自由基清除剂
第五章自由基清除剂
本章要点
1.自由基理论的产生机理及来源
2.自由基对机体活动的影响
3.自由基清除剂的基本概念
随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。
自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。
近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。
第一节自由基理论
一、自由基的产生机理及来源
自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。
人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。
（一）自由基的产生
人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。
人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。
自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自
由基在扩展阶段没有消失或增加，那么反应中就有几条链。随着反应的进行，体系中的反应物浓度越来越低，自由基相互碰头的机会越来越多，反应速度就越来越慢，自由基越来越少，最后反应停止。由此可见，自由基反应动力学有别于普通的分子反应，自由基可以连续传递而出现连锁反应。
过氧化物作为引发剂可以使反应在较低温度下进行，如果反应体系中有自由基清除剂存在，它就能很快地捕捉自由基使扩散不能形成。活性强的自由基清除剂能阻止连锁反应的开始。因为氧分子与许多有机物反应时产生自由基，而自由基清除剂能捕捉过氧自由基而中断连锁反应，阻止有机物的氧化，所以自由基清除剂又称为抗氧化剂。
（二）自由基的来源
人体内特定的自由基有不同的来源。
超氧阴离子自由基（O2－·）在其中扮演着非常重要的角色，因为在反应顺序上其他许多活性中间产物的形成都始于与O2－·起作用。它是从黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶通过酶的一电子还原作用释放的氧产生的或由呼吸链裂解生成的。人体利用的氧气中约有1%～3%转化为O2－·。
过氧化氢分子（H2O2）也是一种重要的非自由基活性物，容易在活细胞中扩散。过氧化氢酶能有效地将其转变成水，生成氧自由基。
羟自由基（OH·）的活性最强，其半衰期估计为10-9秒，其产生后能迅速起反应。在射线等高能辐射下，通过体内水的均裂作用或经金属催化过程由内源的过氧化氢分子形成。紫外线能将过氧化氢分子分裂成两个羟自由基分子。
过氧基自由基的半衰期比较长，可达数秒，在生物系统中扩散的途径相当长。在脂质过氧化过程中，从多不饱和脂肪酸去掉一个氢原子开始，能形成过氧基自由基。羟自由基能启动这一反应过程。
脂质过氧化作用进一步产生烷氧自由基（RO·）和有机的氢过氧化物（ROOH），后者可能重排成为内过氧化物中间产物，然后分裂产生乙醛。
单线态分子氧（1O2）是另一种非自由基的活性物，可能是体内的组织暴露于光中形成的。其半衰期估计为10-6秒，具体时间取决于周围基质的性质。它能通过转移其激发态能量或通过化学结合与其它分子相互作用。单线态分子氧优先发生化学反应的靶为双键部位。
氧化氮自由基（NO·）也是一种很重要的自由基，它是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物，能松弛血小管平滑肌，防止血小板的凝集，从而降低血压。也可通过激活参与初级免疫的巨嗜细胞而产生。它的半衰期为6～50秒，很容易与氧发生反应，反应产物NO2也是自由基。它还能与生物分子直接反应或与O2－·结合形成过氧亚硝酸盐（ONOO－）。NO·过多会产生细胞毒性。
二、自由基对机体生命活动的影响
自由基是体内各种生化反应的中间代谢产物，在人体的生命活动过程中，各种生化反应，不管是酶促反应还是非酶促反应，都会产生各种自由基。从自由基的化学结构可以看出，它含有未配对的电子，是一类具有高度化学活性的物质。在正常的情况下，体内自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中，并在代谢中发挥着重要作用，参与一些酶和前列腺素的合成，增强白细胞吞噬活性，提高杀菌效果等。但是，如果自由基过多或清除过慢，则会对人体造成严重危害。
（一）自由基积极的生物学功能
自由基作为人体正常的代谢产物，对维持机体的正常代谢有特定的促进作用。这种促进作用主要表现在对机体危害物的防御作用。
1．增强白细胞的吞噬功能，提高杀菌效果
白细胞在吞噬细菌的过程中，对氧的消耗量激增，会产生大量的O2－·和H2O2，两者通过Haber-Weiss 反应还会进一步产生OH·，这些活性氧对病原菌都有很强的杀灭效果。OH·还可引发被吞噬细菌的不饱和脂肪酸降解，降解终产物丙二醛也是一种强力杀菌剂，足以致细菌死亡。
2．促进前列腺素的合成
前列腺素是人体内的一种重要的激素，它以花生四烯酸为前驱物质，经膜上多酶系统催化氧化生成，其生物合成途径中必须有氧自由基（OH·或O2－·）的参与。
3．参与脂肪加氧酶的生成
血小板脂肪加氧酶作用于花生四烯酸生成1，2-氢过氧化-5，8，11，14-碳四烯酸（12-HPETE）及其他相关的化合物，该类化合物是一系列具有强生物学活性化合物（如白三烯）的前体。在HPETE形成过程中有活性氧自由基参与。
4．参与胶原蛋白的合成
胶原蛋白的前体称原胶原蛋白。原胶原蛋白中的脯氨酸和赖氨酸经羟化酶的羟化作用是原胶原蛋白合成的关键步骤。在此酶促羟化过程中，需要O2－·、H2O2、OH·或1O2等活性氧自由基的参与。
5．参与肝脏的解毒作用
机体对外来毒物的解毒作用主要在肝脏进行，解毒作用实质是在肝微粒体细胞色素P450催化下对各类毒物的羟化作用。一定剂量范围内的外来毒物可被羟化并排出体外而完成解毒作用，当剂量大时，机体受不住就会出现中毒。在肝解毒过程中，连接于细胞色素上的O2－·自由基是真正起羟化作用的物质。
6．参加凝血酶原的合成
凝血酶原是凝血酶的前体。在凝血酶原合成过程中，其前体蛋白质氨基端的10个谷氨酸残基经过酶促羧化作用转变为10个γ-羧基谷氨酸残基，形成凝血酶原。该羧化过程与氧自由基密切相关，没有氧自由基的参加，就不能形成凝血酶原。
7．参与血管壁松弛而降血压
NO·是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物，还作为细胞松弛因子而松弛血管壁，降低血压。血管扩张剂（如乙酰胆碱等）启动一个钙调节受体，在NO·合成酶催化和NADPH参与下，氧化L-精氨酸的胍基生成NO·并释放到细胞外。接着活化可溶性鸟苷酸环化酶，使血管平滑肌与血小板中的cGMP水平增加，从而促进血管平滑肌松弛，抑制血小板凝聚和粘附到内皮细胞上。
8．杀伤外来微生物和肿瘤细胞
NO·和O2－·结合以后生成ONOO－阴离子，在略高于生理pH的碱性条件下相当稳定，从而允许其由生成位置扩散转移到较远的位置。一旦在低于生理pH的酸性条件下（病理条件下往往如此），ONOO－立即分解生成NO·和O2－·，这两种自由基的氧化性非常强，具有很大的细胞毒性，对于杀伤外来微生物和肿瘤细胞非常有意义。
然而，在生命活动中，由于经常受到各种外界不良因素的刺激，导致机体组织中的自由基数量往往过多，甚至对机体组织产生危害。
（二）自由基对生命大分子的损害
自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力，能通过氧化作用攻击体内的生命大分子，如核酸、蛋白质、糖类和脂质等，使这些物质发生过氧化变性、交联和断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体的组织破坏和退行性变化。
OH·是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基。它可和活细胞中的任何分子发生反应而造成损伤，而且反应速度极快，被破坏的分子遍及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等。
O2－·的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，由它引起的损伤表现在使核酸链断裂、多糖解聚及不饱和脂肪酸过氧化作用，进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化作用的改变及其他一系列的变化。
所有能产生O2－·的生物系统都能通过歧化反应生成H2O2，能使少数酶的-SH（巯基）氧化失活。因为H2O2能迅速穿过细胞膜，而O2－·不能，在细胞内的H2O2能与Fe2+或Cu2+ 离子反应生成OH·，另外紫外线也能使H2O2均裂生成OH·，这是H2O2毒性的真正原因。
1．自由基对核酸的损害
自由基作用于核酸类物质会引起一系列的化学变化。例如，氨基或羟基的脱除、碱基与核糖连接链的断裂、核糖的氧化和磷酸质键的断裂等。反应还会形成新的自由基，发生连锁反应，导致核酸碱基破坏，产生遗传突变，严重受损的不能修复，导致细胞死亡。
2．自由基对蛋白质的损害
自由基可直接作用于蛋白质，也可通过脂类过氧化产物间接作用于蛋白质而产生破坏作用。如过氧自由基（ROO·）可使蛋白质分子发生交联，生成变性的高聚物，其他自由基则可使蛋白质的多肽链断裂，
并使个别氨基酸发生化学变化。更严重的是，自由基可改变酶蛋白的化学结构，导致酶生物活性的丧失。
3．自由基对糖类的损害
自由基通过氧化性降解使多糖断裂，如影响脑脊液中的多糖，从而影响大脑的正常功能。自由基使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，导致DNA主链断裂或碱基破坏，还可使细胞膜寡糖链中糖分子羟基氧化，生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞免疫功能的发挥。
4．自由基对脂质的损害
脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受自由基的破坏，发生过氧化反应。磷脂是构成生物膜的重要部分，因富含多不饱和脂肪酸故极易受自由基破坏。膜中磷脂发生过氧化作用，会引起膜中蛋白质及酶的交联或失活，导致膜通透性的变化，严重影响膜的各种生理功能。亚细胞器膜磷脂所含的不饱和脂肪酸比质膜的还多，所以对过氧化反应更为敏感。如果细胞内线粒体膜被氧化受损，则会使能量生成系统受到影响。溶酶体膜若受到破坏则会释放出其中的水解酶系，会使细胞内多种物质水解，严重时甚至会造成细胞自溶，组织坏死。由此可见，若自由基对生物膜的破坏很严重，就会引起细胞功能的极大紊乱。
（三）自由基学说
人们根据对衰老机理的不同理解，提出了许多种衰老学说，主要有自由基学说、免疫功能下降学说、脑中心学说、代谢失调学说、生物膜衰老学说、脂褐素与衰老学说、衰老过程中基因淋巴因子及其基因表达改变的学说等。自由基学说能比较清楚地解释机体衰老过程中的种种症状，如老年斑、皱纹及免疫力下降等，是目前最有说服力的学说。
自由基学说认为，自由基的强氧化作用，损伤了机体的生命大分子，引起人体细胞免疫和体液免疫的功能减弱，最终导致免疫疾病的出现。其作用机理可概括为以下几个方面。
1．生命大分子的交联聚合和脂褐素的累积
自由基作用于脂质能发生过氧化反应，其氧化的终产物丙二醛等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，形成脂褐素。由于脂褐素不溶于水，所以不能随着机体的代谢排出体外，在细胞内逐渐堆积。其颗粒呈圆形或椭圆形，直径约为1~5微米，颗粒大小会随年龄的增大而增大。老年斑就是由脂褐素在皮肤的堆积而形成的，老年斑的出现是人体衰老的一个明显的外表象征。另外，随着胶原蛋白的交联聚合，会使胶原蛋白溶解性下降、弹性降低及水合能力减弱，会导致皮肤失去张力，皱纹增多，老年骨质再生能力减弱等。脂褐素在脑细胞中的堆积，会出现记忆力的减退或使智力发生障碍，甚至出现老年性痴呆症。眼球晶状体长期暴露于光和氧中，极易发生脂质氧化损伤，导致视网膜模糊，引起白内障和老年黄斑变性。
2．器官组织细胞的破坏与减少
器官组织细胞的破坏与减少是机体衰老的症状之一。器官组织细胞破坏或减少主要是由于自由基引起的脂质过氧化而造成对细胞膜与细胞器膜的损害，改变了生物膜的结构与功能，影响了膜的通透性与流动性，从而导致了膜功能的紊乱，加快机体的衰老。
另外，自由基作用于核酸引起的基因突变改变了遗传信息的传递，导致蛋白质与酶的合成错误及酶活性的降低。自由基还可与膜上的酶发生作用，影响细胞正常生理功能的发挥。自由基通过对脂质的侵袭加速了细胞的衰老进程。这些结果的积累，造成了器官组织细胞的老化与死亡。
3．免疫功能的降低
免疫功能是指机体抵抗外来有害物质入侵的能力。人体内的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫。自由基作用于免疫系统，会引起人体细胞免疫与体液免疫功能减弱，并使免疫识别力下降，免疫系统在攻击病原体和异常的细胞时，也侵犯了自身正常的细胞和健康组织而出现自身免疫性疾病。
有研究表明，弥散性硬皮病、系统性硬结、溃疡性结肠炎和成胶质病变等自身免疫性疾病往往伴有较多的染色体断裂现象，这类病人血液中有一种血清因子能够促进正常的淋巴细胞染色体发生断裂。自身免疫疾病的病变过程与自由基关系密切，其致病机理可能是由于特殊血清断裂因子的作用或细胞的氧化代谢而产生了大量的OH·和O2－·所致。
（四）自由基与疾病的关系
越来越多的临床和干预实验，以及来自基础研究的证据表明，自由基参与许多疾病的病理过程，从而
诱发如心血管疾病、某些癌症、老年白内障和黄斑变性、某些炎症及多种神经元疾病。
1．自由基与心血管疾病
大多数心血管疾病的主要原因是动脉粥样硬化，是动脉壁的一种多因素疾病。自由基攻击动脉血管壁和血清中的不饱和脂肪酸使之发生过氧化反应而生成过氧化脂质，后者能刺激动脉壁，增加粥样硬化的趋势。动脉硬化的程度与硬化斑中脂质过氧化程度呈正相关，血管内壁的蜡样物质就是脂质发生过氧化反应的直接证明。动脉粥样硬化的早期，在内皮下层间隙形成脂质沉淀，即所谓的脂肪条纹。随着年龄的增加，粥样硬化症呈增多的趋势，这与老年人动脉壁不饱和脂肪酸含量高，血清中Fe2+和Cu2+含量高，Fe2+或Cu2+通过Haber-Weiss反应促使OH·产生，OH·的存在加剧了脂质过氧化进程。过氧化产物丙二醛促使弹性蛋白发生交联，破坏了其正常的结构和功能，其应有的弹性与水结合能力丧失，最终产生了动脉硬化症，从而引起冠心病等其他心血管疾病。
2．自由基与癌症
致癌过程是一个复杂的多阶段的过程，包括诱发和促进两步。一个正常的细胞发生癌变必须经历诱发和促进这两个阶段，这就是两步致癌学说。
大量研究证明，诱发阶段与自由基关系密切，促癌阶段也与自由基有关，促癌能力与其产生自由基的能力相平行。致癌物必须在体内经过代谢活化形成自由基并攻击DNA才能致癌，抗癌剂也必须通过自由基形式去杀死癌症。
3．自由基与肺气肿
自由基作用于肺部的巨嗜细胞，使其释放了蛋白水解酶类而导致了对肺组织的损伤破坏，从而引起细支气管和肺泡管的破裂，肺泡间隔面积缩小，周围血液与肺之间气体交换量减少，导致肺气肿。
正常情况下，肺组织细胞间的蛋白酶与抗蛋白酶能够保持平衡，蛋白酶抑制剂控制着水解蛋白酶类的释放与活性。如果缺乏这种抑制剂，就有可能导致肺气肿。长期吸入香烟及其他大气中的污染物，会使肺中氧自由基增多，使水解蛋白酶增多和使水解蛋白酶的天然抑制剂失活，最终导致肺气肿的出现。
4．自由基与缺血后重灌流损伤
缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因。有许多证据说明，在完全性缺血、缺氧时，组织损伤程度较轻，而在缺血后再灌注时，由于自由基的急剧增多而使组织损伤更加严重。
在缺血后重灌流状态下，细胞内的氧自由基主要来自黄嘌呤氧化酶，它是由前体黄嘌呤脱氢酶转变而来的。该脱氢酶广泛存在于各种组织细胞中，它是以NAD+为电子接受体，所以不产生自由基。当组织细胞缺血时，ATP生成量减少，导致细胞内能量不足，不能维持正常的离子浓度。于是，Ca++重新分布使得细胞内Ca++浓度增大，激活了一种蛋白酶而将脱氢酶不可逆地转化成氧化酶。另外，缺血使得细胞内ATP 减少，AMP增多，AMP又可逐步分解成次黄嘌呤，而次黄嘌呤是氧化酶的适宜作用底物。当重灌流时，氧分子重新进入组织，与组织中积累的次黄嘌呤和氧化酶发生反应，生成大量的活性氧自由基。这些活泼且有强氧化性的自由基使细胞膜脂质过氧化，使透明质酸和胶原蛋白降解，从而改变了细胞的结构与功能，造成组织的不可逆损伤。另外，在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧了自由基对缺血后重灌流组织的损伤。
5．自由基与眼病
由自由基氧化损伤引起的视力损害，最常见的当数白内障和老年黄斑变性。
老年人由于全身机体的衰老使得眼球晶状体中自由基清除剂的含量与活性降低，导致对自由基侵害的抵御能力降低。许多事实表明，白内障的起因和发展与自由基对视网膜的损伤导致晶状体组织的破坏有关。
又由于眼晶状体长期暴露于光和氧中，所形成的活性氧类物质可能与晶体蛋白质起反应。受损的蛋白质可能聚合和沉淀，从而丧失原来的功能。视觉活性最高的视网膜组织易受损害，从而引起老年黄斑变性。
6．自由基与炎症
当局部氧量过少或外来病原菌侵袭时，大量多形嗜中性白细胞积聚在病变处。这些白细胞由特殊作用的代谢物激活，结合在膜上的NADPH2氧化酶被激活，氧化NADPH2成为NADP+，同时产生大量的O2－·。氧自由基一方面破坏病原菌和病变细胞，另一方面进攻白细胞本身而造成白细胞大量死亡，引起溶酶体酶的大量释放，进而杀伤组织细胞，造成骨、软骨的破坏，导致炎症和关节炎。
7．自由基与贫血
贫血的出现也与自由基有关。据研究表明，地中海贫血的病理变化包含红细胞膜的过氧化，膜上多不饱和脂肪酸含量减少，-SH转变成-S-S基团和维生素E含量减少。缺铁性贫血的病变过程也有自由基参与，因为此时红细胞的维生素E和过氧化酶含量减少，易被自由基破坏而缩短寿命。
8．自由基与癫痫
有关研究证明，癫痫活动伴有活跃的自由基反应。清除自由基，阻断自由基反应对癫痫的预防和治疗有一定作用。自由基反应在癫痫发生中的作用日益受到重视。
目前认为，老年性聋与自由基受损关系密切；自由基与糖尿病也有比较复杂的关系；大骨节病与克山病也有密切的关系。随着自由基理论的研究发展，许多人类重大疾病与自由基反应的关系正在逐步被揭示。自由基对人类健康的影响作用正在被更多的人所接受，越来越多的专家正在运用自由基理论，在确保人体健康方面的研究中取得较大的成果。
第二节自由基清除剂
一、自由基清除剂简介
自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中，人体内存在少量的氧自由基，不但对人体不构成威胁，而且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌，消除炎症，分解毒物。但如果人体内自由基的数量过多，就会对生物膜和其他组织造成损伤，破坏细胞结构，干扰人体的正常代谢活动，引起疾病，加速人体衰老进程。
在长期的进化过程中，生命有机体内必然会产生一些物质能清除这些自由基，将它们统称为自由基清除剂（Scavenger）。
自由基清除剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。自由基清除剂的种类繁多，可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。酶类清除剂一般为抗氧化酶，主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等几种。非酶类自由基清除剂一般包括黄酮类、多糖类、维生素C 、维生素E、β-胡萝卜素和还原型谷胱甘肽（GSH）等活性肽类。
自由基清除剂大多为抗氧化剂，通过清除作用降低活泼自由基中间体浓度，降低自由基连锁反应中扩展阶段的效率来控制自由基的生成。但有些抗氧化剂是通过抑制自由基引发剂（如某些金属元素）的产生而起作用的。自由基清除剂也不都是抗氧化剂，有些系统并未进行氧化作用。
自由基清除剂发挥作用必须满足三个条件：第一，自由基清除剂要有一定的浓度；第二，因为自由基活泼性极强，一旦产生马上就会与附近的生命大分子起作用，所以自由基清除剂必须在自由基附近，并且能以极快的速度抢先与自由基结合，否则就起不到应有的效果；第三，在大多数情况下，清除剂与自由基反应后会变成新的自由基，这个新的自由基的毒性应小于原来自由基的毒性才有防御作用。
这些自由基清除剂对维持机体的正常生命活动，保持健康起着重要的作用。但是，随着年龄的增长，机体内产生自由基清除剂的能力逐渐下降，从而减弱了对自由基损害的防御能力，使机体组织器官容易受损，加速了机体的衰老，引发一系列的疾病。为了防止此类现象的发生，可以人为地由膳食补充自由基清除剂，从而达到防御疾病、延缓衰老的目的。
二、酶类自由基清除剂
（一）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）
超氧化物歧化酶（SOD）是目前研究得最深入、应用得最广泛的一种酶类自由基清除剂。
1．种类、结构及分布
1968年，美国人McCord在Fridovich指导下，从牛红细胞中提取Cu·Zn的酶蛋白质，并发现它能催化O2－·歧化，所以把这种酶蛋白命名为超氧化物歧化酶，英文简称为SOD。
SOD存在于几乎所有靠氧呼吸的生物体内，包括细菌、真菌、高等植物、高等动物和人体中。SOD
是一类含金属的酶，按其所含金属辅基不同可分为含铜锌SOD（Cu·Zn-SOD）、含锰SOD（Mn-SOD）和含铁SOD（Fe-SOD）3种。
含铜锌金属辅基的Cu·Zn-SOD是最为常见的一种酶，主要存在于真核细胞的细胞质中或高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙中。在动物血液、牛肝、猪肝、牛心、豌豆、麦叶等动植物组织中均有存在，是目前应用最广泛的一类酶。该酶由两条肽链组成，每条肽链含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
Fe-SOD主要存在于原核细胞中，一些真核藻类甚至高等植物如银杏、柠檬、番茄等组织内也有存在。此酶也由两条肽链组成，一般每个二聚体含有一个铁原子。
Mn-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中，在植物的叶绿体基质、类囊体内也会存在，在人体肝脏中含量较高。此酶的纯品呈粉红色，由两条或四条肽链组成。
2．理化及生物学特性
SOD属酸性蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。又由于SOD属于金属酶，其性质不仅取决于蛋白质，还取决于结合到活性部位的金属离子。三类SOD的活性中心都含有金属离子。如采用物理或化学方法除去金属离子，则酶活丧失；如重新加上金属离子，则酶活又恢复。
不同来源的Cu·Zn-SOD具有较高的同源性，它们的物化特性也很相似，据推测它们可能由同一原始酶进化而来。不同来源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性质和较高的同源性，它们可能由另一原始酶进化而成。
SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，对氧自由基有强烈清除作用，特别对于超氧阴离子（O2－·），SOD可将其催化歧化而生成H2O2和O2，故SOD又称为清除超氧阴离子自由基的特异酶。
3．SOD的生理功能及应用
SOD作为功能性食品基料的生理功能主要有以下几方面。
（1）清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基，保护DNA、蛋白质和细胞膜免遭O2－·的破坏作用，减轻或延缓甚至治愈某些疾病，延缓因自由基损害生命大分子而引起的衰老现象，如延缓皮肤衰老和老年斑的形成等；
（2）提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力，增强机体对烟雾、辐射、有毒化学品及医药品的适应性；
（3）增强人体自身的免疫力，提高人体对自由基受损引发的一系列疾病的抵抗力，如炎症、肿瘤、白内障、肺气肿等，治疗由于免疫功能下降而引发的疾病；
（4）清除放疗所诱发的大量自由基，从而减少放射对人体其他正常组织的损伤，减轻癌症等肿瘤患者放化疗时的痛苦及副作用；
（5）消除疲劳，增强对剧烈运动的适应力。
因此，具有清除自由基功能的SOD就成为医学、食品和生命科学等领域研究的热点。
目前，SOD已广泛地应用于人们生活的各个方面。如深受女性消费者喜爱的化妆品中有大宝SOD、康妮SOD 、SOD 康舒达霜剂等。SOD添加于化妆品有明显的防晒效果和抗炎作用，可有效防止皮肤受电离辐射（如紫外线）的损伤。
SOD在医疗上的应用更是不胜枚举，它尤其对治疗关节炎和类风湿性关节炎疗效显著。此外，SOD 对治疗癌症、缺血后重灌流损伤、肺气肿、白内障、糖尿病、贫血等疾病均有疗效。
SOD在食品方面的应用也极为广泛，可作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂，有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。国外把SOD作为食品添加剂应用到口香糖和饮料中。国内也开发出了多种强化SOD的食品，如SOD雪糕、SOD豆奶、SOD啤酒、SOD果汁饮料、SOD的酸奶和SOD口服液等。还可用富含SOD的原料加工制成功能性食品，如大蒜饮料、刺梨SOD汁等。在人们越来越注重健康饮食的今天，SOD将成为功能食品中的活跃分子。
然而，SOD作为一类高分子抗氧化酶，分子量在32000道尔顿以上，又都带有金属辅基，且其来源大多从动物血（猪血、牛血）和动物脏器以及某些微生物中制备而来，多为生物种属差异很大的异源性蛋白。
因此，在应用上，它除了具有严格的针对性和有效性外，必然也有很大的局限性。SOD应用的局限性归纳起来主要有8个方面：
（1）半衰期短。SOD的体内半衰期为6～8分钟，体外半衰期（25℃时）为9～10天。因此，体内注射表现为多次数、少浓度，体外涂抹则表现为高剂量、低效应；
（2）代谢速率快。SOD在体内代谢速率极快，注射6小时后，90%以上的大分子SOD经降解为小分子而随泌尿系统排泄；
（3）酶分子量大，均在32000以上。其中，原核细胞Mn-SOD分子量为40000；真核细胞线粒体Mn-SOD 都由9个相等亚基组成，其分子量为80000。因此，透皮或透膜吸收困难，体内或细胞内作用弱；
（4）酶制剂不宜口服，口服易被胃酸变性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破坏，且SOD分子原形不易透过肠粘膜，因而难以发挥全身性药效作用；
（5）大分子异性蛋白，不宜大剂量、长时间使用，否则会不可避免地出现某些过敏性变态反应，呈现明显的不良反应性变化；
（6）对靶细胞或靶部位的亲和力低，药用趋向性不明显。因此，对疾病的疗效缺乏特异性作用；
（7）酶的稳定性不高，对理化因素较为敏感，过高温度、过大剂量辐射、过长时间超声波、过强酸碱度、过多化学物质及变性剂、还原剂等均易导致SOD分子结构改变，酶活性丧失，形成不可逆性变化；
（8）药物作用单一性大、常规剂量单独使用疗效欠佳。
针对SOD应用过程中客观存在的局限性，国内外学者进行了大量卓有成效的研究工作，并已逐步探索或寻找出解决上述局限的一些有效方法和对策。
4．SOD的制备
SOD广泛存在于动、植物和微生物体内，但目前我国主要是从动物血液中提取。受到血源和得率的限制，影响了SOD的生产成本和推广应用。
由于利用微生物（深红酵母）生产SOD具有易培养、易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限制等优越性，因此，微生物SOD的生成具有更广阔的发展前景。其工艺流程如下：
菌体培养→破壁→菌体破片→Rnase酶解、离心30分钟→清液→上DE32柱→L NaCl 洗脱→洗脱液→加45%（NH4）2SO4、离心→上清液→上DE32柱→洗脱→洗脱液→浓缩→冷冻干燥→SOD成品。
破菌的方法可采用超声波处理法、酶裂解法、细胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根据有关的研究表明，用甲苯法破壁对提取酵母SOD具有一定的优越性。另外，为了提高SOD纯度，在洗脱时可采用梯度洗脱法。
5．SOD的纯度检查
SOD产品一般为浅绿色冻干粉，其纯度的检查主要根据以下三个指标。
（1）均一性
通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查其均一性。也可用琼脂糖凝胶电泳，其操作简单，试剂单一且色带的间隔比前者大，更易观察与分析。还可进行超离心分析来检查其均一性。
（2）酶的比活
要求达到一定的标准。如：化妆品用SOD比活≥3000u/mg蛋白质；口服用SOD比活≥3500u/mg蛋白质；标准（活性测定用）及药用SOD比活≥5000u/mg蛋白质；试剂用SOD（电泳纯）比活≥8000u/mg 蛋白质。
（3）酶的重要理化性质
最重要的是金属离子含量（常采用原子吸收分光光度法测定）、氨基酸含量和吸收光谱。如Cu·Zn –SOD 中1分子的酶必须含有相当于两原子Cu和两原子Zn；虽然不同来源的酶所含的氨基酸不完全一致，但仍然显示一定的规律；三种SOD都有特定的吸收光谱，观察纯酶的吸收光谱有助于判断SOD的纯度。
6．SOD的（活性测定）分析方法
一般分为直接法和间接法两大类。
直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器，在一般试验室无法使用。间接法需借助超氧自由基产生
剂和超氧自由基清除指示剂两种物质。其中常用的产生剂包括最早使用的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、邻苯三酚及近年发展起来的非酶体系的NADH-PMS、核黄素-TEMED、碱性二甲基亚砜、HXT-01050；清除指示剂则有最早发现的细胞色素C、NBT，到近年来的鲁米诺和MTT等。
间接法中比色法最为常用，如黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法和邻苯三酚自氧化法。这两种最为普及的方法多年来不断得到改进，其灵敏度也不断得到提高。另外，近年来新建立了多种方法，如化学发光法、光化学法、极谱氧电极法、免疫法等。其中化学发光法与极谱氧电极法由于方法简便、灵敏度高，受到人们的青睐。
（1）黄嘌呤氧化酶（XO）- 细胞色素C法
国外多以该法测定SOD活性。在SOD被发现之初就是利用此法进行测定的，又称之为McCord法，被认为是间接法中的经典方法。酶活性单位定义为：在一定条件下，3ml反应液中，每分钟抑制氧化型细胞色素C还原率达50%的酶量定为一个活力单位。
McCord法灵敏度较低，但采取以下措施可得到提高:
①用乙酰化细胞色素C替代细胞色素C，可将灵敏度提高一倍，而且使测定结果不受样品中细胞色素C氧化酶的影响；
②将，L磷酸缓冲液换成的碳酸缓冲液，并将黄嘌呤浓度从mmo1/L 增至mmo1/L ，灵敏度可提高10倍；
③预先将黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶溶液在25℃下保温10分钟，使O2－·产量达到稳定程度，即O2－·产生率与其自动歧化率达到平衡，灵敏度增加可高达710倍；
④利用FP9平行分析仪可进行半自动分析，快速、简便，可以同时测定多个样品。
（2）邻苯三酚自氧化法
国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法（简称Marklund法），Marklund法是采用420nm处光吸收测定。酶活力定义为：在一定条件下1ml的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在420nm波长的自氧化速率达50%的酶量定为一个活力单位。
该方法经过不断改进，操作更为简便、灵敏度更高。如将吸收波长由420nm改用325nm，测试灵敏度提高了倍，称为微量邻苯三酚自氧化法，同时将邻苯三酚耗量减少一半；
Marklund法的另一缺陷是呈色反应与光吸收值的测定必须同步进行，因此样品池必须保持恒温，且不能同时处理多个样品。通过使用二硫苏糖醇（DTT）或L-抗坏血酸（VC ）作为终止剂，使反应暂时停止，使A420在一定时间内保持恒定，可同时测多个样品，有较高的重复性和回收率。同时，终止剂既不参与，也不影响邻苯三酚的呈色反应，自氧化曲线与经典法的相吻合，最大抑制百分比和灵敏度也基本一致。
另外，为消除HCl对SOD的抑制作用，改用K2HPO4- KH2PO4缓冲液替代Tris - HCl缓冲液，灵敏度可提高50%。
（3）化学发光法
化学发光法依据的原理是：O2－·可与化学发光剂鲁米诺（luminol）反应，产生激发态产物，当其迅速返回基态时，即发出光。SOD可消除O2－·，从而使发光强度降低，SOD浓度与发光百分率在一定时间内呈线性关系。活力单位定义为：在一定条件下，使每毫升反应液于1分钟末发光率被抑制50%的酶量作为一个酶活力。
同传统的比色法相比较，化学发光法专一性较强，其他干扰因素少，灵敏度高，最适用作粗提取液中SOD活性的检测。
（4）极谱氧电极法
比色法测定的呈色反应往往不稳定，因此测定结果波动很大。极谱氧电极法利用了系统产生O2－·过程中消耗O2，一定量的SOD又会使O2－·歧化产生O2，从而使耗氧量减少的特性，使用极谱氧电极仪精确测出耗氧量而推算出酶活。SOD活力单位定义为：25℃，，使每分钟产生1μl O2的SOD量定为1个酶活力单位。
该方法利用了O2张力的变化，与所用试样的物理状态如澄清度、是否胶体或悬浊液、有无颜色等无关，尤其适用于各种组织匀浆。而且由于直接测定O2量，方便、快速、微量化、灵敏度高、重复性好，
且可自动连续记录酶作用过程的变化。
除了以上几种方法，其他方法如光化学法（正染法）等方法也都得到不断的改进；而灵敏度、特异性均高于一般化学法的免疫法在医学上也得到应用，并取得了很好效果。同时计算机也开始用于SOD的活性分析，并有用于SOD酶活力线性分析的专用软件，可适用于各种产O2－·系统、各种清除剂系统及不同的酶提取液的活力测定。
（二）过氧化氢酶（catalase，CAT）
过氧化氢酶是另一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT 作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。
几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。
CAT是红血素酶，不同的来源有不同的结构。在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。
自1937年首次推出作为细胞内结晶化酶之一的牛肝过氧化氢酶之后，已利用不同方法（选择性沉淀法和层析法）从牛、马或人的红细胞、肝和肾中提纯过氧化氢酶。从不同机体分离出的大多数过氧化氢酶的分子量为240kDa，并具有4个相同的亚单位，在其活性部位各含一血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有4个紧密结舍的NADPH分子，但其功能尚有争议。
常用的CAT酶活性测定方法有以下几类：
（1）分光光度法包括钼酸铵比色法、紫外速率直接法和改良比色法等。其中改良比色法简便，快速，显色稳定，重复性好，不需特殊试剂及仪器设备，适合一般实验室采用，但生物样品常会造成干扰；
（2）化学发光法鲁米诺（luminol）在一定条件下与H2O2及Co2+等金属离子共存时发出强烈的蓝光，当样品中有CAT存在时，基质的H2O2将被分解，由H2O2所引起的化学发光强度减弱，由此计算总CAT酶活性。化学发光法易受试剂配制、操作技术和条件及测定时间等多种因素影响，但经过方法改进，可排除各种不良因素对测定的影响，是一种简单灵敏、重复性好、特异性也较高的化学发光技术测定方法；
（3）极谱法溶液中两个电极间加以一定的电压（极化电压）后产生可测电流，极谱法是应用氧电极，通过测量这种电解电流量以测定溶质的方法。当反应体系中含有一定浓度的过氧化氢时，加入一定量的含有过氧化氢酶的样品，过氧化氢就被分解而产生氧气，记录仪上可显示出反应室中氧量增加，增加的程度与加入液体中酶的活性成正比。该方法广泛用于生化方面的研究工作；
（4）滴定法包括:①过硼酸盐底物法：在中性水溶液中，CAT催化过硼酸盐还原成硼酸盐，同时释出氧。经过一定时间后，加入硫酸使酶失活，以中止反应，用高锰酸钾溶液滴定残存的过硼酸盐，结果反映CAT活性；②过氧化氢滴定法；一定量的细菌同一定量的H2O2发生反应，经过一定时间后加酸中止反应，然后用高锰酸钾滴定剩余的H2O2量，从而测定细菌过氧化氢酶的活性。
（5）检压测定法在一定pH的缓冲液中，过氧化氢酶作用于过氧化氢释出氧气。此反应非常迅速、剧烈，在不断搅拌、震荡及减压的条件下，所产生的氧气得以迅速逸出溶液，在一定容量的容器内产生压力变化，压力变化数值可换算成产氧量，用来表示样品过氧化氢酶的活性。
（三）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它于1957年被Mills首先发现，但直到1973年才由Flohe和Rotruck两个研究小组确立了GPX与硒之间的联系。
研究表明，硒是谷胱甘肽过氧化酶（Se-GPX）的活性成分，是GPX催化反应的必要组分，它以硒代半胱氨酸（Sec）的形式发挥作用，摄入硒不足时使Se-GPX酶活力下降。在体内处于低硒水平时，活力与硒的摄入量呈正相关，但到一定水平时，酶活力不再随硒水平上升而上升。Se-GPX存在于胞浆和线粒体基质中，它以谷胱甘肽（GSH）为还原剂分解体内的氢过氧化物，能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，并使过氧化氢分解成醇和水，因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化损伤。它同体内的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）一起构成了抗氧化防御体系，因而在机体抗氧化中发挥着重
要作用。
机体在正常条件下，大部分活性氧被机体防御系统所清除，但当机体产生某些病变时，超量的活性氧就会对细胞膜产生破坏。机体消除活性氧O 2－·的第一道防线是超氧化物歧化酶（SOD），它将O2－·转化为过氧化氢和水，而第二道防线是过氧化氢酶（CA T）和GPX。CAT可清除H2O2，而GPX分布在细胞的胞液和线粒体中，消除H2O2和氢过氧化物。因此，GPX、SOD和CAT协同作用，共同消除机体活性氧，减轻和阻止脂质过氧化作用。
GPX广泛存在于哺乳动物的组织中，不同种类的GPX其分子量和比活性也有所不同。谷胱甘肽是此酶的特异性专一底物，而氢过氧化物则是非专一性底物。
GPX的活力测定常采用5，5′-二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）法，用单位时间内催化GSH氧化的减少量表示。GSH可和二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）反应生成黄色的5-硫-2,2-硝基苯甲酸阴离子，在412nm处有最大光吸收，测定该离子的浓度，即可计算出GSH减少的量。由于上述反应在非酶条件下仍能进行，故计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少量。
三、非酶类自由基清除剂
（一）维生素类
维生素不仅是人类维持生命和健康所必需的重要营养素，还是重要的自由基清除剂。对氧自由基具有清除作用的维生素主要有维生素Ｅ、维生素Ｃ及维生素Ａ的前体β-胡萝卜素。
维生素Ｅ又称为生育酚，是强有效的自由基清除剂。它经过一个自由基的中间体氧化生成生育醌，从而将ROO·转化为化学性质不活泼的ROOH，中断了脂类过氧化的连锁反应，有效地抑制了脂类的过氧化作用。维生素Ｅ可清除自由基，防止油脂氧化和阻断亚硝胺的生成，故在提高免疫能力，预防癌症等方面有重要作用，同时在预防和治疗缺血再灌注损伤等疾病有一定功效。
维生素Ｃ又称为抗坏血酸，在自然界中存在还原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗坏血酸两种形式。抗坏血酸通过逐级供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，在转化的过程中达到清除O2-·、·OH、ROO·等自由基的作用。维生素Ｃ具有强抗氧活性，能增强免疫功能、阻断亚硝胺生成、增强肝脏中细胞色素酶体系的解毒功能。人体血液中的维生素Ｃ含量水平与肺炎、心肌梗塞等疾病密切相关。
β-胡萝卜素广泛存在于水果和蔬菜中，经机体代谢可转化为维生素Ａ。β-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，能通过提供电子，抑制活性氧的生成，从而达到防止自由基产生的目的。许多试验表明，β-胡萝卜素能增强人体的免疫功能，防止吞噬细胞发生自动氧化，增强巨噬细胞、细胞毒性Ｔ细胞、天然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀灭能力。在多种食品中，β-胡萝卜素与不饱和脂肪酸的稳定性密切相关。
有实验证明老年人摄入维生素C以及维生素E可以增进多项免疫功能，维生素C-E联合物还可清除血液中的自由基等有害物质和循环应激激素。除此之外，维生素C、维生素E以及?胡萝卜素等抗氧化性维生素可以延缓老龄化进程，还可以预防和治疗许多老年疾病，如动脉粥样硬化、高血压、心脏病和脑卒中等，这些疾病都与低密度脂蛋白胆固醇的氧化有关。
维生素C还能有效保护维生素E和?-胡萝卜素不被过早消耗。每天摄入500毫克维生素C可以帮助高血压患者降低血压。摄入维生素E不但可增强老年人的记忆力、预防老年痴呆症及治疗受自由基所累的迟缓型运动障碍，还可预防前列腺癌的发病、抑制消化道肿瘤（尤其是肠癌），并降低其死亡率。短期、大剂量地肠内补充维生素E 还可调整单核细胞、巨噬细胞对内毒素的反应，提高维生素E对于败血症、缺血再灌注损伤均能起到保护性的治疗作用。
健康人可以通过日常均衡的膳食摄取充足的维生素，但在机体受到感染、体力活动增加、服用特殊药物、体液大量丢失及妇女怀孕和哺乳等情况下，机体对维生素的需求大大增加，不额外补充，则易导致维生素缺乏，自由基损伤机体，诱发或加速其他疾病。
（二）黄酮类化合物
黄酮类化合物泛指两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列C6-C3-C6化合物，主要是指以2-苯基色原酮为母核的一类化合物，在植物界广泛分布。黄酮是具有酚羟基的一类还原性化合物。在复杂反应体系中，由于其自身被氧化而具有清除自由基和抗氧化作用。其作用机理是与Ｏ2-·反应阻止自由基的引
发，与金属离子螯合阻止·OH的生成，与脂质过氧化基ROO·反应阻断脂质过氧化。
黄酮及其某些衍生物具有广泛的药理学特性，包括抗炎、抗诱变、抗肿瘤形成与生长等活性。黄酮在生物体外和体内都具有较强的抗氧化性，具有许多药理作用，对人的毒副作用很小，是理想的自由基清除剂。目前已发现有4000多种黄酮类化合物，可分为如下几类：黄酮、儿茶素、花色素、黄烷酮、黄酮醇和异黄酮等。
很多常用中草药的活性成分是黄酮类化合物，其提取物芦丁、芒果甙、青兰甙、双氢青兰甙、芸香甙、橙皮甙和黄苓甙等均已应用于临床。以黄酮类化合物为主要成分的银杏叶提取物（EGB）已被广泛应用于医药和功能性食品行业。研究表明：EGB在治疗心血管疾病，调节血脂水平，治疗脑供血不足和早期神经退行性病变等方面有良好的疗效。另外，很多天然药物或食物中的某些功效成分，同样对氧自由基具有清除作用，如丹参中的丹参酮，黄苓中的黄苓甙，五味子中的五味子素，黄芪中的黄芪总黄酮、总皂甙、黄芪多糖，灵芝、云芝、香菇、平菇等菇类的多糖，甘草中的甘草酸，竹叶（紫竹、高节竹、金毛竹、花哺鸡竹、红哺鸡竹、斑竹等）中的黄酮类组分，麦麸中的膳食纤维等。而另外一些天然食物如坚果、葡萄的皮和籽、薯类、蜂胶等，虽然未能确定其起作用的功效成分，但仍可通过试验揭示其对氧自由基有明显的清除作用。
儿茶素是从茶叶中提取出来的多酚类化合物-茶多酚（Tea Polyphenols，简称TP）的主体成分，约占茶多酚总量的60%～80%，茶干重的12%～24%。作为茶多酚中含量最高、药理作用最明显的组分，已引起了广泛的重视。大量体外实验及动物试验证实，儿茶素具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、防辐射、防龋护齿、抗溃疡、抗过敏及抑菌抗病毒等作用，是一种优良的天然抗氧自由基清除剂。茶多酚溶液清除羟自由基活性大于VC溶液。茶多酚为羟自由基清除剂，茶多酚的主要成分儿茶素在清除自由基过程中扮演了重要的角色。大量的研究表明：儿茶素氧化聚合物也是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，具有抗癌、抗突变、抑菌、抗病毒，改善和治疗心脑血管疾病，治疗糖尿病等多种生理功能。其在食品、医药保健等领域的作用越来越突出。作为儿茶素氧化聚合物的茶色素治疗冠心病的作用机制在于提高SOD活力和降低MDA含量，削弱脂质过氧化作用，增加供氧和供血能力。茶色素对高血压的预防和缓解作用也是通过提高SOD活力、增强机体的抗氧化能力而实现的。
原花青素是一种多酚类化合物，这种化合物在酸性介质中加热均产生花青素，故将这类物质命名为原花青素。原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，分二聚体、三聚体直至十聚体。二至四聚体为低聚体，五聚体以上为高聚体，其中二聚体分布最广。原花青素是一种天然有效的自由基清除剂，主要存在于葡萄、苹果、可可豆、山植、花生、银杏、花旗松、罗汉柏、白杨树、刺葵、番荔枝、野草萄、高梁等植物中。此外，葡萄汁、红葡萄酒、苹果汁、巧克力和啤酒中也含有原花青素。原花青素多为水或乙醇提取物，少数经离子交换纯化，用冷冻或喷雾干燥成淡棕色粉末，味涩，略有芳香。分离后的原花青素二聚体、三聚体可以清除各种氧自由基，从而具有抗氧化、降血压、抗癌等多种药理活性，能增强免疫、抗疲劳、延缓衰老等功效。
异黄酮类作为一种有效的抗氧化剂国内外已有很多报道。大量实验研究结果表明：异黄酮是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂。
（三）微量元素
除了上述的各种酶及维生素类、黄酮类化合物，许多微量元素也起到清除自由基的作用。
1.硒
硒是一种非常重要的微量元素，是硒谷胱甘肽过氧化酶的活性成分，Se-GPX存在于胞浆和线粒体基质中，能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，并使过氧化氢分解成醇和水，摄入硒不足时使Se-GPX酶活力下降，在体内处于低硒水平时，Se-GPX活力与硒的摄人量呈正相关，但到一定水平时，酶活力不再随硒水平上升而上升。有人曾对糖尿病大鼠补充硒和维生素E，其GPX和超氧化物歧化酶（SOD）活性均有不同程度增加，而脂质过氧化产物丙二醛含量随之下降，可能是因为抗氧化酶蛋白与葡萄糖的糖化反应受到硒和维生素E的抑制而使抗氧化酶活性得到保护。另外，高糖环境中增加的糖基化蛋白会自动氧化产生大量自由基，而引起一系列连锁氧化过程，硒和维生素E的抗氧化性可阻断这一过程中的某些环节。
2.锌
锌在清除自由基的过程中也起到很重要的作用。锌能减少铁离子进入细胞并抵制其在羟自由基引发的链式反应中的催化作用，锌也能终止自由基引起的脂质过氧化链式反应。锌可与铁竞争从而抑制了脂质过氧化的多个环节，它们通过竞争与膜表面结合的位点，可使铁复合物产生减少，通过Hater-Weiss反应产生·OH减少，造成脂类转变为活性氧的链式反应被抑制。缺锌还可以显著降低GPX的活性。由于锌可以激活体内的GPX，锌缺乏使体内有活性的GPX数量减少，也由于锌缺乏导致的过氧化脂质生成增多，而使GPX消耗增多，导致其活性下降。锌还有稳定细胞膜的作用，由于锌与红细胞膜结合，抑制了膜脂质过氧化过程中所产生的自由基，从而降低了自由基对膜的损伤。锌作为超氧化物歧化酶的辅酶，催化超氧离子发生歧化反应。锌缺乏可以显著降低Cu/Zn-SOD的活性，而使Mn-SOD活性代偿性升高。但当缺锌严重时，Mn-SOD活性的代偿性升高仍然对自由基有抑制作用，且随浓度增加而抑制增强。锌可以诱导体内硫蛋白的产生而抵制自由基的损害，锌与抗氧化剂鳌合，其抗氧化作用增强。
3.铜
Cu/Zn-SOD的活性中心是铜，铜蓝蛋白中含有血清铜的大部分，是细胞外液重要的抗氧化剂。铜蓝蛋白的抗氧化作用主要是防止过渡金属Fe2＋和Cu2＋催化H2O2形成·OH。铜蓝蛋白具有铁氧化酶的活力，能将Fe2＋氧化成Fe3＋，防止Fenton反应的发生。
4.铁
铁是过氧化氢酶（CA T）的活性中心，体内三分之二的铁存在于血红蛋白中，血红素缺乏，CA T活性下降。但活性铁是脂质过氧化的催化剂，脂质过氧化启动反应所产生的脂烷基与氧反应，产生脂烷过氧基。这些自由基再度作用于脂质，使反应以链式不断进行，脂质过氧基的性质非常活跃，而造成细胞成分的损害。
5.锰
锰是体内多种酶的组成成分，与体内许多酶的活性有关。锰与铜同样是超氧化物歧化酶（SOD）的重要组成成分，在清除超氧化物、增强机体免疫功能方面产生影响。Mn-SOD是体内自由基清除剂。对人来说，胚胎和新生儿体内的Mn-SOD含量高于成年人，随着机体衰老，其含量逐步下降。老年色素斑中脂褐素在细胞内的形成和聚集与Mn-SOD有关。因此，锰的抗衰老作用主要与体内Mn-SOD有关。
6.锗
有机锗能降低脂质过氧化，保护细胞质膜，降低血浆、肝、脑等组织中过氧化脂质水平。
（四）类胡萝卜素
四、富含自由基清除剂的食品
随着人们对自由基理论的了解，越来越多的人开始关注能够清除自由基的功能食品。食品专家们也对此进行了积极的研究和探索。目前，对此类食品的研究大致有两个方向。一是从天然动植中提取有效成分，添加于各种饮料或固态食品中作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂。目前已有添加SOD的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮类等类型的功能性食品面市。二是利用微生物发酵或细胞培养，得到自由基清除剂含量丰富的产品。
在许多天然动植物中含有抗自由基的活性成分。如姜含挥发油和姜辣素，其成份有姜酚、姜酮和姜烯酚。绿茶的主要成分茶多酚，银杏、竹叶的有效成分黄酮和酚类，各种果品蔬菜中的维生素，还有一些中药如白首乌、五味子、葛根、小叶女贞、柴胡、车前子等也含有多种活性成分。另外，党参、灵芝等真菌中的多糖也是有效的活性成分。在动物的肝脏等器官，血液中也可提取有关的活性成分。
利用微生物发酵或细胞培养生产功能因子，也是目前研究的热点。如在固体培养基上人工培育冬虫夏草，由预处理的大豆经少孢根霉短期固态发酵生成丹贝异黄酮，用大蒜细胞培养或深红酵母生产SOD。这些方法不受气候、季节的限制，可实现工业化的连续生产。
二十一世纪，有利于确保人类健康的功能性食品将是食品行业发展的重点。关于自由基清除剂的深入研究，对预防和治疗人类的许多疾病，以及对各类保健食品生产方面均具有指导意义。随着研究的深入，将有更多更有效的自由基清除剂被开发和利用，将会进一步推动功能性食品行业向前发展，为保障人类的
身体健康作出更大贡献。
思考题
1.自由基理论的核心内容是什么？
2.自由基对人体有哪些危害？怎样消除或减少这些危害？
3.什么叫自由基清除剂？各有哪些种类？
4.SOD在食品中有哪些应用？
5.微量元素与自由基清除剂有什么关系？
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羟基自由基清除注意事项
一般而言，对于Fenton试剂与有机化合物氧化能力的影响因素大致上可分为： A.亚铁离子浓度。 B.过氧化氢浓度。 C.溶液于反应时的反应温度。 D.溶液中的pH值。 以下将对此四项变因做详细的探讨： A.亚铁离子浓度的影响 在Fenton试剂的反应中，亚铁离子主要是扮演着催化过氧化氢的角色。因此，若溶液中没有亚铁离子当触媒，则其溶液可能就没有氢氧自由基的生成。所以，大致上分解反应会随亚铁离子的浓度增加而加快，亚铁添加量会影响脱色效率，亚铁剂量愈高效果愈佳，此原因为增加亚铁剂量将使氧化反应更加完全并且可产生混凝机制而进行脱色(26)。但亚铁离子本身会与有机物形成竞争，亚铁离子浓度过高会增加氢氧自由基的消耗，反而造成处理效果的下降，反应式如下： Fe2+ + ·OH Fe3+ + OH- 故当浓度到达某一定值时，则其分解速率便不会在随着亚铁离子浓度的增加而持续加快，且亚铁离子浓度和生成物的比值也将可能会影响生成物的分布。一般而言，亚铁离子浓度皆维持在亚铁离子与其反应物之浓度比值为1：10-50(wt/wt)。 此外，亚铁在Fenton程序中除了扮演催化过氧化氢的角色外，亦具有混凝的功能，因此过量的铁离子加入将会造成过度的混凝，降低Fenton程序处理的效果，其可能的反应如下所示: B.过氧化氢浓度的影响 反应过程中，过氧化氢的浓度会直接影响氧化有机物的效果。一般而言，随着过氧化氢添加量的增加，有机物的氧化效果亦将随之提升，并且过氧化氢的添加浓度不同，则分解反应生成的产物将会有所差异。大致而言，在过氧化氢浓度越高的情况下，则其氧化反应产物，将会更趋近于最终产物。但是，当溶液中的过氧化氢浓度过高时，反而会使过氧化氢与有机物竞争氢氧自由基，而造成反应速率的结果可能不如预期一般增加。此外，当Fenton试剂系统中过氧化氢浓度远高于亚铁离子浓度时，Fenton法所产生的氢氧自由基会与过氧化氢反应产生perhydroxyl radical (HO2．)及一系列反应，且三价铁离子会与HO2．进行氧化还原反应生成superoxide radical anion (O2．)，造成过氧化氢消耗量的增加，过量的过氧化氢加药量并不必然增加氢氧自由基的浓度，氢氧自由基达到稳定浓度所需反应时间随加药量增加而增加(27)。因此，若以连续之方式加入低浓度之过氧化氢，减少因为过氧化氢初始浓度过高所导致的抑制效应，亦可得到较好的氧化效果。 C.温度的影响 根据Arrhennius' Law：k=k0exp(-Ea/RT)可得知温度的改变会影响活化能及反应速率常数，进而影响反应速率。 对于Fenton试剂反应而言，一般若选用的反应温度条件是在小于20℃以下时，其对有机物的氧化速率将会随温度升高而加快。但是，倘若将其反应的温度升高至40-50℃时，其Fenton反应将会可能因为温度过高，进而使过氧化氢自行分解成水与氧(2H2O2 → 2H2O + O2 )，造成Fenton试剂对氧化有机物之反应速率减慢。 因此，当过氧化氢浓度超过10-20 g/L时，在其经济与安全的考量下，应谨慎选择适当的温度。在一般商业应用上，通常皆将其反应的温度设定在20-40℃之间。 D. pH值的影响 于Fenton试剂反应中，其反应溶液之pH值对Fenton法之影响，关系到铁离子错合效应、铁
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
自由基清除剂
自由基清除剂 以下几种食物是很好的自由基清除剂，你不妨试一试： 一、茶：茶中的有效成分茶多酚是一种抗氧化剂物质，凡经常饮茶的地区，其居民患癌症的几率较低。由此可见，茶多酚能消除自由基防止癌症的发生。 二、葡萄：葡萄中含有大量多酚类物质，其中最重要的是原花青素(0PC)——此物质具有抗自由基、保护心脑血管、调节血脂、预防高血压、抗肿瘤等多种作用。原花青素主要存在于葡萄籽和皮中，吃葡萄时，可以将籽与肉嚼碎同食。 三、苹果：苹果在所有的水果中是口碑最好的，而且适合不同年龄、不同体格的人。研究发现，常喝苹果汁会降低心脏病的患病率。这是因为苹果汁中的抗氧化剂有利于心脏的健康运转。 四、番茄：番茄含有番茄红素，一种抗氧化剂物质。食物的生熟很重要。如果食用的番茄是生的，它们的总抗氧化剂潜能大约为80。如果将番茄煮熟或装入罐中，它们的总抗氧化剂潜能就会增长5-6倍。五、菠菜：其含有大量β-胡萝卜素和铁，还有大量的α-硫辛酸，能提供给人体丰富的营养。菠菜中的大量抗氧化剂，既能激活大脑功能，又可增强青春活力，有助于防大脑的老化和老年痴呆。 六、山楂：所含有的黄酮类物质和维生素C、胡萝卜素等能阻断并减少自由基的生成，增强机体的免疫力，还有防衰老、抗癌的作用。 七、胡萝卜：胡萝卜不仅能够增强人体免疫力，有抗癌作用，它更含有丰富的胡萝卜素，胡萝卜素可以清除致人衰老的单线态氧和自由
基，减缓人体衰老的过程，防止皮肤老化。 八、黄豆：含有异黄酮和黄豆皂甙，是一种天然抗氧化剂，同时具有弱雌性激素作用。常喝豆浆可以明显减弱妇女更年期症状，而且还有防癌和预防老年痴呆症的作用。对女性有很好的美容养颜的功效。 九、大蒜：大蒜中的大蒜素有较强的抗自由基能力。大蒜切开在空气中被氧化需要15分钟以上。
氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉
氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉 山东大学齐鲁医院麻醉科（250012）于金贵 一、氧自由基 （一）自由基的概念 自由基（free radical，FR）是指外层轨道上有未配对电子的原子、原子团、分子或离子的总称。因其含有未配对的电子，故化学性质非常活泼，极易与其生成部位的其他物质发生反应，而这种反应的最大特点是以连锁反应的形式进行。氧原子上有未配对电子的自由基称为氧自由基。人体吸入的分子氧，在正常状态下绝大多数（98%）都连接4个电子，它们最终与H+结合，代谢还原为H2O。但有极少数氧（1~2%）在代谢过程中被夺去或接受一个电子而形成活性氧，即氧自由基。 （二）氧自由基的生理作用 氧自由基在生理上是必需的物质，如合成ATP 和前列腺素、中性粒细胞杀灭细菌、酸性粒细胞杀灭寄生虫等过程都必须有氧自由基参与。氧自由基在体内的生成与清除保持动态平衡，且在体内存在时间甚短。由于其化学性极强，反应剧烈，过量产生会对机体造成极大危害。 （三）氧自由基的种类及其作用
1. 超氧化物阴离子：氧自由基连锁反应的启动者，使生物膜、激素和脂肪酸过氧化。 2. 羟自由基（OH∙）：作用最强的自由基，可破坏氨基酸、蛋白质、核酸和糖类。 3. 过氧化氢（H2O2）：过渡型氧化剂，主要使巯基氧化，可氧化不饱和脂肪酸。 4. 单线态分子氧（1O2）：氧分子的激发状态，亲电子性强，在光作用下可由O2直接产生，对细胞有杀伤作用。 5. 其他含氧的自由基如脂质过氧化物（ROOH）：易于分解再产生自由基，腐化脂肪，破坏DNA，可与蛋白质交联使之形成变性交聚物。 （四）机体抗氧化机制 机制一：直接提供电子，以确保氧自由基还原；机制二：增强抗氧化酶的活性，以有效地消除或抵御氧自由基的破坏作用如酶类抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）；非酶类抗氧化剂如维生素E、维生素C、辅酶Q、还原型谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖、含硫氨基酸和不饱和脂肪酸等。 SOD多存在于细胞的线粒体内，作用是将氧自由基歧化，将其一半转变成H2O，另一半转变成O2，从而清除氧自由基。CAT是血红蛋白酶类之一，作用是分解H2O2，并将其清除之。
自由基清除剂
第五章自由基清除剂 本章要点 1.自由基理论的产生机理及来源 2.自由基对机体活动的影响 3.自由基清除剂的基本概念 随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自
清除氧自由基
1、超氧负离子 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧负离子产生超氧负离子 黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、 清除超氧自由基负离子O2- 徐艳,曲婷婷. 甘草消除氧自由基的体外研究[J]. 食品研究与开发,2006,(8). 2、1.2.2NBT 光还原反应中主要试剂的配制 1.2.2.1 测试缓冲液: 0.026 mol/LMet- 磷酸钠缓冲液具体配制方法: 首先配制0.1 mol/LpH7.8Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液 a 称取Na2HPO4·12H2O( MW=358.14) 3.581 4 g 于100 mL 小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 b 称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780 g 于50 mL小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 c 量取91.5 mL a 液与8.5 mL b 液混合后, 该液即为0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液。 d 称取L- Met( MW=149.2) 0.194 1 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液定容至刻度。 1.2.2.2 NBT( 氯化硝基四氮唑蓝) 的配制(7.5×10-4mol/L) 称取NBT( MW=817.7) 0.061 3 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 1.2.2.3 核黄素溶液(2×10-5 mol/L) a.称取EDTA( MW=292) 0.002 92 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。 b.称取核黄素( MW=376.36) 0.073 5 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。合并 a 液和 b 液, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度( EDTA0.1 mmol,核黄素2 mmol)。贮于冰箱中, 避光保存, 用时稀释100 倍。 1.2.3 甘草提取物溶液的配制 1.2.3.1 甘草酸溶液的配制 称取甘草酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度, 即为 1 g/ mL 的甘草酸溶液。 1.2.3.2 甘草次酸溶液的配制 称取甘草次酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度,即为 1 g/mL 的甘草次酸溶液。 1.2.3.3 甘草总黄酮组溶液的配制
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70]
实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。
超氧阴离子自由基清除
一．实验原理： 该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。 二．实验仪器：分光光度计 三．实验试剂： 一：液体40mL×1瓶； 二：液体1mL一瓶； 三：粉剂一支； 四：粉剂一支； 五：1mg/mL芦丁标准品，1mL 四．溶液配制： 一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液； 二工作液：用赠送的棕色瓶配制。试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光； 三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用； 四工作液：粉剂一支。用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。 五．实验步骤： 测定吸光值。
六．清除能力计算： 超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100 注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0； 2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。 七．注意事项： 1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔； 2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。 3. 试剂三建议全程冰上操作。试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！ 4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。 5. 部分物质会导致显色加深，导致求得的抑制率是负值，如遇到此类现象请先确定该物质是否具有超氧阴离子清除能力，再考虑更换方法，如邻苯三酚自氧化法等进行测试。
dpph自由基清除测定
dpph自由基清除测定 DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性 抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。 目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。 DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH?，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH?的效果，来计算抗氧化能力。 [1]实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下: ONON22 +H+NNONNONNH22 NONO22 DPPH与抗氧化剂反应原理 材料:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);无水乙醇; 仪器:分光光度计 1.DPPH贮备液的制备
准确称取DPPH试剂3(5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol,L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。 2.试液的制备(只作参考) 准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物(32.75%),用无水乙醇溶解，并定量转入 50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol,L试液。 3.DPPH?清除率的测定 在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K): K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]*100% 试验重复三次，取其平均值作为最后结果。 [1].刘玉萍,Purusotam Basnet,小松かっ子,曹晖.黄芩清除自由基活性与黄芩苷含量的相关性研究[J].中国中药杂志,2002,27(8):575-579 药品:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼); 推荐厂家:上海如吉生物科技发展有限公司; 北京诺博莱德科技有限公司; 报价:380元/瓶;500元/瓶; 规格:1g/瓶; 含量:99%; 产地:日本进口 DPPH稳定性不好，要用时,新鲜配制 DPPH浓度要根据样品的活性来定，一般在20-100μg/mL
体内自由基清除剂及抗氧化剂--原花青素的研究进展
万方数据
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体内自由基清除剂及抗氧化剂--原花青素的研究进展 作者：范明远， 叶青 作者单位：范明远(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所,北京,100021)， 叶青(南京凯基生物科技发展有限公司) 刊名： 中国预防医学杂志 英文刊名：CHINA PREVENTIVE MEDICINE 年，卷(期)：2001,2(4) 被引用次数：33次 参考文献(19条) 1.国植;徐莉原花青素:具有广阔发展前景的植物药 1996(05) 2.Hammerstone JF;Lazarus SA;Schmitz HH Procyanidin content and variation in some commonly consumed foods[外文期刊] 2000(08) 3.Hammerstone JF;Lazarus SA;Mitchell AE Identification of procyanidins in cocoa (Theobroma cacao) and chocolate using high - performance liquid chromatography/mass spectrometry[外文期刊] 1999(02) 4.裘炳毅世界化妆品研究发展趋势 1998(06) 5.Bagchi D;Bngchi M;Stohs SJ Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention[外文期刊] 2000(2-3) 6.Casfillo J;Benavente - G arcia O;Lorente J Antioxidant activity and radioprotective effects against chromosoma damage induced in vivo by X - rays of flavan - 3 - ols (Procyanidins) from grape seeds (Vitis vinifera):comparaive study versus other phenolic and organic compounds[外文期刊] 2000(05) 7.Carini M;Aldini G;Bombardelli E UVB- induced hemolysis of rat erythrocytes:protective effect of procyanidios from grape seeds[外文期刊] 2000(15) 8.Saint - Cricq De Ganlejac N;Provost C;Vivas N Comparative study of polyphenol scavenging activities assessed by different methods[外文期刊] 1999(02) 9.Vennat B;Bos MA;Ponrat A Procyanidins from tornentil: fractionation and study of the anti - radical activity towards soperoide anion 1994(12) 10.Boa MA;Vennat B;Mennier MT Procyanidins from tormentil: antioxidant properties towards lipoperoxidation and anti- elastase activity[外文期刊] 1996(01) 11.Lotito SB;Actis- Goretta L;Renart ML Influence of oligomer chain length on the antioxidant activity of procyanidius[外文期刊] 2000(03) 12.Zhao J;Wang J;Chen Y Antitumor- promoting activity of a polyphenolic fraction isolated from grape seeds in the mouse skin two- stage initiatien - promotion protocol and identification of procyanidin B5-3′ - gallete as the most effective antioxidant constituent[外文期刊] 1999(09) 13.Moini H;Guo Q;Packer L Enzymeinhibition and protein - binding action of the procyanidin- rich French maritime pine bark extxact, pycnogenol: effect on xanthine oxidase[外文期刊] 2000(11) 14.Fitzpatrick DF;Bing B;Rohdewald P Endothelitm - dependent vascular effects of Pycnogenel[外文期刊] 1998(04) 15.Virgili F;Kobuchi H;Packer L Procyanidins extracted from pinus maritirna(pycnogenol):scavengers
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自 氧化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s- A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
自由基清除剂
自由基清除剂 随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自由基在扩展阶段没有消失或增加，那么反应中就有几条链。随着反应的进行，体系中的反应物浓度越来越低，自由基相互碰头的机会越来越多，反应速度就越来越慢，自由基越来越少，最后反应停止。由此可见，自由基反应动力学有别于普通的分子反应，自由基可以连续传递而出现连锁反应。 过氧化物作为引发剂可以使反应在较低温度下进行，如果反应体系中有自由基清除剂存在，它就能很快地捕捉自由基使扩散不能形成。活性强的自由基清除剂能阻止连锁反应的开始。因为氧分子与许多有机物反应时产生自由基，而自由基清除剂能捕捉过氧自由基而中断连锁反应，阻止有机物的氧化，所以自由基清除剂又称为抗氧化剂。 （二）自由基的来源 人体内特定的自由基有不同的来源。 超氧阴离子自由基（O2－·）在其中扮演着非常重要的角色，因为在反应顺序上其他许多活性中间产物的形成都始于与O2－·起作用。它是从黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶通过酶的一电子还原作用释放的氧
过氧自由基清除能力测定法-操作图解
过氧自由基(?O2-)的清除能力（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式 清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
清除自由基
清除自由基 摘要：自由基这种强氧化性物质，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应，而清除这些自由基则能有益作用于我们的身体。众多权威研究表明，负离子能够消减自由基，减缓人体衰老，增强人体免疫力。 关键词：自由基医学 在生命质量越来越受重视的今天，预防治疗各种隐患和疾病已是迫切需要，随着自由基医学、生物学等的出现，人们对自由基的认识也越来越深刻，清除自由基方面的研究也更加全面具体。现在已经研究出了各式各样的自由基清除剂，应用这些自由基清除剂清除体内多余的自由基，防止机体受损而导致疾病的产生。 一、对自由基的认识 自由基又称游离基，是具有非偶电子的基团或原子，它有两个主要特性：一是化学反应活性高；二是具有磁矩。一般情况下，生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。所以说自由基是一把双刃剑。认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。自由基是无处不在的，自由基对人体攻击的途径是多方面的，既有来自体内的，也有来自外界的。当人体中的自由基超过一定的量，并失去控制时，这些自由基就会乱跑乱窜，去攻击细胞膜，去与血清抗蛋白酶发生反应，甚至去跟基因抢电子，对我们的身体造成各种各样的伤害，产生各种各样的疑难杂症。 二、自由基清除剂 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 三、自由基清除实验 3.1 DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度Ab。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。 自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。 3.2 ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸
空气负离子：天然的自由基清除剂
空气负离子：天然的自由基清除剂 外界环境中的阳光辐射、空气污染、频发的雾霾天气、吸烟、农药等都会使人体产生有害的自由基，导致人体患病、衰老。我们要积极可以抗氧化、中和消减自由基，抵抗疾病和衰老，空气负离子就是具有抗氧化防衰老、消减自由基效果的自然因子。 外界环境中的阳光辐射、空气污染、频发的雾霾天气、吸烟、农药等都会使人体产生有害的自由基，使核酸突变，导致人体患病、衰老。 自由基的危害 自由基带有不稳定的氧分子，它们由衰老、日光暴晒或是接触过的有毒化学物中产生。因为失去1个电子变得不稳，为了使自己稳下来，便尝试从细胞里夺回失去的电子，因而损害健康的细胞，引起病变，甚至增加患癌的机会。 众多的医学研究和临床试验证明，人体细胞电子被抢夺是万病之源。自由基的危害很大，夺去了细胞的电子会导致疾病;如果自由基夺去了细胞蛋白分子的电子，使蛋白质接上支链发生烷基化，形成畸变的分子就会致癌。 如何消减体内自由基? 虽然我们难逃自由基的“魔爪”，但是我们积极可以抗氧化、中和消减自由基，抵抗疾病和衰老，空气负离子就是具有抗氧化防衰老、消减自由基效果的自然因子。 空气负离子可以消减体内自由基，减轻自由基的危害的原理主要是因为负离子具有抗氧化(还原性)防衰老的突出作用。空气负离子的抗氧化性(还原性)是一种基本的化学原理，化学反应就是电子层上分子的交换，失去分子叫氧化、得到分子叫还原。失去电子的分子(团)或原子显示正电性的叫正离子，获得多余电子的分子(团)或原子显示负电性的叫负离子，因此空气负离子带有负电位即有多余的电子，可以补充给老化的细胞和血球电子，防止了电子抢夺的恶性循环、具有消减自由基的效果。 环境污染会导致人体内的自由基剧增，负氧离子不仅能消减人体内已形成的自由基，而且可以主动出击、吸附凝聚沉淀空气中的小粒微尘，减少环境中会导致自由基增加的诱因。由此可见，空气负离子是天然的自由基清除剂，可以全方位减少自由基的危害。
自由基清除剂依达拉奉的作用机制及临床应用
北方药学2018年第15卷第6期·综述· 自由基清除剂依达拉奉的作用机制及临床应用 骆海坤袁耀辉王丽华（邢台市第三医院邢台054000） 摘要：近年来，自由基清除剂在临床实践中被广泛关注，以改善急性脑梗死患者的神经功能障碍及日常生活能力。依达拉奉的化学名称为3-甲基-1-苯基-2-吡唑琳-5-酮，于2001年4月在日本第一次上市，是第一个用于临床治疗急性脑梗死的自由基清除剂，进一步的研究发现，依达拉奉在其他组织、器官也能起到抗氧化应激作用，具有较高的临床应用价值。本文对依达拉奉的作用机制及临床应用进行综述。 关键词：依达拉奉自由基清除剂神经保护 中图分类号：R969文献标识码：A文章编号：1672-8351（2018）06-0138-02 Possible mechanisms and clinical applications of Edaravone Luo Haikun Yuan Yaohui Wang Lihua（Pharmacy Department，Xingtai third hospital，Xingtai，054000，China） Abstract：Oxygen free radical scavengar is getting more and more medical attention.And Edaravone is recognized as a new neurprotective agent，first listed in Japan in2005.The chemical name of the agent is3-Menthyl-1-plenyl-1-pyrazolin-5-one，which can support the cells by interrupting lipin peroxidation caused by transferring a electron to free radicals.As the studies deepening，it was suggested Edaravone may be involved in anti oxidative stress of other organs.Therefore，possible mechanisms and clinical applications of the medicine are discussed. Key words:Edaravone Oxygen free radical scavengar Neural protection 作为近年临床上广泛使用的自由基清除剂，在组织缺血过程中，依达拉奉能够有效对抗氧化应激所致的细胞损伤，其可能的机制包括清除自由基、抑制炎症介质产生等。 1依达拉奉的作用机制 1.1抑制氧化应激作用 1.1.1清除自由基：阴离子形式被认为有强大的自由基清除功能[1]。依达拉奉在生理pH下，有50%以阴离子形式存在。机体缺血再灌注损伤的情况下，组织处于缺氧状态，能量代谢发生障碍，大量自由基产生，氧自由基破坏细胞膜的结构和功能，断绝细胞的能源，引起细胞损伤、坏死、血管功能障碍等；过量NO与超氧阴离子生成亚硝基阴离子，攻击DNA、RNA和蛋白质，引起基因突变、酶活性丧失以及细胞代谢紊乱，造成细胞死亡。此时，依达拉奉转化为阴离子形式，对氧自由基和氮自由基进行清除，降低氧化应激损伤从而发挥保护神经元作用。高梅等[2]研究发现依达拉奉可维持脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低丙二醛（MDA）、NO、髓过氧化物酶（MPO）的水平；提高线粒体呼吸链的氧化磷酸化效率，最终抑制氧化应激，起到神经保护作用。王永生[3]观察了依达拉奉对急性脑梗死患者血清氧化-抗氧化系统分子的影响，研究结果与国外报道一致，表明依达拉奉能够减轻急性脑缺血患者血清NO毒性，还能通过降低NOS活性从而减少NO含量。还有研究显示，依达拉奉能够提高硝普钠诱导损伤的PC12细胞的活性，可能依达拉奉清除NO，从而减少氧化损伤，保护细胞形态，减少细胞凋亡。 1.1.2抑制脂质过氧化：氧化应激包括脂质过氧化、蛋白质过氧化以及核酸过氧化，代谢产物分别有3-硝基酪氨酸（3-NT），4-羟基壬烯酸（4-HNE）和8-羟基脱氧鸟苷（8-0HdG），朱晓蕾等[4]报道在依达拉奉保护缺血性脑损伤的机制的研究中，发现依达拉奉在缺血再灌注损伤早期和晚期都能降低小鼠缺血皮质区、内囊区以及外周血清中3-NT，4-HNE和8-0HdG的水平，尤其以下调4-HNE含量最为显著，提示依达拉奉能够有效抑制氧化应激反应。 1.2减少炎症介质产生，减轻组织损伤：脑缺血再灌注损伤过程中会释放大量的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等，炎症反应是脑缺血再灌注损伤过程中的重要环节。缺血状态下大量IL-1β的产生，使其浓度急剧升高，参与神经损伤毒性。TNF在再灌注损伤时，可能增加血脑屏障的通透性，且引起白细胞浸润，炎症因子聚集，参与再灌注区的炎性反应。杨波等[5]的研究表明依达拉奉能有效降低脑梗死患者血清TNF和IL-1β含量，进而减轻由TNF和IL-1β引起的炎性级联反应，改善内环境，阻止脑梗死的进展。国外也有类似报道，提示依达拉奉可能通过抑制炎症反应，改善再灌注损伤，从而达到对神经系统的保护目的。 2依达拉奉的临床应用 2.1在缺血性脑损伤中的应用：急性期脑梗死，是一种脑内血循环异常导致的急性缺血性脑功能障碍，脑细胞、脑组织在多种因素作用下缺血、缺氧，大量钙离子等物质流入脑细胞，与兴奋性氨基酸释放引发一系列的自由基连锁反应。国内外研究都显示依达拉奉作为抗氧化剂和自由基清除剂可保护脑细胞，提高对缺血缺氧的耐受性，能改善急性脑梗死结局。 蔡奕秋等[6]观察了脑梗死分别进行常规治疗和常规基础上加依达拉奉治疗的疗效，结果发现，依达拉奉组神经功能改善情况优于常规治疗组，表明依达拉奉有利于改善神经功能，且依达拉奉组血清hs-CRP低于常规治疗组，提示依达拉奉可能降低血清hs-CRP水平。另外，两组治疗期间均未出现肝肾功能受损、凝血功能异常等不良反应，显示依达拉奉安全、有效，具有较高的临床应用价值。Uno等[7]通过检测脑梗死患者的血浆oxLOL、S-100B和Mn-SOD水平，结果显示依达拉奉具有修复大脑皮层脑梗死的氧化损失作用，降低脑损伤的功能。 袁同勤[8]发现在短暂性脑缺血治疗中，使用依达拉奉同样获益，能够减少短暂性脑缺血复发，预防脑梗死，且能改善卒中后的神经功能缺损。 依达拉奉对腔隙性脑梗死患者的神经缺损功能同样具有明显的改善作用。杨志勇[9]等将腔隙梗死患者分为两组，分别进行常规治疗加口服抗血小板药物，常规治疗加依达拉奉治疗，研究发现依达拉奉和传统的抗血小板治疗均能明显改善神经缺损症状，但依达拉奉对感觉和上肢运动功能的恢复明显优于抗血小板治疗。 2.2在出血性脑损伤中的应用：神经保护剂在脑出血后是否应该使用存在争议，但近年来，不少临床研究显示，依达拉奉作为神经保护剂是安全的，能够有效改善临床预后，有较高的临床应用价值。 冉坤等[10]选取急性脑出血患者，观察依达拉奉对血清炎性因子和氧化应激产物的影响，结果发现，依达拉奉可降低c反应蛋白，肿瘤坏死因子-α，内皮素，白介素-6，白介素-8（IL-8），白介素-1β及氧化应激产物的水平，有效减轻急性脑出血患者的炎性反应与氧化应激反应，提高生活质量及改善神经功能。曲 138