比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术

进展评述

比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术

刘新1,2　应万涛1,2　钱小红1,23

(1军事医学科学院放射与辐射医学研究所　北京　100850;2北京蛋白质组研究中心　北京　102206)

摘　要　比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。

关键词　比较蛋白质组学　稳定同位素标记　体内代谢标记　体外化学标记

Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics

Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23

(1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850;

2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206)

Abstract　C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics.

K ey w ords　C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro

随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。

为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但

刘新　男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。　3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.sodocs.net/doc/2314465793.html,

国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目

2006207220收稿,2006209221接受

mRNA自身存在储存、转运、降解、翻译调控及产物的翻译后加工等一系列复杂过程,从而使mRNA表达和蛋白质表达的相关性并不高,难以准确地反映相应蛋白质的表达变化[5],因而该方法很难有效地应用于比较蛋白质组学研究。

质谱分析法是通过测定样品离子的质荷比来进行成分和结构分析的。随着电喷雾电离和基质辅助激光解析电离为代表的两项软电离技术的出现,质谱在am ol水平上分析几十万Da的大分子成为可能,从此质谱学出现了一个新的领域———生物质谱学。快速发展的生物质谱学,为蛋白质组研究提供了关键的技术手段,使规模化分析细胞或组织内的蛋白质成为可能[6]。

近年来,基于稳定同位素标记与质谱联用的技术在比较蛋白质组学中发展迅速。稳定同位素标记方法用于研究蛋白表达的变化,其原理是将化学性质相同但质量不同的稳定同位素作为内标,对来自不同生理病理条件下的的蛋白质或肽段进行标记,相同的蛋白质或肽段因其质量差异在质谱图中出现一对特征性的同位素峰。由于它们具有相同的离子化能力,可以通过比较其各同位素质谱峰的强度,分析蛋白质在不同状态下的表达量的变化[7]。本文力图综述近年来在比较蛋白质组学研究中常用的两大类稳定同位素标记技术———体内代谢标记技术和体外化学标记技术,以期为国内比较蛋白质组学研究提供可以借鉴的研究策略。

1　体内代谢标记技术

体内代谢标记技术作为目前定量分析误差最小的比较蛋白质组学研究策略而得到广泛的应用。

Oda等[7]首先将体内代谢标记的方法应用到酵母实验中,酵母分别在含有天然14N同位素的培养基和富含15N同位素的培养基中培养,然后将在两种培养基中生长的酵母细胞等量混合,经细胞裂解、蛋白质提取、二维凝胶电泳分离和蛋白质染色,寻找到感兴趣的蛋白质点,对其进行胶内蛋白质酶解、肽段提取和质谱鉴定。从质谱图中可以很清楚地看到一对具有特征性的同位素峰(14N标记的肽段和15N标记的肽段),通过峰强度的比值确定在不同生长条件下蛋白质表达的差异。Oda等在实验中不仅比较了蛋,同时也准确定量了不同磷酸化位点的磷酸化程度。Y ates等[8]也采用了类似的研究策略,通过15N对酵母代谢标记,蛋白质提取后经多维色谱分离与质谱鉴定,800多个蛋白质有10倍以上量的差异。该策略也成功地对大肠杆菌、放线菌以及哺乳动物细胞系等进行了代谢标记[9,10]。但是,研究发现,富含同位素的培养基一定程度上会影响细胞的正常生长。另外,如果以元素代谢的形式标记到蛋白质中,若发生不完全标记,则会造成标记和非标记肽段的质量差值不可预测,从而使质谱谱图难以解析。即使能够完全标记,由于合成到肽段里的同位素的原子数量因其氨基酸组成和分子量不同而不同,这就使得同位素标记肽段的辨认更加困难,进一步增加了分析难度[11]。

为了克服上述标记策略的不足,开发出了基于稳定同位素标记的氨基酸细胞培养策略。Mann等[12]用氘代亮氨酸作为标记物对肌肉组织蛋白质进行代谢标记,成功定量了肌肉分化过程中蛋白质的表达变化,并将该方法命名为细胞培养氨基酸稳定同位素标记(stable is otope labeling with amino acids in cell culture,SI LAC)。运用此技术,Neubert等[13]对E phB2信号通路中酪氨酸磷酸化蛋白质组进行定量分析,并且基于表达变化的蛋白质构建了相互作用网络;C ole等[14]在对Her2信号通路中的磷酸化蛋白质组研究中发现,在Her2过表达的细胞中,198种蛋白质的酪氨酸磷酸化水平显著上升,而81种蛋白质的磷酸化水平显著下降。Han等[15]采用SI LAC技术,通过多级提取的方式对细胞凋亡过程中的细胞核蛋白质组进行了研究,共鉴定和定量了1174种蛋白质,除了大量已知的与细胞凋亡相关的蛋白质,鉴定结果中还有大量与细胞凋亡相关的未知新蛋白。为了提高SI LAC技术的定量准确性,Neubert等[16]采用不同标记成对肽段的二级碎片离子(y离子)的峰强度比值进行定量分析,这种定量方法和传统的基于不同标记成对肽段的一级质谱峰强度或者抽提的离子色谱峰面积的定量方法相比,具有更好的动态检测范围,并且能有效提高蛋白质鉴定的灵敏度。

SI LAC技术对于稳定同位素标记的氨基酸是有选择的,目前常用的氨基酸是精氨酸和赖氨酸。主要是基于以下因素考虑:在蛋白质组学研究中,胰蛋白酶被广泛使用,其能够高度特异性酶切赖氨酸和精氨酸残基的羧基端,酶切产生的肽段C末端(赖氨酸的侧链氨基或精氨酸胍基)在酸性条件下均会带

上一个质子,从而确保了一级质谱分析(除蛋白末端并且不含有碱性氨基酸的肽段)的离子化效率及二级质谱分析离子的碎裂[17]。但是实验发现,在用13C精氨酸进行代谢标记时,脯氨酸也会被13C标记,这可能是精氨酸分解代谢时13C转移到了脯氨酸中所致[18]。

综上所述,在体内代谢标记技术中,稳定同位素标记过程发生在代谢水平上,因而极大地减少了蛋白质提取过程中可能引入的定量误差,同时该标记方法多与高分辨率、高准确度的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR2MS)联用,因而该标记策略是目前比较蛋白质组学中最为准确的定量分析方法。但是这种标记策略所使用的富含稳定同位素的培养基及氨基酸的费用高昂,这也是多数实验室必须考虑的一个因素。该代谢标记方法已经大规模用于多细胞有机体和哺乳动物[19]的比较蛋白质组学的研究,但鉴于人的特殊性及其代谢周期太长,该标记技术尚不能应用于人体组织样本。这在一定程度上限制了该标记方法的推广。

2　体外化学标记技术

相对于体内代谢标记技术,体外化学标记技术具有其自身的特点:(1)其所使用的稳定同位素标记试剂相对便宜;(2)可选择在蛋白水平或肽段水平对样本进行标记,并且可供选择的标记位点很多,例如氨基端、羧基端及氨基酸残基的侧链基团(赖氨酸的侧链氨基,半胱氨酸的巯基)等;(3)适用于各种生物样本(包括人体的组织、器官)。

211　酰基化标记方法

酰基化标记方法是针对肽段自由氨基以及赖氨酸侧链ε2氨基的标记方法。Regnier实验室在氨基衍生化方面做了大量工作,研究过多种标记试剂[20,21],其研究发现氨基端苯甲酸衍生化可以显著增加亲水性肽段的保留时间,提高蛋白质鉴定的序列覆盖率,但也发现分别被1H和2H稳定同位素试剂标记的肽段在反相色谱中的保留时间不一致,2H稳定同位素试剂所标记的肽段在反相色谱中较早流出,随着试剂中的2H原子数量的增加(例如使用1H92戊酸酐和2H92戊酸酐标记),1H和2H标记的肽段在反相色谱中会完全分离。而12C和13C稳定同位素试剂所标记的肽段则无这种同位素效应。但是2H同位素试剂较13C同位素试剂便宜,因此2H同位素试剂仍被广泛使用[22,23]。

酰基化标记技术能够标记各种来源的样本,能标记所有的酶解肽段(除了被封闭的蛋白质氨基端,并且该酶解肽段是以精氨酸结尾的肽段),故为一种全面的内标技术。酰基化标记方法的反应条件温和,可用于翻译后修饰肽段的标记。但是该标记方法也存在不足,酰基化反应改变了以赖氨酸为结尾的肽段带电状态,降低了在正离子检测模式下的离子化效率。为了解决该问题,可在酰基化反应之前先进行胍基化修饰,将赖氨酸转变成为高精氨酸,从而既保证了肽段的带电荷状态及离子化效率,又提高了以赖氨酸结尾肽段的检测灵敏度。Z appacosta等[24]采用该策略对转录因子Pho4在不同浓度磷酸盐环境中的磷酸化水平进行了定量研究,结果表明,在磷酸盐富集的培养基中,Pho4中至少有15个磷酸化位点,其中包含细胞周期依赖激酶(Cdk)的5个磷酸化位点;而在磷酸盐缺失的培养基中,Cdk的这5个位点的磷酸化都是被抑制的,此外,有4个新位点的磷酸化水平发生变化。

212　18O标记方法

18O标记方法也是一种全面内标方法。18O标记过程大致分两种情况:酶切过程中标记和酶切后标记。两者原理相似,前者的酶切和标记反应在同一个反应体系中同时进行,而后者把酶切和标记反应的体系分开,酶切后标记方法的实验设计更加灵活,酶切和标记条件可以分别优化,并且可以节省18O水的用量,因此在复杂样本的标记中得到广泛应用[25～28]。18O原子可在胰蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、赖氨酸蛋白酶等蛋白水解酶的催化下交换到酶切产生的羧基中去[29,30],从而使C2末端带上一个或两个18O原子。以胰蛋白酶为例,在胰酶催化酰胺键水解断裂的过程中,18O原子交换到C2末端的赖氨酸或精氨酸的羧基上,通过两次酶2肽段复合物的水解反应,肽段C2末端羧基的两个16O原子被H218O中的18O替换出来。但是交换反应有一个盲区,因为多数蛋白质的C2末端不以赖氨酸或精氨酸结尾,所以蛋白质的C2末端肽就不会发生反应。另外,因为氧交换反应是胰酶依赖性的,所以标记反应完成后需立即灭活胰酶,以免在后续的16O环境中发生回交反应。Fenselau等[31]选用谷氨酸蛋白酶作蛋白质酶切并催化18O标记反

应,在C2末端成功引入2个18O原子,并简单应用于翻译后修饰蛋白质及糖蛋白质的定量分析。Smith 等[32]运用胰酶催化的18O标记方法结合准确质量时间标签方法,成功鉴定和定量了脂多糖刺激前后血浆中差异表达的蛋白质。

213　酯化标记方法

酯化反应的主要反应位点是肽段羧基端,同上述两种化学标记方法一样,也是一种全面内标技术。Li等[33]对羧基端的酯化标记方法进行了大量研究,发现酯化标记存在一些不足,例如:酯化反应过程中谷氨酰胺和天冬酰胺会发生部分脱酰胺;即使反复加入酯化试剂,反应仍然不彻底;所形成的酯键在酸性体系中会发生水解。尽管酯化标记方法本身存在缺点,但是在比较蛋白质组学研究中仍为一种有效的体外化学标记方法[34]。

214　半胱氨酸标记方法

半胱氨酸因其强亲核性的巯基,而成为首选的特异标记对象。Aebers old等[35]开发了一种基于巯基反应的亲和标签技术(is otope2coded affinity tags,IC AT)。因蛋白酶切产生的含半胱氨酸的肽段相对较少,所以选择性富集含半胱氨酸的肽段,可以极大地简化复杂体系,并且该试剂是稳定同位素标记的,因此可用于定量分析。该技术主要采用了一种IC AT试剂,试剂由三部分组成:第一部分是由生物素构成的亲和标签,用于分离经IC AT试剂标记后的肽段;第二部分是用来整合稳定同位素的连接子;第三部分是用来特异结合巯基的活性反应基团。Aebers old等[35]运用IC AT标记方法成功分析了酵母蛋白质组,其整个反应流程是:首先将不同标记的样品混合并酶解,然后通过一个阳离子交换柱去除没有反应的生物素试剂,再次利用抗生物素的亲和柱富集被生物素标记的肽段,最后被亲和洗脱下来的肽段经反相色谱分离后进入到质谱分析。Jenkins等[36]使用IC AT技术对微粒体代谢酶细胞色素P450进行了相对及绝对定量研究,实验表明苯巴比妥刺激前后,细胞色素2c29的表达量上调三倍,而细胞色素2c40和2c50的表达量没有明显变化。G arin等[37]研究表明,在S DS和尿素体系中,IC AT技术对疏水蛋白的标记效果良好,并被成功用于鼠胚胎干细胞膜蛋白的标记定量。

但是IC AT试剂同样存在一些不足:一是不能分析半胱氨酸缺失的蛋白质;二是不太适用于翻译后修饰的比较蛋白质组研究,原因在于该试剂只能特异性地与半胱氨酸肽段反应,若翻译后修饰发生在非半胱氨酸肽段上,则无法被富集到。早期商业化的IC AT试剂所使用的同位素为1H和2H,研究发现分别被1H标记和2H标记的肽段的反相色谱行为并不完全一致。因而随后IC AT试剂使用12C和13C同位素标记取代了原来的1H和2H标记试剂[38]。另外,考虑到早期IC AT试剂的生物素在串联质谱分析中产生大量难以解析的碎片离子,第二代产品增加了可被酸切割的位点,用于去除生物素的干扰,降低了谱图解析难度,增加了蛋白质的鉴定数量。后来陆续开发的IC AT试剂升级产品,如固相化IC AT试剂[39]和可视化IC AT试剂[40],都使得IC AT技术可用于更多的领域。

3　比较分析软件

比较蛋白质组学分析过程中,经常有大量的数据分析依赖于生物信息学的辅助软件。如IC AT技术已经商业化的试剂盒可以用ABI4700质谱仪附带的分析软件G PS316分析,SI LAC技术也开发了相关软件Msquant并且可以从互联网上免费下载,其网址为http:ΠΠmsquant.s https://www.sodocs.net/doc/2314465793.html,。此外,用于18O定量分析的软件Z oomQuant也已经被开发出来,其网址为http:ΠΠhttps://www.sodocs.net/doc/2314465793.html,Πzoomquant。同时很多实验室针对各自的标记方法,开发了不同的定量分析软件[16]。这些分析软件的出现,大大加快了数据处理的速度,排除了手工数据处理过程中可能存在的主观因素,使得定量结果更加准确可靠,最终促进了基于稳定同位素标记与质谱联用的技术在比较蛋白质组学中的发展。

4　展望

近几年来,比较蛋白质组学的研究发展迅速,基于稳定同位素标记与质谱联用技术的应用也越来越广泛,无论是体内代谢标记技术还是体外化学标记技术都日益成熟,同时各种配套的数据分析软件的编写,都使该研究策略具有更加强大的生命力。

尽管已经有很多已经商业化的稳定同位素标记试剂,但是还是需要不断开发新的试剂。即将开发的试剂如果注意以下几个问题,将会具有更大的应用空间。例如,该试剂能否使样品中蛋白质或肽段被全部标记,标记后的蛋白质或肽段的质量差是否可以预测,标记方法是否简单,标记过程反应条件是否温和,标记基团在多维色谱分离条件中是否稳定,标记基团在质谱中是否稳定,会不会产生额外的碎片离子而干扰谱图解析,被标记的蛋白质或肽段的离子化效率是否不受标记基团的影响,被标记肽段的色谱行为是否一致,标记方法是否允许两个或两个以上的样品同时被分析,标记方法是否能够应用于包括人体在内的所有生物样本,标记试剂是否廉价易得等。开发新的稳定同位素标记试剂的同时,也应该进行新型质谱的研发工作,更快的扫描速度、更高的灵敏度、准确度和分辨率都是未来质谱的发展方向。而这些问题都是比较蛋白质组学研究中密切关注的问题,也是未来比较蛋白质组学研究的发展趋势。

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蛋白质组学与分析技术1

名词解释 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 双向电泳原理：双向一般是指第一向为等点聚焦（IEF），根据蛋白质等电点进行分离；第二向为SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的相对分子量进行分离。 三步纯化策略:第一步粗提，浓缩，稳定蛋白，去除蛋白酶，使用梯度洗脱来增加捕获步骤的速度和容量；第二步中度纯化，去除主要杂质，一般需要连续梯度洗脱； 第三步精纯，最终去除痕量杂质，如目标蛋白的结构变体。 高效液相色谱：是一种以高压输出液体为流动相的色谱技术。在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期 长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。 吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸 附中心的过程。 PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 基因组文库：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一 基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。 cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称。 基因芯片：基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 基因敲除（gene knock out）：又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细

蛋白质组学研究方法选择及比较

蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：

●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。

同位素标记法小专题

同位素标记法小专题 一、考点说明 在高考理综生物考试中常以选择题的形式考查同位素标记法的应用。三模考试中刚好也出现了同位素标记的问题“同位素标记法”与分泌蛋白、光合作用、噬菌体侵染细菌、基因工程、基因诊断等生物知识相关，主要涉及教材相关考点： 1．光合作用（教材必一册P51鲁宾和卡门实验） 2．植物的矿质营养（教材必一册P61小资料矿质元素的运输） 3．遗传物质的证据（教材必二册P4噬菌体侵染细菌的实验） 4．C3植物和C4植物（教材选修P29） 5．基因工程（教材选修P54基因诊断、56病毒检测） 6．细胞的生物膜系统（教材选修P61分沁蛋白的合成与分泌） 拓展问题： 7、DNA的复制 5．细胞分裂过程中DNA和RNA的复制 二、同位素标记法概述 在中子和质子组成的原子核内，质子数相同，中子数不同的这一类原子称为同位素。同位素包括稳定同位素和放射性同位素。稳定同位素是指原子核结构稳定，不会发生衰变的同位素，如15N，18O等。放射性同位素是指原子核不稳定会发生衰变，发出α射线或β射线或γ射线的同位素，如3H、14C、32P、35S、131I、42K等。 同位素可用于追踪物质的运行和变化规律。用同位素标记的化合物，化学性质不会改变。科学家通过追踪同位素标记的化合物，可以弄清化学反应的详细过程。这种方法叫做同位素标记法。氢的同位素：氕、氘和氚，氚具有放射性，能够发射负B射线，因而可以通过探测器进行追踪；碳的同位素：稳定同位素12C、13C和放射性同位素14C；氧的同位素：16O、17O、18O，它们都不具有放射性，因此不能通过放射性进行追踪；磷的同位素：除了质量数为31的一种稳定性同位素外，还有几个放射性同位素，其质量数为29、30、32、33和34；但只有质量数为32和33的同位素存在足够长的时间可以作为示踪物之用，32和33都可以发射负B射线。硫的同位素：硫的同位素32S、33S、34S、35S和36S中，除35S外，其它放射性同位素的半衰期都很短，因此在放射性同位素示踪法中，用的多是35S。 除了课本中介绍的这些实验中涉及到同位素标记法的应用之外，在一些习题中也经常涉及到。例如用N的同位素15N标记核苷酸研究DNA的半保留复制；利用N的同位素15N标记氨基酸，研究其在动植物体内的转移途径；用42K标记的培养基来研究矿质元素在植物体内的运输途径等。只要我们了解其中的原理便能触类旁通，解决学习中的困难。 三、例题分析： 例一、如何研究分泌蛋白的合成与分泌过程？ 例二、光合作用释放的O2到底是来自H2O，还是CO2呢，还是两者兼而有之？设计实验步骤并预测结果和结论？ 例三：在光照下，供给玉米离体叶片少量的14C02，随着光合作用时间的延续，在光合作用固定CO2形成的C3化合物和C4化合物中，14C含量变化示意图正确的是（） 变式（10全国卷I）光照条件下，给C3植物和C4 植物叶片提供14CO2，然后检测叶片中的14C。下列有关检测结果的叙述，错误的是（） A.从C3植物的淀粉和C4植物的葡萄糖中可检测到14C

比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术

进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2　应万涛1,2　钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所　北京　100850;2北京蛋白质组研究中心　北京　102206) 摘　要　比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词　比较蛋白质组学　稳定同位素标记　体内代谢标记　体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract　C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords　C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新　男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。　3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.sodocs.net/doc/2314465793.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受

蛋白质组学研究的完整解决方案

蛋白质组学研究的完整解决方案 人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。 为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成： 一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D Electophoresis System） 该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。 产品特征： * 提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间 * 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离 * 大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶 * 灵活性：该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用 * 恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化< 0.5℃ * 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统 * 提供超纯的相关化学试剂和药品

稳定同位素技术的应用

稳定同位素技术的应用 稳定同位素是元素周期表中某元素中不发生或极不易发生放射性衰变的同位素，目前地球上发现的稳定同位素共有200多种。现在稳定同位素技术还已经应用于医学、农业和环境科学等各领域。 稳定同位素的常规分析方法主要有：质谱法、核磁共振谱法、气相色谱法、中子活化分析法、光谱法等。 1.稳定性同位素探针技术 将稳定同位素运用于微生物中的技术主要是稳定性同位素核酸探针技术，稳定性同位素核酸探针技术是将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能耦合分析的有力工具。由于自然环境中微生物具有丰富的多样性，在整体水平上清楚认知复杂环境中微生物群落生理代谢过程的分子机制具有较大难度。而稳定性同位素核酸探针技术则能有效克服这一难点，在群落水平揭示复杂环境中重要微生物生理生态过程的分子机制。 稳定性同位素核酸探针技术的基本原理与DNA半保留复制实验类似、主要区别在于后者以纯菌为研究对象，证明子代DNA源于父代DNA，而前者主要针对微生物群落，揭示复杂环境中参与标记底物代谢过程的微生物作用者。一般而言，重同位素或轻同位素组成的化合物具有相同的物理化学和生物学特性，因此，微生物可利用稳定性重同位素生长繁殖。 2.稳定同位素标记的相对定量与绝对定量方法 2.1稳定同位素标记的相对定量方法 稳定同位素在蛋白质组学中也有重要的应用。根据同位素引入的方式，基于稳定同位素标记的蛋白质组定量方法可以分为代谢标记法、化学标记法和酶解标记法。采用不同方法，标记同位素的样品在不同步骤混合；越早混合，样品预处理步骤引入的误差越小，定量的准确度越高。 代谢标记是指在细胞或生物体成长过程加入含有稳定同位素标记的培养基，完成细胞或生物体标记的方法。该方法是在细胞培养过程中加入稳定同位素标记的必需氨基酸，使得每条肽段相差的质量数恒定。与15N方法相比，由于肽段的质量差异数与氨基酸种类和数目无关，因此简化了相对定量分析的难度。 除代谢水平标记外，通过体外化学标记引入同位素是一种非常有价值的蛋白质组相对定量方法；适用于细胞、体液、组织等多种样品分析。现有的化学标记试剂多数通过与氨基或巯基反应引入稳定同位素。最常用的是基于N -羟基琥珀酰胺化学和还原胺反应。 18O标记是目前酶解标记的唯一方法。采用该方法仅需要在酶解过程中使用H218O。18O标记既可用于非修饰蛋白质组的相对定量，而且也可以将肽段末端的

稳定同位素标记物常见问题

1913年汤姆逊和阿斯顿在用磁分析器研究氖时，发现了氖的两种同位素—氖20和氖22。这是第一次发现稳定同位素。1919年阿斯顿制成质谱仪，随后他在71种元素中，发现了202种同位素，并测定了各同位素的丰度。1920年赫维西和策希迈斯特尔研究了同位素交换反应。1931年尤里等发现重氢；1933年路易斯等用电解法制得纯重水；1934年挪威利用其廉价水电能建立了第一座重水工厂。1942年美国建造了电磁分离器并分离出铀235；1943年美国又建立了三座六氟化铀气体扩散工厂生产铀235；1944年美国橡树岭国家实验室首先生产了千克量的铀235，并制造了第一颗原子弹。重水既是建造反应堆的重要原料，又是热核燃料和热核武器的原料。第二次世界大战后，一些国家竞相研究生产重水的新方法，其中硫化氢双温交换法、液氢精馏法等都实现了工业化生产。小编今天带大家了解一下，同位数化学的发展史，检测一下你能答对几个问题呢？ 问题一：作为分析检测人员，当提到稳定同位素标记物你的第一反应是啥？ 答：质谱 问题二：稳定同位素标记物一般做什么用呢？ 答：内标、药物研究 问题三：稳定同位素标记物的关键质控指标是什么呢？ 答：纯度、丰度 问题四：那证书中经常出现的两个纯度Chemical purity，Isotopic abundanc是啥意思呢？ 答：Chemical purity：化学纯度，一般都是采用色谱法测定（GC、HPLC）；

Isotopic abundance：同位素丰度，一般都是采用质谱来测定； 问题五：那如图所示这个3-氯-1，2-丙二醇-d5纯度到底是多少呢？ 答：Purity（3-氯-1，2-丙二醇-d5）=98.25%*96.14%，即94.5%，或者套用近似公式： Purity（3-氯-1，2-丙二醇-d5）=98.3%*99.2%^5，即94.5% 问题六：如果选择同位素标记物做内标应该重点关注哪些问题呢？

蛋白质组学与分析技术课复习思1考

蛋白质组学与分析技术课复习思考 一、名词解释 1、蛋白质组学： 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理： 根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略 在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。5、离子交换色谱： 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱 吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增 PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使

质谱技术在蛋白质组学研究中的应用

第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化

同位素标记法小专题

一、考点说明 在高考理综生物考试中常以选择题的形式考查同位素标记法的应用。三模考试中刚好也出现了同位素标记的问题“同位素标记法”与分泌蛋白、光合作用、噬菌体侵染细菌、基因工程、基因诊断等生物知识相关，主要涉及教材相关考点： 1．光合作用（教材必一册P51鲁宾和卡门实验） 2．植物的矿质营养（教材必一册P61小资料矿质元素的运输） 3．遗传物质的证据（教材必二册P4噬菌体侵染细菌的实验） 4．C3植物和C4植物（教材选修P29） 5．基因工程（教材选修P54基因诊断、56病毒检测） 6．细胞的生物膜系统（教材选修P61分沁蛋白的合成与分泌） 拓展问题： 7、DNA的复制 5．细胞分裂过程中DNA和RNA的复制 二、同位素标记法概述 在中子和质子组成的原子核内，质子数相同，中子数不同的这一类原子称为同位素。同位素包括稳定同位素和放射性同位素。稳定同位素是指原子核结构稳定，不会发生衰变的同位素，如15N，18O等。放射性同位素是指原子核不稳定会发生衰变，发出α射线或β射线或γ射线的同位素，如3H、14C、32P、35S、131I、42K等。 同位素可用于追踪物质的运行和变化规律。用同位素标记的化合物，化学性质不会改变。科学家通过追踪同位素标记的化合物，可以弄清化学反应的详细过程。这种方法叫做同位素标记法。氢的同位素：氕、氘和氚，氚具有放射性，能够发射负B射线，因而可以通过探测器进行追踪；碳的同位素：稳定同位素12C、13C和放射性同位素14C；氧的同位素：16O、17O、18O，它们都不具有放射性，因此不能通过放射性进行追踪；磷的同位素：除了质量数为31的一种稳定性同位素外，还有几个放射性同位素，其质量数为29、30、32、33和34；但只有质量数为32和33的同位素存在足够长的时间可以作为示踪物之用，32和33都可以发射负B射线。硫的同位素：硫的同位素32S、33S、34S、35S和36S中，除35S外，其它放射性同位素的半衰期都很短，因此在放射性同位素示踪法中，用的多是35S。 除了课本中介绍的这些实验中涉及到同位素标记法的应用之外，在一些习题中也经常涉及到。例如用 N的同位素15N标记核苷酸研究DNA的半保留复制；利用N的同位素15N标记氨基酸，研究其在动植物体内的转移途径；用42K标记的培养基来研究矿质元素在植物体内的运输途径等。只要我们了解其中的原理便能触类旁通，解决学习中的困难。 三、例题分析： 例一、如何研究分泌蛋白的合成与分泌过程？ 例二、光合作用释放的O2到底是来自H2O，还是CO2呢，还是两者兼而有之？设计实验步骤并预测结果和结论？ 例三：在光照下，供给玉米离体叶片少量的14C02，随着光合作用时间的延续，在光合作用固定CO2形成的C3化合物和C4化合物中，14C含量变化示意图正确的是（）

高中生物中的“同位素标记法

“同位素标记法”的总结 利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质，就可以检测和追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等。同位素标记在工业、农业生产、日常生活和科学科研等方面都有着极其广泛的应用。在生物学领域可用来测定生物化石的年代，也可利用其射线进行诱变育种、防治病虫害和临床治癌，还可利用其射线作为示踪原子来研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理。高中生物教材中的实验（或内容）和相关习题中许多知识都涉及同位素标记法的应用。下面我就相关内容通过有关例题进行归纳阐述，以便大家对这项技术有一个深刻的体会，并学会同位素标记的应用。 一、氢（3H） 例1：科学家用含3H标记的亮氨酸的培养液培养豚鼠的胰腺腺泡细胞，下表为在腺泡细胞几种结构中最早检测到放射性的时间表。下列叙述中正确的是（） A．形成分泌蛋白的多肽最早在内质网内合成 B．高尔基体膜向内与内质网膜相连，向外与细胞膜相连 C．高尔基体具有转运分泌蛋白的作用 D．靠近细胞膜的囊泡可由高尔基体形成 解析：分泌蛋白的多肽最早在核糖体上合成，高尔基体并不直接和内质网与细胞膜相连，而是通过囊泡间接连接。 答案：CD。 知识盘点： 1.科学家在研究分泌蛋白的合成和分泌时，曾经做过这样一个实验：他们在豚鼠的胰脏腺泡细胞中注射3H标记的亮氨酸，3min后，被标记的氨基酸出现在附着有核糖体的内质网中，17min后，出现在高尔基体中，117min后，出现在靠近细胞膜内侧的运输蛋白质的小泡中，以及释放到细胞外的分泌物中。这个实验说明分泌蛋白在附着于内质网上的核糖体中合成之后，是按照内质网→高尔基体→细胞膜的方向运输的，从而证明了细胞内的各种生物膜在功能上是紧密联系的。 2．研究肝脏细胞中胆固醇的来源时，用3H—胆固醇作静脉注射的示踪实验，结果放射性大部分进入肝脏，再出现在粪便中。 3．用3H标记的尿苷或胸腺嘧啶可用来检测转录或复制。 二、碳（14C） 例2：给在温室中生长的玉米植株提供14CO2，光合作用开始很短内，在叶肉细胞中有绝大多数的14C出现在含有4个碳的有机酸（C4）中。一段时间后，叶肉细胞内C4中的14C逐渐减少，而在维管束鞘细胞中C3内的14C逐渐增多。下列对玉米固定CO2过程的叙述正确的是（） A．通过C4和C3途径，依次在维管束鞘细胞和叶肉细胞的叶绿体中完成 B．通过C4和C3途径，依次在叶肉细胞和维管束鞘细胞的叶绿体中完成 C．通过C4途径，在维管束鞘细胞的叶绿体中完成 D．通过C4途径，在叶肉细胞的叶绿体中完成 解析：通过题干描述可知在玉米中发生了如下过程：在叶肉细胞的叶绿体中CO2+C3→C4，C4化合物由叶肉细胞的叶绿体进入维管束鞘细胞释放出CO2，CO2+C5→2C3化合物。答案：b。 知识盘点： 1．用放射性14C取代化合物中同位素12C，形成以14C作为放射性标记的化合物。科学家用含有14C的CO2来追踪光合作用和呼吸作用过程中的碳原子的转移途径。 2．用同位素14C标记的吲哚乙酸，可研究生长素的极性运输。用标记了14C的脂肪饲喂动物，可研究动物代谢的物质转化。 三、氧（18O） 例3：如果将一株绿色植物栽培在密闭的含H218O的完全培养液中，给予充足的光照，经过较长时间后，18O可能存在于下列哪一组物质中（）

质谱技术在蛋白质组学研究中的应用_甄艳

第35卷　第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 　收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 　基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002)　作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 　引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄　艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏　南京　210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化