冰冻切片的免疫组化染色步骤
速冻组织
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内(直径2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮内,大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用,或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗,5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗,5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。
石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法(以SP试剂盒为例)
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗,2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗,2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗,2分钟×3次。
10. 显色剂显色(DAB或AEC)。
11. 自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。
二步法(以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例)
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。
3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。
4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗,2分钟×3次。
6. 滴加试剂1(Polymer Helper),室温或37℃孵育20分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。
7. 滴加试剂2(poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG),室温或37℃孵育20~30分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。
8. PBS冲洗,2分钟×3次。
9. 显色剂显色(DAB或AEC)。
10. 自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。
荧光抗体染色方法
免疫荧光染色方法注意是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能的小,不溶解或不变性,原有位置不扩散或不移位。因此,对标本的处理一般速度要快,温度要低。恒冷切片和涂片较为理想。因此,抗体溶液的pH值和反应温度越低,孵育的时间越长。一般37℃时需要25~60分钟。若要作细致观察或者当天不能进行染色标本的观察,可在5℃中过夜,但染色标本最好是当天观察。
1、直接染色法
直接染色法是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应,是免疫荧光技术中最基本、最简单的染色方法。
(1) 固定:切片或涂片标本用95℃乙醇或丙酮固定。
(2) 冲洗:以PBS(pH7.4)充分冲洗。
(3) 染色:滴加相应的荧光抗体液,将标本放入带有湿纱布的搪瓷盒中,在37℃作用30分钟。
(4) 冲洗:倾去作用液用PBS充分冲洗。
(5) 观察:标本晾干或者加介质(缓冲甘油液)和盖片观察。
直接法首次试验时需作以下对照:
标本加正常未免疫的同种动物的标记球蛋白溶液进行染色,呈阴性反应。
标本先加同类未标记抗体作用30分钟后,PBS冲洗,再加荧光标记抗体染色。因标记内抗原已未标记的特异性抗体反应,不再与荧光抗体结合,所以应呈现阴性反应。
2、间接染色法
间接染色法分双层法和夹层法
(1) 双层法:双层法主要定位抗原和鉴定未知抗体。
① 固定:标记用丙酮或95%乙醇固定。
② 冲洗:以PBS(pH7.4)充分冲洗。
③ 第一次作用:被检标本滴加未标记的第一抗体液,并将其放入带有湿纱布的搪瓷盒中,在37℃作用30分钟。
④ 冲洗:倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤ 第二次作用:标本滴加荧光抗体(抗体Ⅱ)液,再放入湿搪瓷盒中,在37℃作用30分钟。
⑥ 冲洗:倾去作用液,以PBS充分冲洗。
⑦ 观察:标本晾干或者加介质和盖片观察。
首次试验时需作以下对照:
① 标本直接滴加抗免疫球蛋白荧光抗体,呈阴性反应。
② 标本加同种动物的未免疫血清,以PBS冲洗后,再加抗免疫球蛋白荧光抗体溶液染色。因未免疫动物的血清中无特异性抗体,应呈阴性反应。
(2) 夹层法:夹层法主要示踪细胞内的免疫球蛋白
① 固定:标本用丙酮或95%乙醇固定。
② 冲洗:PBS冲洗。
③ 第一次作用:标本首先滴加与标本内抗体相应的抗原,放湿搪瓷盒中,在37℃作用30
分钟。
④ 冲洗:倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤ 第二次作用:标本加标记的荧光抗体溶液,放入湿搪瓷盒中,在37℃作用30分钟。
⑥ 冲洗:倾去作用液,以PBS充分冲洗。
⑦ 观察:标本晾干或者加介质和盖片观察。