一 人皮肤成纤维细胞培养

Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta

Laboratory Procedures for Human Cell Culture

August 2004

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PRIMARY FIBROBLAST CULTURE

FROM HUMAN SKIN BIOPSY

This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy.

Equipment and materials

?Laminar flow hood

?CO2 incubator

?Inverted microscope

?Sterile surgical Instruments for microdissection

?BME fibroblast medium

+2 or Mg+2

?PBS 10x without Ca

?Collagenase type II (4mg/ml)

?Petri dishes 100 mm

?Pasteur pipettes

2

?Culture flask, 25 cm

?15 ml sterile plastic tube

BME Fibroblast medium

BME 80 ml

Foetal bovine serum 20 ml

Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml

Filter and store at +4°C, up to 1 month.

The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium.

Procedure 1

1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and

transfer these to a flask.

https://www.sodocs.net/doc/632489413.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue

fragments over the bottom surface of the culture flask.

3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to

evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue!

4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask

and place in CO2 incubator.

5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.”

6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it

three times a week.

Primary fibroblast culture from human skin biopsy

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7.The fibroblasts will start to grow from the minced fragments in 2-3 days. When

there are sufficient cells, they are detached enzymatically and plated in Petri dishes, or 75 cm2 culture flasks, for proliferation (see next steps: “Maintenance of ce ll cultures in dishes and flasks” and “Routine subculture of adherent cell lines”).The minced fragments in the flask will continue to produce cells for a while. Procedure 2

1.Add collagenase to BME medium containing 20% FBS; so that the ratio medium :

collagenase is 6:1, and filter.

2.Place the skin biopsy in a Petri dish, mince it into a coarse slurry using sterile

scalpel and transfer to a 15 ml sterile plastic tube containing the BME-collagenase solution.

3.Place the tube in incubator at 37°C for 24 hours.

4.The next day centrifuge at 1 600 g for 10 min.

https://www.sodocs.net/doc/632489413.html,ing a sterile pipette, remove supernatant and wash pellet twice with PBS.

6.Prepare 1.5 ml of BME fibroblast medium in 2 flasks.

7.Suspend the pellet in 1 ml of BME fibroblast medium, transfer 500 microliter of

suspension to each of the two flasks and distribute it over their bottom surface.

8.Place flasks overnight in CO2 incubator at 37°C tightly closed.

9.The next day, slightly unscrew the lid of the flasks.

10.After a few days, fibroblasts should start to grow; if cells have developed, replace

the culture medium with fresh medium after one week. From this point on, replace the culture medium three times a week.

MAINTENANCE OF CELL CULTURES IN DISHES AND FLASKS In culture, cells grow either as a single cell layer attached to specially treated plastic surfaces or in suspension. In order to keep adherent cells healthy and actively growing it is usually necessary to subculture them at regular intervals.

Equipment and Materials

?Laminar flow hood

?CO2 incubator

?Proliferating medium (BME fibroblast medium) pre-warmed to 37°C

?Petri dishes 100 mm

?Inverted microscope

Procedure

1.The general morphology and growth of a cell population, and the presence of any

microbial contaminants, should be checked regularly under an inverted microscope in phase contrast.

2.Dishes or flasks with cells at about 70% confluence are treated with trypsin; the

cells are then harvested and either frozen or divided for further proliferation (see below “Routine Subculture of adherent cell lines”). For dishes with non-confluent cells the medium is discarded and replaced with fresh medium:

Primary fibroblast culture from human skin biopsy

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7 ml for 100 mm Petri dishes

5 ml for 60 mm Petri dishes

5 ml for 25 cm2 flasks.

3.Medium has to be changed three times a week, usually Mondays, Wednesdays

and Fridays.

NB: When introducing medium to flasks, a new sterile pipette must be used for each flask; when changing medium in Petri dishes, one pipette may be used for 2 or 3 dishes if the cell line is the same, but the tip must be flamed at each passage.

Lids of flasks containing cells must be slightly unscrewed after being placed in the CO2 incubator.

ROUTINE SUBCULTURE OF ADHERENT CELL LINES Subculturing requires prior rupture of intercellular and cell-to-substrate connections using proteolytic enzymes such as trypsin. After the cells have been dissociated into a suspension of mainly single cells, they are diluted and transferred to new culture dishes containing fresh medium or to cryotubes containing freezing medium.

How often a cell line is subcultured depends on its growth properties which are determined by observation of cell growth under the microscope, and by counting. Equipment and Materials

?Laminar flow hood

?CO2 incubator

?Proliferating medium (BME fibroblast medium)

?PBS

?Trypsin-EDTA solution 1X

?Petri dishes 100 mm

?Inverted microscope

Procedure

Thaw trypsin at 37°C and allow PBS and proliferating medium to reach room temperature. Flask cultures containing tissue fragments:

https://www.sodocs.net/doc/632489413.html,ing a sterile pipette remove medium from flask and replace with 5 ml PBS in

order to eliminate serum residue that could inactivate the trypsin.

2.After a few minutes remove PBS (pipette) and add 1 ml trypsin

3.Place flask in incubator at 37°C for 3-5 minutes

4.Observe the cells under the microscope: if they are seen to be rounded, they are

detached, if most are not rounded, leave the suspension in the incubator for a further minute or two (until rounded).

5.Add 5 ml or more of proliferating medium (add volume equal to or more than that

of volume of trypsin) to inhibit enzyme activity.

https://www.sodocs.net/doc/632489413.html,e the tip of the pipette (or gently pipette up and down) to detach cells from the

bottom of the flask, but be careful not to touch, or detach, the tissue fragments.

7.Transfer the cells (pipette) to a 100 mm Petri dish containing 7 ml of proliferating

medium. Write the date, number of passages, and cell line code on the Petri dish lid and place in incubator.

Primary fibroblast culture from human skin biopsy

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8.The initial flask (treated with trypsin) is refilled with proliferating medium and

placed in incubator with cap slightly unscrewed.

Petri dish cultures:

1.Remove medium from Petri dish and add PBS (7 ml to 100 mm Petri dish, 4 ml to

60 mm Petri dish)

2.After a few minutes, remove PBS and add trypsin (1 ml to 100 mm dishes, 0.5 ml

to 60 mm dishes)

3.Place in incubator at 37°C for 3-5 minutes.

4.Check under the microscope that cells have detached and proceed as

trypsinization of flask cultures (above)

5.Add proliferating medium (volume equal to or greater than volume of trypsin

added) in order to inhibit trypsin activity.

6.Mechanically detach cells from dish surface with the help of a pipette tip, then

gently pipette the cell suspension up and down so as to obtain a suspension of individual cells.

7.Dispense appropriate aliquots of the cell suspension to new 100 mm Petri dishes

and add 6 ml of growth medium:

https://www.sodocs.net/doc/632489413.html,bel each new dish with cell line code, date and passage number. Place the

dishes in the CO2 incubator at 37°C.

9.The following day, check under the microscope that the cells have reattached and

are growing.

老化皮肤成纤维细胞的分析研究进展

老化皮肤成纤维细胞的研究进展 丛敬1，2，指导：吴景东1 <1 辽宁中医药大学，沈阳110032；2 沈阳医学院，沈阳110034 ） 【摘要】延缓皮肤老化，永葆青春是人类从未放弃的梦想。成纤维细胞作为真皮中主要细胞成分，已广泛应用于皮肤老化模型的建立和研究中。较系统的介绍了成纤维细胞的组织学结构与功能，其在细胞和分子水平影响皮肤老化的机制，对深入研究皮肤老化的机制、预防和治疗具有重要意义。 【关键词】成纤维细胞；皮肤老化；机制；中药研究 成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色，在组织创伤修复中发挥着重要的作用。随着年龄的增长，皮肤老化突显，可以表现为皮肤干燥粗糙，皱纹增多、加深，皮肤松弛，弹性下降等。这些临床表现都与成纤维细胞数量减少，合成功能下降或异常有关。因此，在皮肤老化的研究中，人们越来越关注成纤维细胞的结构和功能的改变及其对皮肤老化产生的影响。 1 成纤维细胞的组织学结构与功能 光镜下观察[1]，成纤维细胞胞体较大，常呈多突起的扁平星状。细胞核较大，扁卵圆形，着色浅，核仁明显。细胞质较丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞质内富于粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分[1]。在婴儿和青年人皮肤中，Ⅰ型胶原蛋白的含量约占70％，Ⅲ型胶原蛋白占30％。在衰老过程中，成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白增加，Ⅰ型胶原蛋白减少。成纤维细胞受损，还可以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降，皱纹增多，且难以平复。 2 成纤维细胞致皮肤老化的作用机理 皮肤老化包括自然老化和外源性老化两种形式，其发生、发展的机制十分复杂。成纤维细胞在致皮肤老化的过程中发挥着十分重要的作用。 2.1基因调控异常 紫外线照射可导致成纤维细胞急性DNA 光损伤和突变，形成环丁烷嘧啶二聚体和6- 4 嘧啶- 嘧啶酮光产物，光老化的成纤维细胞对其修复能力下降，表达参与细胞核外切修复的蛋白及其mRNA水平亦下降[2-3]。而光老化成纤维细胞DNA修复能力的下降是由于修复合成相关因子表达下降导致核苷酸切除修复后期功能障碍造成的[4]。 人类线粒体DNA

安徽医科大学研究生细胞培养技术考试重点.doc

2014年细胞培养重点 名词解释： 1组织工程应用工程科学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物。从而使组织工程学研究的内容、应用范围和任务更加明确。组织工程的主要n的或内涵是对人体器官和组织修复。 2.接触抑制.指细胞相互接触后失去运动的现象。 3.肿瘤干细胞肿瘤中具有自我更新并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。 4.平衡盐溶液简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。在生理盐水的基础上，分别加入了无机盐、葡萄糖以及少量酚红，具有维持渗透压，调节溶液的PII值，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离了成分的作用, 常用的BSS有PBS、Hanks液等。 5.密度抑制由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多，和生存空 间消失所引起细胞增殖抑制的现象。 6.去分化指己成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态，但是分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化的特点。 7.iPS诱导多功能干细胞即诱导多能干细胞，是指体细胞经过基因“重新编排”, 回归到胚胎细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞的分化能力。这种方法可以不需要用人胚胎或卵母细胞，就能制造干细胞。 8.confluent汇合指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。 9.细菌污染培养的细胞被细菌污染均会造成细胞受损和死亡，是细胞培养工作的大敌。 细胞发生污染时，常有培养液变浑浊和PH发生改变等现象，镜下观察细胞变形、生长缓慢或分裂相消失，以及细胞圆缩脱落等现象。常有抗生素预防该污染。 10.灭菌杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。 11.单克隆抗体，指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 问答题； 1 .试述“克隆”的基本概念并举例说明其在细胞培养工作中的实际意义。 克隆(Clone):指由从一个共同的祖先通过无性繁殖而来的、遗传上同一的细胞群或后裔；Clone也可作动词用，用于指细胞形成克隆细胞群的过程，即从群体中把单个细胞分离出来, 通过增殖形成细胞群或后裔的过程;

细胞培养室管理方法

细胞培养室管理的研究与探索 文章来源：中国实用医药作者：徐家英秦立强等 【摘要】本文从培养室的服务职能，培养室的技术交流，细胞培养室的建设，实验室管理制度建立的重要性等几个方面进行了研究与探索，充分发挥细胞培养室的潜能，从而达到有效提高研究质量的目的。 【关键词】细胞培养室；技术服务与交流；培养室建设与管理 实验室是高等学校从事科研的重要基地，营造一个好的实验研究环境对实验室管理和建设起着至关重要的作用。实验室管理质量的好坏，直接关系到实验研究是否进展顺利。良好的实验室建设，能给研究者带来愉快的心情，同时也能有效的提高研究质量。 细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分, 细胞培养技术是生命科学各研究领域的一种最基本、最重要、也是应用最广泛的研究技术之一。对于高等医学院校来说,各生物医学相关学科均建有细胞培养实验室，其规模、档次、技术水平、使用效率、管理模式、服务保障等方面都缺乏统一的标准，普遍存在着小而全、投资分散、资金浪费、缺乏有效管理、无法提供服务保障、不利于技术交流和创新等诸多问题。本文总结了笔者在细胞实验室管理与建设方面的一些经验，并与广大同行进行探讨。 1 细胞培养室的服务职能 细胞培养除了需要娴熟的操作技术外，更多的体现在培养技术的过程复杂，无菌要求严格。研究人员掌握该门技术的时间周期较长。如果成天陷入清洗，包装和消毒等简单繁琐的劳动中，就会影响研究人员专心致志地从事研究活动中更重要的环节。建立大型细胞培养室，由专人进行工作流程服务，实验室按研究人员的要求提供标准化、规范化的实验用品和材料，可以极大地提高细胞培养实验室的成功率，确保实验器材符合细胞培养的要求，减少研究人员的无谓劳动。因此可以将研究人员从烦琐的劳动中解放出来，安心从事更重要的研究活动。 2 细胞培养实验室的技术交流 细胞培养是一项通用的技术平台。但针对各个研究课题而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一个学科自建的细胞培养室，一般仅局限于本学科领域内有限的研究方向所必需的细胞培养方法和技术，对其它的特殊方法了解不多，因此不利于技术创新。即便是某个研究生掌握的新方法，常常由于毕业分配等原因离开科室，而使新的特殊技术不复存在，不利于特殊技术的建立和完善。 如果大型细胞培养室面向全校开放，自学科的研究人员中具有丰富科研经验的研究人员、博士、硕士等不同层次、不同研究目的和不同要求，他们相互之间不存在利害关系，容易交流，毫无技术保留。每个人的经验和教训很快为大家所用，可极大缩短技术学习的周期和提高新技术的交流。同时，实验室建立了技术档案制度，不同学科的研究人员探索的新技术不会因走人而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，为后来者提供更多的方便。 3 细胞培养室的建设 3．1 细胞培养室面积和房间安排实验室的面积应由实验台的长度、净化工作台的大小等仪器设备情况决定，同时还应考虑科研及实验人员有足够的空间，

3D细胞培养行业研究分析报告

3D细胞培养 2021-2026年中国3D细胞培养行业投资前景咨询报告 【报告编号】CB16688 3D细胞培养行业专项报告,包括3D细胞培养行业发展趋势,3D细胞培养前景预测,3D细胞培养市场规模,3D细胞培养全球,3D细胞培养品牌,3D细胞培养细分,3D细胞培养产业链,3D细胞培养政策,3D细胞培养机遇和挑战,3D细胞培养竞争格局,3D细胞培养重点企业,3D细胞培养集中度,全球3D细胞培养,3D细胞培养价格,3D细胞培养进出口,3D细胞培养区域结构等 第一章宏观经济环境分析 第一节全球宏观经济分析 一、2016-2020年全球宏观经济运行概况 二、2021-2026年全球宏观经济趋势预测 第二节中国宏观经济环境分析 一、2016-2020年中国宏观经济运行概况 二、2021-2026年中国宏观经济趋势预测 第三节3D细胞培养行业社会环境分析 第四节3D细胞培养行业政治法律环境分析 一、行业管理体制分析 二、行业相关发展规划 三、主要产业政策解读 第五节3D细胞培养行业技术环境分析 一、技术发展水平分析

二、技术革新趋势分析 第二章国际3D细胞培养行业发展分析 第一节国际3D细胞培养行业发展现状分析 一、国际3D细胞培养行业发展概况 二、主要国家3D细胞培养行业的经济效益分析 三、2021-2026年国际3D细胞培养行业的发展趋势分析 第二节主要国家及地区3D细胞培养行业发展状况及经验借鉴 一、美国3D细胞培养行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 二、欧洲3D细胞培养行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 三、日韩3D细胞培养行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 四、2016-2020年其他国家及地区3D细胞培养行业发展分析 五、国外3D细胞培养行业发展经验总结 第三章2016-2020年中国3D细胞培养市场供需分析 第一节2016-2020年3D细胞培养产能分析 一、2016-2020年中国3D细胞培养产能及增长率

以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林

·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.sodocs.net/doc/632489413.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.sodocs.net/doc/632489413.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.sodocs.net/doc/632489413.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病

成纤维细胞的最新用途

成纤维细胞的最新用途 一、自体成纤维细胞除皱整形技术的研究应用进展 1、培养的成纤维细胞去皱技术在整形外科上的应用 2005年Anon道在2002年ChelseWestminster医院用Isoagen治疗85％烧伤病人取得了被称为“接近奇迹”的效果。病人康复后说：“瘢痕的皮肤整个不再正常，但治疗后很多的活力回到了她脸上，朋友们见到她认为又回到了她自己，我不能想象有可能用任何其他的方法。” 2、作用原理： 注射培养的自体成纤维细胞制剂能促进软组织的强化作用和促进组织的再生用于除皱和软组织的缺陷，胶原蛋白的氨基酸组成和结构，具有组织细胞的支持功能，是构成皮肤的支架。胶原分子在成纤维细胞内合成并分泌到细胞外，在细胞内先合成多肽链，继之，3条前α链集聚，生成前胶原，即胶原分子的前体。前胶原分子分泌到细胞外间隙内以后受到限制性蛋白水解作用，消除分子的伸展肽而软化为胶原。在细胞外间隙内消除伸展肽后，胶原分子自发地排到成纤维。胶原交联后，纤维获得了所需的张力强度。注射培养的自体成纤维细胞制剂增加了皮肤成纤维细胞，促进胶原分子的合成、交联，使皮肤恢复弹性，皱纹消失。 二、成纤维细胞成骨作用的研究 1、成纤维细胞在骨折愈合中的成骨作用 成纤维细胞在骨缺损等特殊环境下同成骨细胞一起参与成骨过程。Chai

Parrasad]等通过电镜发现成纤维细胞分泌合成胶原纤丝,并在胶原纤丝内沉积钙盐结晶,在纵形排列的胶原纤丝内可以看到64 OA的周期带。软骨细胞合成分泌的是Ⅱ型胶原;而成纤维细胞及成骨细胞合成分泌的是Ⅰ型胶原,两种细胞合成分泌的Ⅰ型胶原,无论在形态上,还是在生化结构上是完全一样的。成纤维细胞形成基质小泡,并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成毛球状钙球,钙球合并融合成为骨组织。金大地在骨缺损修复的超微结构中发现了不同发育阶段的成纤维细胞的成骨现象。 2、作用原理： 在骨折愈合实验及成纤维细胞体外培养实验研究中均已被证实。成纤维细胞在骨折修复中不仅对早期形成的纤维骨痂起到固定作用;在以后阶段中,纤维骨痂中的成纤维细胞两种途径演变为骨组织,成为两种相互联系的细胞。体外培养成纤维细胞证实,成纤维细胞不仅能分泌胶原、软多糖等基质成份,在细胞胞浆内及培养液中, ALP活性检测均为阳性,且能分泌大量骨小结节。成纤维细胞的固有发生性只有在特殊环境特殊需要的条件下才能表现出来;一些成骨因子在成纤维细胞骨化过程中起到诱导作用。这就提示我们在骨诱导因子的作用下,成纤维细胞不仅参与骨折愈合,在病理状态下,这种具有游走性的成纤维细胞可能发生局部浸润及成为组织病理性钙化和骨化的原因之一。

细胞工程知识点

细胞工程知识点 1、细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。 2、细胞工程的应用： 1)动植物快速繁殖技术：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物 2)新品种的培育：细胞融合、细胞水平的重组 3)细胞工程生物制品：单克隆抗体制备、疫苗生产 4)细胞疗法与组织修复： 2细胞工程理论基础 1、细胞全能性：每个活的体细胞都具有像胚性细胞那样，经过诱导能分化发育成为一个新个体的潜在能力，并且具有母体的全部的遗传信息。 2、细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程。 3、细胞的脱分化：在一定营养和刺激因素作用下,具有特定结构与功能的植物组织的细胞被诱导而改变原来的发育途径,逐步失去原来的分化状态,细胞特性消失,转变为具有分生机能的细胞,并进行活跃的细胞分裂,这一过程称为去分化。 3细胞工程技术 1、实验室条件：组成：准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室。 2、无菌技术、显微技术、细胞观察与分析、细胞分离、细胞保存与复苏 （1）细胞保存方法传代培养保存法低温冷冻保存法(低温、超低温保存) 液体固化的方式（形成冰晶、形成无定型的玻璃化状态） 玻璃化指液体转变为非晶态（玻璃态）的固定化过程，在此状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因此不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。 冷冻方法（缓慢冷冻法、快速冷冻法预冷冻法包括逐级冷冻和两部冷冻） 细胞复苏按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。 复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 细胞培养和代谢调控：

一 人皮肤成纤维细胞培养

Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.sodocs.net/doc/632489413.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.

细胞工程重点总结

细胞工程 （1）绪论 1．根据研究对象的不同，细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程。 2．克隆羊多莉的诞生证明了动物细胞核具有全能性。 （2）第一章基本技术 1. 培养基基本成分 大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十毫克到几千克。 ①无机盐类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素微量元素的用量一般低于10-5-10-7克分子浓度。植物所的 微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mn、Mo、Co ②有机成分：糖、维生素、肌醇、氨基酸、其他 ③植物激素：生长素、细胞分裂素 ④水：不同实验室要求使用不同级别的纯化水 ⑤其它附加成分：琼脂、活性炭、附加复合成分 2. 外植体(explant)：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。 外植体的三种来源：①生长在自然环境下的植物 ②在温室控制环境条件下生长的植物 ③无菌环境下培养的植物 3. 外植体取材总体原则:①根据培养需求选择植物部位 ②多年生植物注意树龄和季节 ③在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作为外 植体 4. 外植体灭菌顺序：外植体→清洗整理→杀菌剂灭菌→无菌水清洗 外植体灭菌后应及时接种培养 5. 外植体培养条件的控制 ①光照光照时间影响外植体再生状态；光照强度因植物类型不同而异；光质 研究报道较少 ②温度适温有利于细胞分裂，而在一定范围内降低培养温度则使细胞的质量 增加。 ③pH 通常使用的pH值范围是5.5—6.5。pH在4.0以下或者7.0以上培养 物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引起培养过程中的pH变化； 高压灭菌引起pH值变化 ④气体生长量与气体含量关系呈现倒“V”形，折点处的气体含量对应最大生 长量

干细胞培养基行业进出口分析报告

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干细胞培养基行业进出口分析 (最新版报告请登陆我司官方网站联系) 公司网址: https://www.sodocs.net/doc/632489413.html, 1

目录 干细胞培养基行业进出口分析 (3) 第一节2015年出口分析 (3) 一、我国干细胞培养基行业出口总量及增长情况 (3) 二、干细胞培养基行业经营海外市场的主要品牌 (3) 三、国内外经济形式对干细胞培养基行业出口的影响 (3) 第二节2015年进口分析 (4) 一、我国干细胞培养基行业进口总量及增长情况 (4) 二、进口品牌对干细胞培养基行业的促进与影响 (4) 三、国内外经济形式对干细胞培养基行业进口的影响 (4) 第三节进出口政策 (5) 一、贸易政策 (5) 一、对外贸易经营者在中国必须是经国务院对外经济贸易主管部门许可的企业，主要有以下几种： (5) 二、关于出口退税 (6) （2）出口退税附送材料 (7) 二、倾销与反倾销 (8) （1）产品以低于正常价值或公平价值的价格销售； (8) 1、销售鲜活商品 (9) 2、处理有效期限即将届满的商品或者其他积压的商品 (9) 3、季节性降价 (9) 4、因清偿债务、转产、歇业降价销售商品 (9) 三、区域或本土保护政策 (16) 四、贸易壁垒 (16) 2

干细胞培养基行业进出口分析 第一节2015年出口分析 一、我国干细胞培养基行业出口总量及增长情况 图表 1 2014-2016年3月我国干细胞培养基行业出口分析 数据来源：海关总署二、干细胞培养基行业经营海外市场的主要品牌 目前国内市场上出现的国外品牌干细胞培养基主要有：美国英杰、SAFC Bio、Hyclone等。 三、国内外经济形式对干细胞培养基行业出口的影响 全球金融危机以来,我国出台了密集的扩大消费政策,但是这些政策主要针对的是“常规消费”。随着我国经济逐步走出金融危机的阴影,制约“常规消费”的瓶颈将得到缓解,只需要保持消费政策的连续性,“常规消费”就会保持平稳较快增长。但是由于灾害频发、行政垄断、进口限制和政策缺失等原因,“非常消费”问题在后危机时代显得尤为突出。因此,建议鼓励开发防灾应急商品, 3

高中生物选修三专题二细胞工程知识点总结归纳和答案

植物细胞工程和动物细胞工程默写 1、细胞工程是在或的操作 2、细胞工程按操作对象分为和 3、植物细胞工程通常采用的技术手段是：和 4、植物组织培养的理论基础是： 5、理论上每一个活细胞都应该具有。因为 6、受精卵的全能性最高，受精卵生殖细胞体细胞 7、为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？ 8、植物组织培养的外界条件：， 内在原理是： 9、植物组织培养的过程：经过形成 经由过程形成，最后移栽发育成。 10、是指已分化细胞经诱导，失去其特有的结构和功能而变为未分 化细胞的过程。 11、是指由外植体长出来高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成 的排列疏松无规则的组织。 12、植物体细胞杂交的意义（优势）：。 13、去除细胞壁的常用方法：（纤维素酶、果胶酶等） 14、人工诱导原生质体融合方法：物理法：等； 化学法： 15、融合完成的标志是： 16、植物体细胞杂交过程包括：和。 17、植物体细胞杂交的原理是：和 18、人工种子的特点是： 19、作物脱毒(1)材料: (2)脱毒苗: 20、单倍体育种：(1)方法: (2)优 点: ; 21、动物细胞工程常用的技术手段： (基础)、、 、

22、动物细胞培养的原理是：。 23、用处理，一段时 间后获得单个细胞。 24、细胞贴壁： 25、细胞的接触抑制： 26、原代培养：，培养的第1代细胞与传10代以 内的细胞称为原代细胞培养。 将原代细胞从培养瓶中取出，用处理后配制成，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为 27、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为 28、细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡， 少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代 细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失 去接触抑制，容易传代培养。 29、动物细胞培养的条件：1. 2. 3. （培养 液的Ph为7.2-7.4）4. 30、细胞所需营养：等， 按种类和所需数量严格配制而成的合成培养基。培养基内还需加入、等天然成分 31、动物细胞培养所需的气体环境：95%的空气和5%的二氧化碳的混合气体。氧 气：；二氧化碳： 32、植物组织培养和动物细胞培养的比较：

人皮肤成纤维细胞的获取-

人皮肤成纤维细胞的获取 一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织 二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素 三、方法： 1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。 2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml 离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。 3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉 素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。 4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。或在PBS清洗前，用70% 酒精浸泡半分钟。 5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织 转移到新的皿中。 6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。 7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。 8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织 块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。 9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿 轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。 10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。 11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传 代。剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。

细胞培养实验室的设置及设备

一、细胞培养实验室的设置及设备 （一）细胞培养实验室的设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。

无菌操作间的空气消毒： 紫外线灯—－产生臭氧，并且室温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。 空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。 表1 洁净室（区）空气洁净度级别表 洁净度级别尘粒最大允许数／立方米微生物最大允许数浮游菌／立方米沉降菌／皿 100级3,500 0 5 1 10000级350,000 2,000 100 3 100000级3,500,000 20,000 500 10 300000级10,350,000 60,000 - 15 无臭氧紫外线消毒器 电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。

增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较

论著 【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03 【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。 增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较 李卫华1,李德水2,刘洪琪2 (武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162) 摘　要:　【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和 bF GF 对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性 瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF 、PD GF 和 bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白 合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。 关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子 【文章编号】　100825041(2005)022*******　【中图分类号】　R32912　【文献标识码】　A The study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulation L I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China) Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF 增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑 狼疮样基因表现型改变。G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢

细胞培养各种培养基简介

DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞