WesternBlot实验详解(--)

Western Blot 实验详解

、实验材料

Western Blot 相关试剂：

甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。4 C 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习

30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水

37 C

溶解，定容至100ml 。4C 避光保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习

10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。分装，-20C 保存。

Western BIot 相关仪器：

电泳仪；转移仪；摇转仪。

二、实验原理

经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该

技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 文档收集自网络，仅用于个人学习

2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。

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10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。

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1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。7g 去离子水溶解，用浓盐酸调至

pH8.8，定容至1L 室温 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习

1M Tris-HCl （pH6.8） : Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至

pH7.5，定容至1L

存。 文档收集自网络，仅用于个人学习

10X TS （洗膜液）：在 800ml 去离子水，加入 NacI 90g ， 1M Tris-HCl （pH7.5） 100ml ，

水定容至1L 。工作液：1 X TS 室温保存。文档收集自网络，仅用于个人学习

1M Tris-HCl （pH7.5） ： Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至

存。 文档收集自网络，仅用于个人学习

10%SDS :称取十二烷基磺酸钠（SDS ）10g,加入约80ml 去离子水，

调 pH 至 7.2，定容至 100ml 。 文档收集自网络，仅用于个人学习

1X Transfer Buffer : 在 1L 大烧杯中加入 800ml 去离子水，加入

pH7.5 ，定容至 1L 室温保

去离子

室温保 68 C 加热溶解。用10%HCI 3.03g Trisgrams ， 14.43g

三、操作程序与结果判定 操作程序： 一）蛋白样制备 无双抗DMEM （ 10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h 后换含双抗 DMEM （ 10%血清），再过 22h 后处理细胞。 文档收集自网络，仅用于个人学习 吸出培养液，用 PBS 洗1-2次。 每个皿（60mm ）加入200-300UI 细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。 （最好处理完一个样品 后再处理另外的样品，不要同时处理 ）文档收集自网络，仅用于个人学习 用一次性 1ml 针筒吸出裂解的细胞液，注入 1.5ml 离心管中，用针筒吸打至清亮。 取 80ul 2 X Sample Buffer 混匀，37 度 30min ，沸水 10min , 1200rpm 10min 取上清， ，上样，剩余样品 -20 度储存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 ） SDS-PAGE

制备分离胶 5ml 加入组装好的玻璃板中，立即水封。 （一般配 10%分离胶） 待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶 3ml 插入梳子，待凝固。 胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。 用针筒吹净每个孔。 上样，通电电泳：浓缩胶电压 90V （约30min ）分离胶120V （约90min ）。 三）转膜（湿转） （100KD 以上 ），小的蛋白片段建议半干转膜。 海绵，滤纸在转膜液中浸泡， PVDF 膜在甲醇中浸泡 2min 。 在玻璃板上铺海绵， 五层滤纸， 用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上， 玻璃 棒赶走气泡，贴上 PVDF 膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。将其整体转 移到转膜夹上。 文档收集自网络，仅用于个人学习 12V 电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。 1. 2. 3. 4。 5。 冰浴， 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF 膜-五层滤纸-海绵-阳极

（四）封膜 1. 配制封膜液，在 20ml 1 X TBST 中加入 1g 脱脂奶粉（一块膜的用量） ，充分混匀倒入保 鲜盒中。 将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。 摇床上摇 2h 。 2. 3. （五） 一抗 把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇 （六） 二抗 1. 2. 4h 。 将一抗回收，放入 -20 度冰箱中。 在保鲜盒内加入 8ml 1 X TBST 摇床10min 3次。 8ml ）,摇床 2h 。

3. 倒掉冲洗液，加入二抗溶液（ （六）洗膜，显影，定影 1.

将二抗回收，放入 -20 度冰箱中。在保鲜盒内加入 8ml 1XTBST 摇床 10min 3 次。

2. 将A 、B 液按1:1配制，在一试管中各加 400UI 的A 液和B 液。

注明：ECL A 、B 液最好选用Pierce 公司的Super Signal West Picq 国产可选用碧云天的。 文档收集自网络，仅用于个人学习 3. 在工作台上铺好保鲜膜，在保鲜膜上滴一小滴 ECL 混合液，将洗好的膜放上，在膜上 滴 ECL 混合液，盖上保鲜膜，确定无气泡。 文档收集自网络，仅用于个人学习

关灯，黑暗中拿出胶片，折起一角，放在膜上，压膜（ 压膜必须带手套，且不能有水,

否则会有非特异性黑斑，压膜时间越长，条带越浓

）。文档收集自网络，仅用于个人学习

将压好的膜放入显影液中在红光下观察膜片上的条带。 用水冲洗，放入定影液中定影，用水冲洗，晾干。

结果判定

四、注意事项

1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。

因此，凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗

原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释。

文档

背景过 高

问题 目的蛋 白信号 弱

转膜效 率低

显色或 曝光后 无条带

4. 5.

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形成凝胶的试剂要有足够的纯度 ,激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度

,也

将影响凝胶的质量 ,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。 因此， 建议要根据不同温度 下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为

15-20 分钟最佳 ,对于浓缩胶最佳聚合时间为 8-10 分钟开始可见聚合。 灌完分离胶加水封 闭分离胶与外界氧气的结

合。 文档收集自网络，仅用于个人学习 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性 ,操作时应该戴手套口罩防护。 梳子插入浓缩胶时， 应确 保没有气泡， 可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生， 梳子拔出来时应该小心 ,不要破 坏加样孔，如有加样孔上

的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶 内。 文档收集自网络，仅用于个人学习 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品

,以减少蛋白质带的拖尾现象 。

为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 。

样品缓冲液中煮沸的样品可在 -20 C 存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解。 为减少蛋白质条带的扩散 ,上样后应尽快

进行电泳，电泳结束后也应尽快转印。 取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记 （如左上角 ）转膜时也应 用同样的方法对 PDVF 膜做上标记 （如左上角 ）以分清正反面和上下关系。

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10. 转膜时应依次放好 PDVF 膜与凝胶所对应的电极 ,即凝胶对应负极 ,PDVF 膜对应正极。

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

9.

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

GNS3环境下做vrrp实验

VRRP实验 在这个实验配置了两个VRRP组——vrrp 1和vrrp 2。在vrrp 1中，路由器R1为主虚拟路由器，R2为备用虚拟路由器；在vrrp 2中，路由器R1为备用虚拟路由器，路由器R1为主虚拟路由器。在两个路由器都正常工作的时候，PC1和PC2通过R1访问远端R3。 路由器R1的具体配置： R1(config-if)#int s1/0 R1(config-if)#ip add 200.0.1.1 255.255.255.0 R1(config-if)#no shutdown R1(config-if)#int f0/0 R1(config-if)#ip address 10.0.0.253 255.255.255.0 R1(config-if)#no shutdown R1(config-if)#vrrp 1 ip 10.0.0.253 R1(config-if)#vrrp 1 priority 200 // Priority change will have no effect whilst interface is VRRP address owner R1(config-if)#vrrp 1 preempt R1(config-if)#vrrp 2 ip 10.0.0.254 R1(config-if)#vrrp 2 priority 100 R1(config-if)#vrrp 2 preempt R1(config-if)#exit R1(config)#router rip R1(config)#ver 2 R1(config)#network 10.0.0.0 R1(config)#network 200.0.1.0 R1(config)#no auto-summary 路由器R2的配置： R2(config-if)#int s1/0 R2(config-if)# ip address 200.0.2.1 255.255.255.0 R2 (config-if)#no shutdown R2 (config-if)#int f0/0 R2 (config-if)#ip address 10.0.0.254 255.255.255.0 R2 (config-if)#no shutdown R2 (config-if)#vrrp 1 ip 10.0.0.253 R2 (config-if)#vrrp 1 priority 150 R2 (config-if)#vrrp 1 preempt R2 (config-if)#vrrp 2 ip 10.0.0.254 R2 (config-if)#vrrp 2 priority 200 R2 (config-if)#vrrp 2 preempt R2 (config-if)#exit

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

VRRP+MSTP+OSPF实验

VRRP+MSTP实验 要求： 1.client1属于VLAN2（19 2.168.1.1/24） client2属于VLAN3 （192.168.2.1/24） 2.SW1SW2 SW3运行MSTP+VRRP,SW1作为1.0的根桥（同时作为网关VRRP为MASTER）SW2作为2.0 的根桥（同时作为网关VRRP为MASTER） 3.SW1SW2之间链路聚合 4.用R1的两个环回口模拟OABOSS服务器IP分别为1.1.1.1，2.2.2.2 5.client1选择SW1到OABOSS ，client2选择SW2到OABOSS 6.SW1SW2 AR1之间运行OSPF协议 7.在AR1上起两个环回口模拟OABOSS服务器 8.CLIENT1和CLIENT2能相互通信并且二者都可以和OABOSS服务器通信

配置如下： AR1: interface GigabitEthernet0/0/0 ip address 172.16.1.2 255.255.255.0 # interface GigabitEthernet0/0/1 ip address 172.16.2.2 255.255.255.0 # interface LoopBack0 ip address 1.1.1.1 255.255.255.255//模拟OA网# interface LoopBack1 ip address 2.2.2.2 255.255.255.255//模拟BOSS网# ospf 1 area 0.0.0.0 network 1.1.1.1 0.0.0.0 network 2.2.2.2 0.0.0.0 network 172.16.1.2 0.0.0.0 network 172.16.2.2 0.0.0.0 # SW1: vlan batch 2 to 3 20 # stp instance 1 root primary stp instance 2 root secondary # stp region-configuration region-name xx instance 1 vlan 2 instance 2 vlan 3 active region-configuration # interface Vlanif2 ip address 192.168.1.251 255.255.255.0 vrrpvrid 1 virtual-ip 192.168.1.254 vrrpvrid 1 priority 120 # interface Vlanif3 ip address 192.168.2.251 255.255.255.0 vrrpvrid 2 virtual-ip 192.168.2.254 # interface Vlanif20 ip address 172.16.1.1 255.255.255.0

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

神州数码交换机VRRP实验

实验三十八、交换机VRRP实验 一、 实验目的 1、熟悉VRRP协议的使用方式和配置方法； 2、理解VRRP协议的适用场合。 二、 应用环境 VRRP和HSRP具有类似的功能，实现方法上略有不同，VRRP是由IETF提出，是一个标准协议，HSRP是由CISCO公司制定的。 VRRP（Virtual Router Redundancy Protocol，虚拟路由器冗余协议）是一种容错协议，运行于局域网的多台路由器上，它将这几台路由器组织成一台“虚拟”路由器，或称为一个备份组（Standby Group）。在VRRP备份组内，总有一台路由器或以太网交换机是活动路由器（Master），它完成“虚拟”路由器的工作；该备份组中其它的路由器或以太网交换机作为备份路由器（Backup，可以不只一台），随时监控Master的活动。当原有的Master出现故障时，各Backup将自动选举出一个新的Master来接替其工作，继续为网段内各主机提供路由服务。由于这个选举和接替阶段短暂而平滑，因此，网段内各主机仍然可以正常地使用虚拟路由器，实现不间断地与外界保持通信。 三、 实验设备 1、DCRS-7604（或6804）交换机2台 2、HUB或交换机1台 3、PC机2-4台 4、Console线1-2根 5、直通网线若干根

五、 实验要求 1、在交换机7604A和交换机7604B上分别划分基于端口的VLAN： 交换机 VLAN 端口成员 IP 1 24 10.1.157.1/24 DCRS-7604A 100 1 192.168.100.1/24 10 8-16 192.168.10.1/24 DCRS-7604B 1 24 10.1.157.2/24 100 1 192.168.100.2/24 20 8-16 192.168.20.1/24 2、PC1-PC4的网络设置为： 设备 IP地址 gateway Mask PC1 192.168.100.101 192.168.100.1255.255.255.0 PC2 192.168. 100.102 192.168.100.1255.255.255.0 PC3 192.168.10.2 192.168.10.1 255.255.255.0 PC4 192.168.20.2 192.168.20.1 255.255.255.0 3、验证： 无论拔掉192.168.100.1的线还是192.168.100.2的线，PC1和PC2不需要做网络设置的改变都可以与PC3和PC4通信。则证明VRRP正常工作。

最详细的WesternBlot过程步骤详解

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

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Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

路由与交换实验课7——VRRP协议

#RT1 sy System View: return to User View with Ctrl+Z. [RT1]int g0/0/0 [RT1-GigabitEthernet0/0/0]ip add 202.200.100.1 24 配置该端口IP地址 [RT1-GigabitEthernet0/0/0]vrrp vrid 1 virtual-ip 202.200.100.111 创建VRRP备份组并配置虚拟IP地址 %May 3 08:23:08:281 2017 RT1 VRRP/6/VRRP_STATUS_CHANGE: The status of IPv4 virtual router 1 (configured on GigabitEthernet0/0/0) changed from Backup to Master: Timer expired. [RT1-GigabitEthernet0/0/0]vrrp vrid 1 priority 120 配置路由器在备份组中的优先级，优先级越大选举成主路由器就越优先。 %May 3 08:23:41:281 2017 RT1 VRRP/6/VRRP_PRIORITY_CHANGE: The run priority of IPv4 virtual router 1 (configured on GigabitEthernet0/0/0) changed from 100 to 120: Config. [RT1-GigabitEthernet0/0/0]vrrp vrid 1 preempt-mode timer delay 20 配置备份组中的路由器工作在抢占方式，并配置抢占延迟时间为20S [RT1-GigabitEthernet0/0/0]int g0/0/1 [RT1-GigabitEthernet0/0/1]ip add 13.13.13.1 24 [RT1-GigabitEthernet0/0/1]quit [RT1]ip route-static 200.200.200.0 24 13.13.13.2 配置到200.200.200.0/24网段的静态路由。 查询VRRP明细 [RT1]dis vrrp verbose

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

华为和思科vrrp实验

华为和思科vrrp实验 下面是他发给我的设备配置: 华为：dis cur（vrp1。74－105）interface Ethernet0 ip address 192.168.1.2 255.255.255.0 vrrp vrid 1 virtual-ip 192.168.1.3 vrrp vrid 1 priority 150 vrrp vrid 1 track Ethernet1 reduced 35 vrrp authentication simple cisco interface Ethernet1 ip address 192.168.2.2 255.255.255.0 vrrp vrid 1 virtual-ip 192.168.2.3 vrrp vrid 1 priority 150 vrrp vrid 1 track Ethernet0 reduced 35 vrrp authentication simple cisco cisco:show run（IOS12.3) interface FastEthernet0/0 description link to switch ip address 192.168.1.4 255.255.255.0 speed 100 full-duplex vrrp 1 ip 192.168.1.3 vrrp 1 timers advertise 3 vrrp 1 timers learn vrrp 1 priority 120 vrrp 1 authentication text cisco ! interface FastEthernet0/1 description link to shenju ip address 192.168.2.4 255.255.255.0 speed auto full-duplex vrrp 1 ip 192.168.2.3 vrrp 1 timers advertise 3 vrrp 1 timers learn vrrp 1 priority 120 vrrp 1 authentication text cisco

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。

vrrp学习总结

VRRP学习总结 一、VRRP介绍 VRRP（Virtual Router Redundancy Protocol）虚拟路由冗余协议，通过配置VRRP，可以实现当主机的下一跳设备出现故障时，及时将业务切换到备份设备，从而保持通讯的连续性和可靠性。通过将多台设备虚拟为一台网关设备，将虚拟网关设备的IP地址作为用户的缺省网关实现与外部网络通信。当网关设备发生故障时，VRRP机制能够选举新的网关设备承担数据流量，从而保障网络的可靠通信。 如上图所示，在SwitchA和SwitchB上配置VRRP备份组后，VRRP备份组将 两台设备虚拟成一台网关设备，虚拟网关设备具有虚拟IP地址和虚拟MAC地址，主机只感知这个虚拟网关设备的存在，以它为网关与外部进行通信。正常情况下，用户侧的流量通过Master设备转发。当Master设备出现故障时，通过VRRP协商，从Backup设备中选举出新的Master设备，即SwitchB，继续承担流量转发 工作。 二、VRRP心跳线

如上图所示，在SwitchA和SwitchB上配置VRRP备份组，当Switch为其他厂商设备或者Switch上部署了某些特性（例如：配置VLAN内的未知组播报文丢弃功能）有可能会导致VRRP功能受到影响。 为了解决此问题，可以在SwitchA和SwitchB之间部署一条心跳线，用于传递VRRP协议报文。需要将Interface1和Interface2加入与VRRP备份组相对应的VLAN（例如，VRRP备份组配置在VLANIF100接口下，则需要配置Interface1和Interface2加入VLAN100）。 由于配置了心跳线之后，SwitchA、SwitchB和Switch之间会存在环路，还需要配置破环协议来破除环路（例如，可以配置STP协议来破除环路）。 三、VRRP缺省配置 四、VRRP主备 1.如上图，通过虚拟网关将交换机A和B虚拟为一台网关设备，虚拟网关 地址为10.1.1.111，正常情况下A 为master（通过vrrp vrid 1 priority 120，因为缺省为100），B为backup，当A出现故障之后，B状态变为Master。 当A恢复之后，等待自己设定的时间之后，A又转为Master状态，B又为

Western_Blot操作步骤

Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。