 无菌技术操作原则： 1.环境清洁宽敞并定期消毒，操作前半小时需停止清扫工作，减少走动，避免尘埃飞扬 2.工作人员着装符合无菌操作要求，无菌操作前操作者应衣帽整洁，修剪指甲并洗手，戴口 罩，口罩须盖住口鼻，最好用一次性口罩，一般情况下口罩应每4～8小时更换，一经潮湿细菌易于穿透，应及时更换 3.物品放置有序，标志明显，无菌物品是经过物理或化学方法灭菌后未被污染的物品，无菌 物品必须与非无菌物品分开放置且有明显标志，无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌容器中，无菌包外需标明物品名称，灭菌日期按失效期先后顺序摆放。无菌包有效期为7～14天，取用无菌物品时应使用无菌持物钳，无菌物品一经取出，虽未使用也不得放回无菌容器内。物品已有或已被污染即不可使用，应予更换并重新灭菌。明确无菌区与非无菌区 4.无菌区是经过物理或化学方法灭菌处理而未被污染的区域；非无菌区是未经灭菌处理或经 灭菌处理后被污染的区域。操作者的身体应与无菌区保持一定距离，取放无菌物品时，应面向无菌区，手臂应保持在腰部或操作台面以上，不可跨越无菌区，手不可接触无菌物品，避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏，未经消毒的物品不可触及无菌物品或跨越无菌区域5.一套无菌物品只供一位患者使用，以防交叉感染 无菌持物钳的使用操作中的注意事项： 1.无菌持物钳只能用于夹取无菌物品，不能用于夹取油纱布或换药 2.使用无菌持物钳时，钳端不可高举，手不可触及无菌持物钳的浸泡部分，无菌持物钳使用 后，应立即放回容器内，不得在空气中暴露过久 3.如到远处夹取物品应将持物钳放入容器内，一同搬移 4.无菌持物钳一经污染或已有污染时不得再放回容器内，应重新消毒 5.无菌持物钳和存放容器要定期消毒 无菌容器的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则：打开包布时手只能接触包布四角的外面，不可触及包布内面，不 可跨越无菌面 2.包内物品未用完应按原折痕包好，注明开包日期及时间，限24小时内使用 3.如包布内物品超过有效期，被污染或包布受潮，则需重新灭菌 无菌溶液的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则，不可跨越无菌区 2.不能将无菌物品或非无菌物品伸入瓶内蘸取溶液或直接接触 3.已倒出的溶液虽未使用也不得倒回瓶内 铺无菌盘的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则，非无菌物品及身体应与无菌盘保持适当的距离，身体部位不可跨 越无菌区 2.无菌盘应保持干燥，避免潮湿污染 3.已铺好的无菌盘应尽早使用，有效期不超过4小时 无菌手套的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则 2.注意修剪指甲以防刺破手套，选择合适手掌大小的手套 3.未带手套的手不可触及无菌手套的外面，已戴手套的手不可触及未戴手套的手及手套的内 面。戴手套后如发现手套破损或不慎污染，应立即更换。戴手套后手臂不可下垂，应保持在腰部或操作台面以上视线范围内活动 4.脱手套时应翻转脱下

酶切和连接5页

双酶切： 载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。 我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。 我的酶切体系如下： 质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng） (NEBlack Eye SfiⅠ1ul (NEBlack Eye BssHⅡ1ul 10×buf 2.2ul 100×BSA 0.2ul 水14.8ul 总体积20ul 50度，2小时。切出了370bp左右的片段，回收载体。 然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。50度3小时我试过，但是质粒有降解。酶量应该说是过量的。请问有什么办法可以酶切完全？ 粘性连接 （一）外源DNA和质粒载体的连接反应 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这

实验3酶切与连接

实验三、酶切与连接 一、实验目的与原理简介 限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。 制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带； 而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面： 1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况； 4）切割与连接方式；5）接头状态。 酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种： 1）部分酶是指同一DNA 片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。 2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。 二、材料和试剂 限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪 三、实验步骤 1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下： 2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。 3）切胶回收（尽量不要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。 4）回收产物电泳检测后进行连接： 连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl 目的基因 6μl 质粒载体 2μl 产物酶切体系 pPI9K 质粒酶切体系 DDW 4.6μl DDW 7μl 10×H Buffer 1μl 10×H Buffer 1μl 目的片段 4μl pPI9K 质粒 1.6μl NotI quickcut 0.2μl NotI quickcut 0.2μl EcoRI quickcut 0.2μl(37℃15min) EcoRI quickcut 0.2μl(37 ℃15min)

细胞培养中无菌操作注意事项

体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌。每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。 【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面―次(拖布要专用).紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。―些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。 【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、 PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。

双酶切连接反应

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为个小时足已。3，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间350 U/μl 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设4个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功, 当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误. 阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。

无菌操作原则及注意事项

无菌操作原则及注意事 项 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

无菌操作原则及注意事项 无菌操作原则： 1、环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室应每天用紫外线消毒一次。 2、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。 3、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。 4、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。? 无菌操作间 四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 5、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。 6、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。 7、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。 无菌操作技术及注意事项 1、玻璃器皿的消毒和清洁

⑴新购玻璃器皿的处理 新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。 ⑵污染玻璃器皿的处理 ①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%～5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。 ②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。 ③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。 ④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。 2、无菌器材和液体的准备 将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压

酶切

DNA的酶切实验 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。一材料、试剂和仪器： 1 材料：质粒DNA 2 试剂：限制性内切酶、ddH2O 3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序： I. .单酶切： II. 双酶切： 注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 二. 结果与分析： 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析

实验2 酶切 片段回收和连接

酶切、片段回收与连接 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。 关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收 基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。 基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。 1 材料与设备 1.1 试供材料 大肠杆菌、质粒DNA 1.2 试剂准备 质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等 1.3 实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。 2 实验步骤 2.1 提取质粒DNA 这个步骤由老师完成 2.2 酶切