双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）
双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：https://www.sodocs.net/doc/4f12298124.html,/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
3、转化：
a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl
几个非常重要的问题
1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.
2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干
3对照的设立：
为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时,也要进行对照.
设4个:
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.
4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。
希望大家不断补充。
Ding一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
springwel wrote:
用2周重组了 14个质粒。
这个效率非常不错！佩服！
smartkevin wrote:
Ding一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
这个操作是什么原理？为什么要选择45C？
其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：
插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
springwel wrote:
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，
将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
[color=red]
但是公司给推荐的一般都是2。0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加0.5ul酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
smartkevin wrote:
其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：
插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。
mybbff wrote:
如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。
刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71）。
其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合。对于平末端应该就没有什么作用了。
autumnsun wrote:
但是公司给推荐的一般都是2。0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加0.5ul酶，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
如果100ul里的DNA太多了也不行啊，酶和DNA还是要匹配的
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在lamda DNA上的酶切位点数目。比如用HincII和XbaI双切pUC118，这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在lamda DNA上的酶切位点分别是35个和1个。根据酶活性的定义，相同单位的HincII和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1，所以在双酶切体系中，所用的HincII显然应该要少很多。
好！！！真实用！！！
“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.3pmol，后者取0.03pmol。”
是不是应该前者0.03，后者0.3啊？
精华！投你一票！
msher wrote:
好！！！真实用！！！
“回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.3pmol，后者取0.03pmol。”
是不是应该前者0.03，后者0.3啊？
已经改了,谢谢!
昨天14个测序结果出来，全部是阳性克隆。两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。回顾自己的实验现补充几点。
做转化时,也要进行对照.
设4个:
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始
质粒
C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.
就上面的对照简要说一下我的结果。转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆，约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。
下面简要的说一下对照的结果。
A 只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切
B 约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%
C 长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。
D 长了很多克隆，证明感受态没有问题。
这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。
JM108感受态细胞的制备
刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。后来干脆自己做，感觉质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。
前期工作
分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓‘磨刀不误砍材功’。
注意事项
1.不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种划板（AMP阴性）37
度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划S行。同时记得设立对照：A 、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，实验室很多材料从师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP阴性空白培基。系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑克隆。
2. 质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全量加到200微升的感受态里，约为150ng（载体0.1微克，目的片段约0.05微克）。效果也好。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的，好像是陇西化学制剂，分析纯。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
培养基的配制
1.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠l0g，加去离子水800ml充分搅拌溶解，用1mol/LNaOH调pH7.0，补加去离子水至1000毫升，高压灭菌，4度保存。我一般没有用1mol/LNaOH调pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠l0g加去离子水至1000ml。
2.LB固体培养基：LB液体培养基中加1.5%琼脂粉,高压灭菌消毒；
3.Amp母液：用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100 ug/ul溶液,置-20℃保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5支分装(浓度100mg/ml即100 ug/ul)。
4.含Amp的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半量则最终浓度为50ug/ml
有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通培基，效果也很好。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:我们实验室只有CaCl2-6H2O，分子量219，配制100ml的，则需称量
0.005×219=1.095g就可以了。其实氯化钙的摩尔浓度在0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 先配制成0.1mol/L的氯化钙溶液50ml，加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。有文献说要用0.22的滤器，其实完全没有必要。高压即可。
准备工作做好了，就可以开工了。
一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落,接种于3-10ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右（一般过夜）。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于10ml试管（如较多制备，多用几个试管即可）的LB液体（AMP阴性）培养基中同时做空的培基对照,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝
0.5左右。
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液分转入1.5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1.5ml的离心管中）,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液200微升轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟后,4℃下3000g 离心10分钟。
3、弃去上清,加入200微升预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、贮存于-70℃可保存半年。
要点：1.悬浮细胞时动作一定要轻柔；2 冰上。掌握者两点可谓掌握了制备感受态的精髓，无往不利。
我五月初做实验时遇到很多问题，那时是相当的郁闷。当时参考了很多战友有益的相关帖子，获益颇丰，
谢谢提供了这个交流平台。希望大家不断补充，纠正错误，知无不言，言无不尽。尽量让后来者少走弯路节约时间，尽量少过郁闷压抑没有成就感的日子。
常用限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点 AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点
BbvCI识别位点BbvI识别位点 BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点
BsiEI 识别位点BsiHKAI 识别位点BsiWI识别位点BslI 识别位点BsmAI识别位点 BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点
双酶切实验
双酶切概述 双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“se q”标注。 [编辑本段] 双酶切的注意事项 1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。 2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。 3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照： 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。 [编辑本段] 双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：
常用限制性内切酶酶切位点保护残基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
双酶切连接反应常见问题分析
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
如何添加酶切位点
当在引物5’端添加酶切位点时要考虑： a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。 b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。 如果不设计保护碱基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。 当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。PCR设计引物时酶切位点的保护? ?酶寡核苷酸序列切割率%?2 hr20 hr?Acc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 0 00 0?Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG0 >90 >900 >90 >90?Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA>90 >90 >90>90 >90 >90?Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA50 >90 >90>90 >90 >90?BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG10 >90 >9025 >90 >90?Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC0 75
>90 >90?BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA0 500 >90?BstE IIGGGT(A/T)ACCC010?BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0 25 250 50 >90?Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG0 >90 500 >90 50?EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG>90 >90 >90>90 >90 >90?Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA>90 >90 >90>90 >90 >90?Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG0 100 75?Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG0
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.
常用限制性内切酶酶切位点
AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点
AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI 识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点 BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点
BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点
(完整版)常用限制性内切酶酶切位点汇总,推荐文档
Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点
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酶切和连接5页
双酶切： 载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。 我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。 我的酶切体系如下： 质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng） (NEBlack Eye SfiⅠ1ul (NEBlack Eye BssHⅡ1ul 10×buf 2.2ul 100×BSA 0.2ul 水14.8ul 总体积20ul 50度，2小时。切出了370bp左右的片段，回收载体。 然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。50度3小时我试过，但是质粒有降解。酶量应该说是过量的。请问有什么办法可以酶切完全？ 粘性连接 （一）外源DNA和质粒载体的连接反应 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这
实验2 酶切 片段回收和连接
酶切、片段回收与连接 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。 关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收 基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。 基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。 1 材料与设备 1.1 试供材料 大肠杆菌、质粒DNA 1.2 试剂准备 质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等 1.3 实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。 2 实验步骤 2.1 提取质粒DNA 这个步骤由老师完成 2.2 酶切
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)
各种酶切位点的保护碱基 酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题 参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。 有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。 两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶
酶切位点设计和选择
引物设计原则及酶切位点选择和设计 [整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。 （一）设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 （二）设计引物所要考虑的问题 两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。我看promega的说明书上说，最好隔四个。还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 最好使用双酶切有共同buffer的酶。 最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。 Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。 Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。 其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。
双酶切编辑
双酶切编辑 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP 时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。 目录1简介 2连接反应 3注意事项 1简介编辑双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。 2连接反应编辑1、回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基
双酶切(1)
③双酶切处理目的片段和带有GFP的质粒并纯化 一、实验原理 1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定 碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，他们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH，由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术上受到广泛应用。在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。 2.DNA的酶切反应 II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。 3.DNA的连接 在T4 DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步： ①T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。 ②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷 化 ③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 二、实验器材与处理方法（参照） 1、限制性内切酶酶BUFFER GFP质粒 2、T4 DNA连接酶连接酶缓冲液 3、电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）10×电泳加样缓冲液 4、溴酚蓝琼脂糖溴化乙锭（工作浓度0.5ug/ml）EcoR I 5、酚氯仿无水乙醇70%乙醇灭菌双蒸水 6、1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭 菌）电泳仪电泳槽紫外检测仪摄影设备 7、恒温水浴槽 三、实验步骤 先将步骤②扩增的目的片段进行纯化（柱层析或电泳割胶法） 1.酶切反应（按情况加大反应体系） 取GFP质粒（DNA）样品于合适的离心管中，按照表1加入试剂 ↓ 混匀；4000rpm离心30s,甩至管底 ↓ 37℃（限制性内切酶最适水温）,保温1~3h酶切（酶切过夜则建议用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多酶切体系各组分浓度改变过大，记得根据不同酶切位点加保护碱基）
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine. ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^TCGAG 3' 当然，上面总结的这些肯定不全，要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法： 1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；NEB网站上提供的识别序列图表下载 2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；
常见限制性酶切位点
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）分子生物学实验室技术2009-11-17 17:46:32 阅读2235 评论2 字号：大中小订阅. 在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。 无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T载就不必考虑了）。先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5’端（英语怎么说？）。常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。 下面，我就总结了一些常用的内切酶的识别序列，仅供各位参考。下面这些内切酶都属于II型内切酶。 先介绍一下什么是II型内切酶吧。 The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine. ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AA TTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CA TGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3'