大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化(汇编)

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一可溶性蛋白的纯化

（一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机

2. 方法

2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。

2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

注意事项：

（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。

（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。

（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。

（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

二包涵体蛋白的纯化

1 菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）

1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机

1.2 方法

(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS 或20mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。

（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml -10ml裂解液)

（4）每毫升悬液中加入100ul 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。在冰上孵育15min

（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。

（6）4℃，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。

注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.

2 包涵体的洗涤

(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的Buffer A中，每克湿重加4-6ml 洗涤液。

(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。

(3) 4℃，4000 rpm/min离心15分钟。

(4) 重复上述操作2次至上清液透明无色。

(5) 将包涵体沉淀重悬于Buffer A，4℃，4000 rpm/min离心15分钟，弃掉上清。

注意事项：

(1) 包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。

(2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。

(3) 包涵体洗涤是纯化极重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。50mM Tris-HCl pH 8, 0.2mM EDTA, 100mM NaCl, 1% Triton x-100 （或2% 脱氧胆酸钠）1mM DTT 1mM PMSF 10mg/ml大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

(4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：

(1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的Buffer A中，4℃涡旋悬液30min ，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。

(2) 取一小部分上清用Buffer A稀释到盐酸胍浓度为4 M，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。

(3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用Buffer A稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。超声破碎

在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。离心 1.0～1.5ml 诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300～500μl的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。常规操作步骤如下（以100ml 培养液为例）：

（1）100 ml 诱导后的菌液（OD600=1.2 左右），12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体。

（2）加入预冷的缓冲液50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS 或者Tris-NaCl，针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂。

（3）向沉淀中加入15ml的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。

（4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％。

（5）分离上清和沉淀：12000 rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。

（6）SDS-PAGE 分析蛋白表达情况。

（7）准备纯化蛋白。

超声破碎注意事项与一些小的改进：

（1）破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。（4）尽量防止泡沫的产生。（5）大量破碎时将菌液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的破坏作用。（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁（10min，30℃），增加细胞的通透性。

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

第45卷　增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science ) Vol .45　Sup. M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项 (20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@https://www.sodocs.net/doc/3910982061.html, ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn 肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 朱红梅1 ,周涵韬 1,23 ,张赛群 1,2 ,曹　宜2,刘　波 23 (1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003) 摘要:通过电击转化法,将带有 gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧 光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段. 关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1] .猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P . 来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2] .在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现 对生物的活体监测[3] ,为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段. 本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价. 1　材料与方法 1.1　材　料 肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2 LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和 阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因. 蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs . BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜. 1.2　实验方法 (1)质粒提取方法 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5 α的单菌落,于10mL 含100μg ?mL -1 Amp 的LB 液体 培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4] .提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度. (2)感受态细胞的制备 在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用. (3)电击转化 2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h, 取100μL 菌液涂布在NA +100μg ?mL -1 Amp +6mg ?mL -1 阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h . (4)转化子的荧光检测 将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察. (5)标记菌株的PCR 鉴定 细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天

1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS

重组蛋白和多肽的分离纯化

重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生长 没有大的影响，通常可获得高的表 达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解 具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化(参考资料)

8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和

生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白

生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白

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实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 一、实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavon ol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 二、实验原理 黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。 本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

高中组 11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①

大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告

大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化 ●实验目的： 1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法 2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法 3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。 ●实验原理： 1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化. 4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC. 酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。该反应消耗一分子的三磷酸鸟苷以提供磷酰基。在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon 和ompT两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 关键词：蛋白质分离纯化 前言： 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达

第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达 前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 第一节基因的表达系统与表达策略 一、最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 二、宿主细胞的选择 （一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 （二）宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。 缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。

基因重组蛋白纯化流程

01.11 周总结 一、本周工作 01．05 20T—TB23 蛋白处理 1、分析昨天20T—TB23 蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清； 2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M 尿素溶解上清中目的蛋白较少， 6M 、8M 溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M 尿素去杂蛋白，用6M 尿素洗目 的蛋白；3、用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2mi n,12000rpm 离心15mi n,再重复一遍；4、用30ml 2M 尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl) 将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，进行电泳； 20T—I 56II12 菌体回收 1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min ； 2、去上清用20ml裂解 液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心 25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.06 20T—TB23 蛋白回收： 1.将跑20T—TB23 蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋 白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一 条宽1cm 左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到 透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS 缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白 溶液，稀释12 倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD 值为0.165,260nmOD 值为 0.098，C=(0.165*1.45—0.098*0.74) *12=2.0； 20T—I 56II12 蛋白处理： 1 用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl)将沉淀吹起，超声 2min,12000rpm 离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将 蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24 倍测蛋白浓度，280nmOD 值为1.041,260nmOD 值为 0.579，C=(1.041*1.45—0.579*0.74) *24=25.9；往上清中加2.6ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升于1.5ml 离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，共加4 板，进行电泳 01.07 协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12 蛋白 1准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上 (不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好)；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一

生物化学实验报告：Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白

实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 一、实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavon ol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 二、实验原理 黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。 本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中

外源性蛋白在大肠杆菌中的高效表达

提高外源性蛋白在大肠杆菌中的高效表达策略 本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养的特点，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。影响大肠杆菌中蛋白表达量的因素有载体启动子结构、质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素。在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行总结，以期有助于研究。 1.有效表达载体的构型 构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。其主要构件包括启动子、终止子、抗终止子、弱化子、绝缘子和增强子等。 1．1启动子 理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的[1]。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在 -35（±2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[2]。Shine-Dalgarno(SD)位点在翻译起始阶段与16S rRNA的3’端相互作用[3]。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率[4]。在RBS的5’和3’端均为A丰富区。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期。但目前发现在转录过程中部分启动子在转录为RNA后可引起导致转录后基因沉默，从而减少目的蛋白量（a）。某些启动子还识别特异性的RNA聚合酶（ rnap ），特异性的RNA聚合酶（ rnap ）可以分辨出不同的启动子结构，优先启动推动者与目的序列。（c）还有研究表明有关基因表达的假设增强子与启动子之间相互作用发生分子间的结构独立功能联合的复合体增强启动子功能，该结构具有特异性。并不是所有增强子与启动子都能发生功能联合的复合体（b）。 目前在E.coli中发挥作用的启动子很多。通常常被使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L(l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 1．2 终止子 在一个基因的3末端或是一个操纵子的3末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离，它是一种环状hexameric蛋白质和ATP解旋酶的活动。nusg ，nusa和nusb是以附加因素的形式参与终止进程。 rho依赖性终止作用是当rho与游离核糖体中富含C 的位点相结合后产生的， rho的ATP酶激活rho - mRNA的终止子作用，并为其提供能量，使rho能够在mRNA上向前移行;移行过程中是mRNA上的讯息进入六聚体的中心孔，当移行到转录底物释放rho的解旋酶时聚合酶停止工作转录终止（d，e）。

重组蛋白质的分离纯化 (1)

重组蛋白质的分离纯化 摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。 关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体 随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。 纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。 与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。 重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。 1 沉淀分离技术 1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低,不需要特别设备，操作简单、安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。 1.2 有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，降低水的活度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。其特点是：选择性高；其次，沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发即可除去。但是有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用，因而常常需在低温下进行操作。 1.3 等电点沉淀法其原理是通过调节溶液的pH值，使两性电解质在溶液pH值处于等电