实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介

一．实时荧光定量PCR的基本原理

理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的

在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义

Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系

Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势

由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，

直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。

二．荧光定量PCR的2类方法（按荧光产生的原理分类）染料法（SYBR Green法）

染料法即利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。该方法与常规的PCR 类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。与EB的性能类似，SYBR Green也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBR Green能特异性的与之结合并在497nm激发下。

染料法的优点：1，无需设计、合成探针，实验成本低；2，使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。

染料法的缺点：1，由于SYBR Green与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增；2，由于SYBR Green的上述特点，该方法不能应用于Multiplex QPCR技术。（在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况）

探针法（以TaqMan探针为例）

探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于：在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。目前市场上的探针主要种类有：TaqMan、Molecular Beacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最广泛。TaqMan探针的结构：长度与普通PCR引物类似，大约20bp左右。在5’与3’端各标记有一个荧光基团，5’的荧光基团称为报告基团（Report），3’的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。

TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特定波长的荧光信号。

TaqMan探针法工作原理：

变性（95°C）：模板dsDNA充分解链；

复性、延伸、酶切降解（60°C）：1，探针与靶序列结合；上、下游引物与靶序列结合；

3，上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5’→3’聚合功能）；4，当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥5’→3’外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；

荧光信号的检测：由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。

与染料法相比TaqMan探针法的优点：1，实验的特异性得到了提高；2，对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行Multiplex QPCR。

与染料法相比TaqMan探针法的缺点：1，探针的使用提高了实验成本；2，探针的使用需要设计及优化。

三．确定样品起始模板拷贝数的2类方法

绝对定量

采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数的样品）建立标准曲线，建立Ct 值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。

标准品的种类：含目的基因的质粒（经酶切线性化处理，其中的插入片段必须采用与QPCR 实验中相同的引物扩增得到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品使用较为广泛。

标准品的定量：UV A260、荧光分光光度检测等。

为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进行归一化的处理：1，对各样品进行

细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后得到的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。

相对定量

与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下：

公式说明：

Rel.Quantity：目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；

GOI：目的基因（Gene of Interest）；

Norm：内参基因（Reference Gene，Normalizer，House Keeping Gene）

Eff：PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率；使用该公式时，需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2-ΔΔCt。

为什么需要设立内参基因？

如果仅仅比较目的基因的ΔCt是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响：1，样品处理时不同的纯化得率；2，RT-PCR过程中不同的逆转录效率；3，QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。由于上述3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上，因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理，使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，这样得出的结果才具有可信性与良好的重复性。（注意：内参基因的（1+EffΔCt）位于分母的位置，进行除法的运算。）

如何选择内参基因？符合什么标准的基因可以作为内参基因？

由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必须满足以下3个条件：1，在不同的细胞、组织中具有恒定的表达；2，在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；3，在不同的实验状态下具有恒定的表达。内参基因的ΔCt一般小于2（即小于1倍的表达差异），一般采用的内参基因都是一些管家基因，使用最多的为：?-actin、GAPDH、18sRNA等。

需要注意的是：并非传统意义上的管家基因都能作为内参基因，还是需要与具体的实验结合起来综合考虑。例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达，不能作为内参基因。因此在选择内参基因时建议：1，查阅相关文献；2，设立多个内参基因；3，采用表达谱的方法确定理想的内参基因。

采用Singleplex还是Multiplex？

可以采用Singleplex的方法在不同的反应管内得到同一样品目的基因与内参基因的Ct 值，再利用上述公式进行计算。在这种情况下可以使用SYBR Green法进行实验。

也可采用Multiplex的方法在一个反应管内得到同一样品目的基因与内参基因的Ct值，再利用上述公式进行计算。采用TaqMan探针法（目的基因与内参基因的探针进行不同的荧光标记）可以采用Multiplex的方法。

Multiplex对于Singleplex的优点：1，节约了样品的使用量，尤其是针对样品比较珍贵的情况；2，可以加快实验的速度，节约实验成本；3，避免了Singleplex的误差，因为目的基因与内参基因是在不同的反应管内得到的。

四．引物与探针的设计

QPCR引物设计与常规PCR引物设计的原则基本相同，需特别注意的就是为了尽可能使PCR扩增的效率达到100%，因此QPCR扩增产物的片段长度一般小于400bp，在设计引物的时候尽可能将产物长度控制的短些。

引物与探针设计的要求：1，高PCR扩增效率，接近100%；2，高特异性，扩增过程中没有非特异性产物；3，实验的重复性，相关系数接近1。

SYBR Green法（引物设计基本原则）

PCR扩增产物长度范围100~400bp，扩增片段中避免出现强烈的二级结构；

引物的GC含量为30~80%，最佳范围50~60%；

引物的Tm值范围为62~67°C，上、下游引物的ΔTm小于2°C；

引物序列中避免出现连续4个相同的碱基；

避免引物本身或引物间形成二级结构，在引物3’端最后5个碱基中避免出现2个以上的G或C；

引物最好设计在不同Exon的区域，其间含有一些比较大的Intron；

利用BLAST或其他引物设计软件（如Beacon Designer）对引物的特异性进行检查。

TaqMan探针法（引物设计基本原则）

PCR扩增产物长度范围70~150bp，扩增片段中避免出现强烈的二级结构；

先确定探针的位置与序列再设计相对应的引物；

引物的GC含量为30~80%，最佳范围50~60%；

引物的Tm值范围为58~60°C，上、下游引物的ΔTm小于2°C；

引物序列中避免出现连续4个相同的碱基；

避免引物本身或引物间形成二级结构，在引物3’端最后5个碱基中避免出现2个以上的G或C；

引物最好设计在不同Exon的区域，其间含有一些比较大的Intron；

利用BLAST或其他引物设计软件（如Beacon Designer）对引物的特异性进行检查。

TaqMan探针法（探针设计基本原则）

先确定探针的位置与序列再设计相对应的引物；

探针的GC含量为30~80%，最佳范围40~60%；

探针的Tm值比上、下游引物的Tm值高10°C；

探针5’端的第一个碱基不能是G；

探针5’端第一个碱基与上游引物3’端最后一个碱基的距离控制在1~10bp范围内；

探针序列中避免出现连续3个以上相同的碱基，尤其是G；

采用分析软件（如Beacon Designer）分析，避免探针本身或探针与引物间形成强烈的二级结构。

五．QPCR实验优化的3大指标

与引物、探针设计的要求相同，QPCR实验优化的目的就是获得：1，高PCR扩增效率；2，高特异性；3，良好实验的重复性；4尽可能广的检测动力学范围。一般在采用设计好的引物与探针进行大规模样品实验前，需要通过预实验确认PCR扩增效率、特异性、重复性并进行优化。

PCR扩增效率

无论采用绝对定量还是相对定量，PCR扩增效率越接近100%越好，因为在这种情况下实际的PCR扩增就越符合2n扩增，这样在相对定量时就能采用2-ΔΔCt的默认算法，结果更加准确。

判断PCR扩增效率的方法是采用含目的基因的质粒、PCR扩增产物、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等建立梯度（如10倍、5倍或2倍的稀释）进行类似于标准曲线的实验，实验结束后iCycler iQ数据分析软件会根据稀释度自动的计算扩增效率，公式如下：Efficiency = [10(-1/slope) ] – 1（扩增效率应在90~110%的范围内）

实验的重复性

实验的重复性采用相关系数（Correlation Coefficient，R值）进行评价，R值越接近1

说明实验的重复性越好，一般R值应大于0.99。

在上述判断PCR扩增效率的实验时，每个梯度可以设置3个复孔，实验结束后iCycler iQ 数据分析软件会自动计算出实验的相关系数。

PCR扩增的特异性

与常规PCR的要求不同（常规的PCR只要求能够扩增到靶序列即可，对产物的特异性要求并非很高），QPCR要求PCR扩增具有很好的特异性，尤其在采用SYBR Green方法时候。如果扩增过程中存在非特异性产物，这些非特异性的产物也会消耗反应体系中的试剂，从而降低扩增效率最终导致数据的不准确。

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更

为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利

实时荧光定量PCR全方位解析

实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧

实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤

实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：

（3）Ct值： CT值的重现性：

5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC

实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介

实时荧光定量 PCR 技术简介 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA 定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因 的定性和定量分析。现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料 与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA 探针对目标基因进行定量。 一、利用荧光染料进行定量 一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所 有的双链DNA 结合，并产生荧光。游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA 结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。 利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因 此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。 二、利用荧光探针进行定量 荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我 们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。 荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个 基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。在PCR 反应过程中，引 物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸 外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。每增加一条目 的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光 信号会逐渐增强。 1 / 2

实时荧光定量PCR具体实验步骤

以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR： 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 原理： 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性） 2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)； 3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录； 5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。 收费标准 优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量） （含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系

CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项

CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项1、开始运行仪器 1.1打开电脑 1.2打开定量PCR仪底座开关 1.3启动CFX Manager软件 2、放置样品 2.1将PCR反应体系加入到0.2ml底缘八联管，盖上管盖；或加入底缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须戴一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 3、设置程序，运行试验 3.1定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（protocol tab）b.设置反应板文件（plate tab）。c.点击‘‘start run’’键，运行程序。 3.2热循环程序文件（protocol tab）设置指南：点击edit（编辑）或create new （创建新程序）。 3.3反应板设置文件（plate tab）设置指南：选择本次试验所需要使用的荧光染料种类；单机样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（standard），点击‘‘dilution series’’键可设置其标准品浓度及稀释倍数。 3.4点击‘‘start run’’键。单击open lid（打开热盖）或close lid（关闭热盖）放置样品；单击start run，保存文件，开始运行程序。 4、结果分析 4.1PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和CT值等。 4.2如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。 4.3点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单。 5、关闭运行仪器 5.1实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电 源，关闭电脑。注意！CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。

DA7600实时荧光定量PCR仪确认方案模板

确认文件 类别：确认方案编号： 部门：质量部页码：共11页，第1页 DA7600PCR扩增仪 方案与报告 版次：新订替代： 起草：年月日 审阅会签： （确认小组） 批准：年月日

目录 1.概述 (2) 2.确认目的 (2) 3.确定确认范围 (3) 4.确定确认小组成员及职责 (3) 确认小组成员及确认小组负责人 (3) 人员 (3) 评价方法： (3) 标准： (3) 5.风险评估 (4) 评估概述 (4) 评估方法 (4) 6.确认内容 (7) .安装确认 (7) 安装信息 (7) 仪器放置检查 (7) 操作规程等资料确认 (8) 运行确认 (8) 基本称重功能确认 (8) 校正功能确认 (9) 性能确认 (9) 准确度 (9) 天平重现性检查： (10) 四角偏差检查： (11) 7确认计划安排 (11) 9.确认结果评定与结论 (11) 10.拟订日常监测程序及确认周期 (12)

1.概述 DA7600实时荧光定量PCR仪，是中山大学达安基因公司推出的具有全自动、实时监测、定量分析的DNA荧光检测系统。结合半导体致冷器实现PCR扩增过程，并通过高灵敏度的光电系统和高通量光纤导光系统对荧光信号进行实时监测，实现同时对样品的扩增和检测。友好的全中文计算机界面，可满足不同PCR实验的需求。其反应速度及准确性、操作实用性和使用灵活性均有较好的提高，能满足科研工作者对于定量PCR系统高通量方面的要求，是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。它主要有一台DA7600和PC计算机及显示器组成。 2.确认目的 通过用HCV荧光PCR检测试剂盒来确认DA7600实时荧光定量PCR仪的扩增和检测体系精密度、线性、准确度等，验证仪器能否正常准确运行，给出可靠的分析结果，以及48孔孔间差异是否在允许范围内。 3.确定确认范围 本方案适用于DA7600实时荧光定量PCR仪运行确认及性能确认。 4.确定确认小组成员及职责 确认小组成员及确认小组负责人 列出参加DA7600确认的所有人员名单，评价培训情况是否符合操作的要求。 评价方法： 查阅培训档案，确认是否对有关操作者进行了相关培训，包括：

免费实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR实验操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数×40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl ×0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：

实时荧光定量PCR仪技术参数

实时荧光定量PCR仪技术参数 主要用途： 用于基因表达分析研究，对转基因植物的评价和目的基因的定量分析，进行SNP单核苷酸多态性和突变位点的分析检测。 1.工作条件 1.1电源：AC 200-240 V，50－60HZ 1.2温度：15－32℃ 1.3湿度：20-80%(32℃时) 2.主要技术参数 *2.1加热方式：采用半导体加热方式，并结合银质散热模块 *2.2最大升温速度：≥4.8 ℃/s 2.3最大降温速度: 2. 5℃/s(升降温速率连续可调) *2.4控温误差:≤0.1 ℃ *2.5温度均一性:±0.1 ℃ * 2.6扩增速度:35循环反应:96孔检测≤60分钟；384孔≤40分钟 *2.7孔间检测的重复性:CV≤0.15% (50nmol/l荧光浓度) 2.8样本容量：96孔板为10－100ul，384孔板为3－20ul *2.9光源：高强度白色固态光源（寿命不低于20000小时） 2.10激发波长：5通道 *2.11检测通道：6通道 *2.12光学检测系统：冷CCD *2.13灵敏度：可检测单拷贝基因

2.14动力学范围：1-1010个拷贝，10个数量级。 *2.15样品通量：96个样本/次，可自行更换模块，更换后无需校准。 2.16检测模式：至少支持以下各种模式：HybProbe杂交探针、SimplProbe单探针、Taqman 水解探针、荧光染料（SYBR Green I）2.17高分辨率熔解曲线HRM：支持，并提供不少于150篇文献目录2.18 颜色补偿功能：具备 2.19软件：具有定性定量（绝对定量、相对定量）、自动报告熔解温度、自动报告基因分型结果、高分辨率熔解曲线分析等功能，配套的运行和结果分析软件，能够针对观察到的扩增情况随时增加循环数目，实时动态监测，扩增和检测同时进行 *2.20校正：无需ROX染料校正 2.21试剂支持：开放平台，可使用国产或进口的各品牌试剂。 *2.22装机指标：区分1000拷贝和2000拷贝模板浓度的差异。 2.23维护：日常免维护，机器移动后无需校正光路系统。 2.24 扩展性：具备LIMS（实验室信息管理系统）接口，可以实现远程控制并可以结合自动装载微孔板的工作站。 *2.25 临床认证：提供有效期内的SFDA注册证 三．仪器配置： 3.1 96-wells主机一台，96孔模块一个 3.2 操作手册 3.3 软件安装光盘 3.4 控制单元：设备配套原装进口电脑一套

荧光定量PCR流程和操作原理(收集整理)

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。