棉花转基因
基金项目：863子项目“特殊生境植物资源的开发利用技术”（No ：2007AA021401）转基因专项“转新型基因的棉花种质资源材料创造”（No ：2008ZX08005-004）。
第一作者简介：张煜星，男，1967年出生，副教授，博士生，从事植物基因工程研究。通信地址：571101海口市城西学院路，中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室周鹏转张煜星，Tel ：015109875070，E-mail ：zyx2027193@https://www.sodocs.net/doc/734796859.html, 。
通讯作者：男，1963年出生，研究员，博士生导师，从事植物基因工程研究。E-mail ：Zhp6301@https://www.sodocs.net/doc/734796859.html, 。
收稿日期：2009-04-16，修回日期：2009-05-07。
棉花accD 基因植物表达载体的
构建与遗传转化的研究
张煜星1,2,3，崔燕3，祝建波3，周鹏2
（1海南大学农学院，海南儋州571737；
2中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室，海口571101；
3石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆石河子832003）
摘要：乙酰辅酶A 羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。采用PCR 方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase 羧基转移酶β-CT 亚基编码基因accD ，ACCase 羧基转移酶α-CT 亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD 基因进行体外重组，构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD 。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥，收种子，在含卡那霉素的MS 培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草，经不定芽诱导、生根培养，获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR 、RT-PCR 检测后，初步表明目的基因已在植株中转化成功，并可以正常转录。
关键词：陆地棉；拟南芥；accD 基因
中图分类号：S336文献标识码：A 论文编号：2009-0791
Construction of Plant Expression Vector on accD Gene fom Gossypuum hirsutum
and Its Genetic Transformation Zhang Yuxing 1,2,3,Cui Yan 3,Zhu Jianbo 3,Zhou Peng 2(1College of Agronomy,Hainan University ,Danzhou Hainan 571737;
2National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops,
Institute of Bioscience and Biotechnology,CATAS,Haikou,571101;
3Laboratory of Agricultural Biotechnology ,College of Life Science,Shihezi Universit ,Shihezi Xinjiang 832003)
Abstract:The acetyl-CoA carboxylase (ACCase)is the rate-limiting enzyme of fatty acids synthesis.The accD Gene and transit peptide of CAC3Gene was amplified from Gossypuum hirsutum Genome and Arabidopsis thaliana Geneome.Plant Expression Vector of Fusion Transit Peptide of CAC3Gene and accD Gene was constructed.The Vector of pBI-CAC3tp -accD were transferred into Agrobacterium tumefaciens https://www.sodocs.net/doc/734796859.html,ing infiltration and leaf discs method,the gene were transferred into Arabidopsis thaliana and tobacco cell.The seeds of Arabidopsis thaliana were selected on solid medium containing Kanamycin.Transferred leafs of tobacco were selected on solid medium containing Kanamycin.Transgenic Arabidopsis thaliana (T1)and tobacco plants were found containing purpose gene by PCR.After RT-PCR,it shows that the CAC3tp -accD gene could transcript normally.Key words:Gossypuum hirsutum,rabidopsis thaliana,accD Gene
中国农学通报2009,25(18):36-40
Chinese Agricultural Science
Bulletin
0引言乙酰辅酶A 羧化酶(acetylCoA carboxyl-ase ，ACCase)是脂肪酸生物合成的关键酶，是碳流进入脂肪酸生物合成的重要调控位点[1-4]。生物体中ACCase 有2种类型，一种是异质型(heterom-eric)，另一类为同质型(homomeric)。在构成异质型ACCase 的4个亚基中β-CT 较为特殊，它由叶绿体基因组中的accD 基因编码。脂肪酸合成的前体是乙酰辅酶A ，它首先在ACCase 的作用下羧化形成丙二酰CoA 。然后脂肪酸合成酶以丙二酰辅酶A 为底物进行连续的聚合反应，以每次循环增加两个碳的频率合成酰基碳链，进一步合成16~18碳的饱和脂肪酸。高等植物中饱和脂肪酸的合成在叶绿体基质中进行[5]。鉴于ACCase 在脂肪酸生物合成中的关键作用，人们期望能通过超量表达ACCase 基因提高油菜、大豆、芝麻和向日葵等油料作物的种子含油量。如Roesler 等[6]将油菜种子贮藏蛋白napin 特异表达启动予与拟南芥同质型ACCase 基因ACC1融合，在大豆Rubisco SSU 转移肽的转运下，成功实现了定向将胞质溶胶ACCase 导入于油菜叶绿体，获得的转基因油菜T1代。Davis 等[7]将噬菌体T7强启动子与大肠杆菌ACCase 酶4个亚基编码基因连接(accB 、accC 、accD 和accA 依次排列)，构建成一个细菌多顺反子，用其转化了大肠杆菌。笔者根据NCBI 公布的陆地棉ACCase 羧基转移酶β亚基基因序列采用PCR 方法克隆了accD 基因，使该基因与拟南芥羧基转移酶α亚基编码基因CAC3中定位于叶绿体的转运肽相连，构建植物表达载体pBI-CAC3tp-accD ，用CAC3基因转运肽介导的叶绿体间接转化方法转化拟南芥和烟草。为将来实现转基因植物的脂肪酸含量的调控奠定了基础。1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料陆地棉（新陆早17号）由新疆农垦科学院棉花所惠增；哥伦比亚生态型拟南芥由北京大学蛋白质及植物基因工程实验室林忠平教授惠赠；烟草(Nicotiana tabacum var.Winsconsin38)由石河子大学植物病毒研究室刘升学博士提供，无菌苗由石河子大学农业生物技术重点实验室培养；烟草NC89由石河子大学农业生物技术重点实验室提供；1.1.2植物表达载体pBI121-CAC3tp-accD ，构建方法参见张煜星等[8]，由石河子大学农业生物技术重点实验室保存。
1.2方法
1.2.1引物的设计根据NCBI 公布的陆地棉ACCase 羧基转移酶β亚基基因(accD )的序列，设计了一对引物P1：5-ATCGATATGGAA ATAGAGGCAAGAAAGC-3，P2：5-GAGCTCACAAAGTCA AAGCCCATT ACG C-3，在其上游引物5’引入ClaI 位点，在其下游引物5’引入SacI 位点。根据NCBI 公布的拟南芥ACCase 羧基转移酶α亚基基因(CAC3)的序列，设计一对扩增转运肽（CAC3tp ）引物P3:5-TCTAGAGAACTCAACGCAA AAAATGGC-3，P4:5-ATCGATTACATCAACAATCTT CTTCTCCAA T-3，在其上游引物5’引入XbaI 位点，在其下游引物5’引入ClaI 位点。
1.2.2渗透法转化拟南芥将拟南芥的种子（T0）放于4℃春化3天，播种于花盆中，放于温室中，高湿度，强光照8h ，约经过2月，可进行转化试验，转化前浇水，使气孔打开，提高转化效率。活化农杆菌pBI121-CAC3tp-accD 至OD 1.0左右，离心沉淀菌，去上清，用500ml 含5%蔗糖加表面活性剂Silwet-77100μl 溶解菌体，即可进行转化试验。将开花的拟南芥倒置于烧杯中，浸没10min ，平放3min ，等水干后，用保鲜膜包裹，放于黑暗中16~24h ，撕去保鲜膜。调整光照16h ，1个月后收集种子（T1代）。将所收集的种子消毒后在无糖MS(含Kan 50mg/L)培养基中发
芽，进行筛选。培养基中加入Kan 200mg/L 继续进行筛选，将生长良好的幼芽由培养基转移到蛭石中，调整光照，1个月后可再次收集种子（T2代）。
1.2.3叶盘法转化烟草将农杆菌接种至含抗生素LB 固体平板上，28℃恒温培养24~48h ；挑取一单菌落接种至含抗生素的LB 液体培养基中，28℃恒温培养；取200μl 上述培养物，加入到20ml 含抗生素的LB 液体培养基中，28℃，250r/min 振荡培养4~5h ，至OD 600=
0.3~0.4；将此培养物离心，收集菌体，用MS 液体培养
基重悬菌体，即为转化用的侵染液。
取无菌烟草小苗的叶片，剪成1cm 2左右的小块
（切掉叶边），将剪好的叶片放入农杆菌悬液中，放在28℃摇床上轻摇10~15min ，取出叶片，用滤纸吸干菌液，
铺在共培养培养基（MS+6-BA 2mg/L +IAA 0.3mg/L ）暗共培养2~3天后转移到筛选培养基上（MS+6-BA 2mg/L +IAA 0.3mg/L +Kan 50mg/L+Carb500mg/L ）
20天换一次培养基，大约2~3周可诱导出不定芽。待不定芽长至1cm 左右时，将其切下接到生根培养基
（MS+IAA 0.3mg/L +Kan 50mg/L+Carb 500mg/L ）行生根诱导，10天左右开始有根生成，待根系发达时，将
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中国农学通报
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1234567M
2000bp
1000
bp
750bp
500bp 250bp
100bp
1614
bp 12M 32000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
2012
bp 1234M
2000bp 1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
398bp 图2pBI-CAC3tp-accD 的CAC3tp PCR 鉴定
注：LaneM ：DNA Marker DL2000；Lane2~4：pBI-CAC3tp-accD 的CAC3tp -PCR ；Lane1：
阴性对照。
图1pBI-CAC3tp-accD 的accD PCR 鉴定注：LaneM ：DNA Marker DL2000；Lane1~2：pBI-CAC3tp-accD 的accD PCR ；Lane3：阴性对照。12M 32000bp 1000bp
750bp 500bp 1614bp 根系生长良好的转化植株，转入土中，置温室培养。1.2.4转基因拟南芥、烟草的检测按简易方法(0.5mol/L NaOH ，100mmol/L Tris)提取转基因拟南芥（T1代）和烟草的基因组DNA ，以转基因拟南芥、烟草基因组DNA 为模板，分别以相对应基因的上下游引物进行PCR 扩增，未转化的拟南芥和烟草植株基因组DNA 为模板的PCR 扩增反应产物为阴性对照。PCR 反应结束后，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物。对PCR 结果为阳性的拟南芥和烟草植株用TRNZOL 试剂提RNA ，进行RT-PCR 检测基因是否能够正常转录。2结果及分析
2.1植物表达载体pBI121-CAC3tp-accD 的鉴定提取pBI121-CAC3tp-accD 质粒，分别用accD 和CAC3tp 上下游引物进行PCR 检测，分别得到1614bp 和398bp 的accD 和CAC3转运肽目的片段（见图1，2）。将pBI121-CAC3tp-accD 质粒用XbaI/SacI 双酶切，得到2012bp 的CAC3tp-accD 全长目的片段（见图3）。表明CAC3tp-accD 基因已经构建到植物表达载体pBI121上。对插入片段进一步进行核苷酸序列分析，结果表明，基因大小为2012bp ，与设计相符，且阅读框正确。
2.2转CAC3tp-accD 基因拟南芥、烟草的PCR 检测筛选的拟南芥和烟草都扩增出了目的片段1614bp （图4，5），与设计相符，PCR 检测结果表明：初步筛选出转基因烟草植株和转基因拟南芥植株。2.3转基因拟南芥、烟草的RT-PCR 检测对PCR 结果为阳性的拟南芥和烟草植株用TRNZOL 试剂提RNA ，进行RT-PCR 检测基因是否能
够正常转录。基因的扩增结果与理论上也一致，说明accD 基因已经在拟南芥（图6）和转基因烟草（图7）中表达。
2.4转基因拟南芥、烟草的培养
收集转化后的拟南芥种子，在含Kan(50mg/L)的
图3pBI-CAC3tp-accD 的XbaI/SacI 酶切鉴定注：LaneM ：DNA Marker DL2000；Lane1~2：pBI-CAC3tp-accD Xba I/Sac I ；Lane3：the plasmid of pBI -CAC3tp-accD ；Lane3：the plasmid of pBI-CAC3tp-accD 。
图4转CAC3tp-accD 部分拟南芥PCR 检测
注：LaneM ：DNA marker DL2000；Lane1~6：Amplification of accD from transgenic Arabidopsis thaliana ；Lane7：阴性对照。
··
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1234M 4500
bp 3000bp
2000bp 1200bp
800bp 500bp 2012bp 图7转pBI121-CAC3tp-accD 烟草RT-PCR 检测
注：LaneM ：DNA marker III ；Lane1~3：Amplification of
CAC3tp-accD from transgenic tobacco ；Lane4：阴性对照。
图6转pBI121-CAC3tp-accD 拟南芥RT-PCR 检测
注：LaneM ：DNA marker DL2000；Lane1~5：RT-PCR of accD from transgenic Arabidopsis thaliana ；Lane6：阴性对照。
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2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
1614
bp 图5转CAC3tp-accD 部分烟草PCR 检测注：LaneM ：DNA marker ；Lane1~3：Amplification of accD from transgenic tobacco ；Lane4：negative control 。123M 44500bp 3000bp 2000bp 1200bp
800bp 500bp 1614bp MS 培养基中进行筛选，筛选效果不是很明显，发芽的拟南芥其叶片没有明显差别，继续在培养基中加入Kan(200mg/L)进行筛选，数日后挑选生长良好的幼苗移栽至蛭石中，2~5天后用Kan(200mg/L)喷洒移栽出的幼苗，非转基因幼苗变黄逐渐变白，无法继续生长。转基因幼苗在继续喷洒Kan(200mg/L)时无明显变化，仍可继续正常生长（如图8A ）。开花成熟后采收种子（如图8B ）。转化后烟草叶片所生长的丛生芽在含Kan(50mg/L)生根培养基中生根培养，由于根部对抗
生素较敏感，非转基因丛生芽在筛选培养基中较难生
根，而转基因丛生芽在12天左右就可生根（如图
9A ）。炼苗后移栽到培养盘中可以正常生长（如图
9B ）。
3讨论
ACCase 作为脂肪酸生物合成限速酶，在利用基因
工程提高棉花等油料作物油脂含量研究中具有重要地
位[9-12]。但迄今为止，这方面的研究进展并不很大，主
要原因是异质型ACCase 由4个亚基组成，这些亚基分
别由3个核基因和1个叶绿体基因编码，采用基因工程
使这些基因在目标生物中同时表达、定位于质体并组
装成一种有活性的结构有很大的难度。而Yuka
Madoka 等[13]提出的质体中accD 的表达可能制约质体ACCase 总体水平，为脂肪酸代谢调控中ACCase 的研究提供新方法。通过转运肽，利用细胞核转化方法将accD 基因定位于叶绿体，以实现其成功表达，为转基因棉花等油料作物脂肪酸代谢研究奠定了基础。构建植物表达载体时，将目的基因（陆地棉accD 基因）和定位于叶绿体的转运肽编码序列（CAC3转运肽序列）相连，用细胞核转化技术把外源基因导入植物
图8
转基因拟南芥A B 图9转基因烟草
A B
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中国农学通报https://www.sodocs.net/doc/734796859.html, 细胞。这样目的基因编码的蛋白质就有可在转运肽的引导下输送到叶绿体颗粒中去，从而克服叶绿体DNA 多拷贝的问题，并且在很大程度上还可缓解转化体的分离[14]。采用转运肽介导目的基因的叶绿体间接转化方法虽然没有整合到叶绿体基因组，但可以使目的基因的产物蛋白定位到叶绿体。由于细胞核转基因技术已经相当成熟[15-18]，因此，这种间接的采用转运肽介导叶绿体转化的方法也是一种较为便捷的途径。新疆是农业大省，棉花是新疆农业生产中最重要的经济作物，是重要纤维作物，也是主要的油料作物。棉花被栽培以来，其被研究和利用的产品主要是纤维，而具有极高经济价值的种子含油成分和含油量却一直未被重视。为此，为了提高棉农植棉副产品的收入，降低生产成本，提高棉花生产的效益，有必要对棉花种子含油成分及含油量开展目标育种。笔者采用转运肽介导的叶绿体间接转化法，利用拟南芥CAC3基因转运肽将棉花accD 基因输送到转化植物叶绿体颗粒中去，实现了脂肪酸生物合成限速酶ACCase β亚基编码基因accD 的表达，通过正向调控ACCase β亚基编码基因accD 的表达，进行脂肪酸合成调控，为棉花脂肪酸代谢研究奠定了基础。参考文献[1]王伏林.植物中的乙酰辅酶A 羧化酶[J].植物生理学通讯,2006,42(1):10-14.[2]赵虎基.植物乙酰辅酶A 羧化酶的分子生物学与基因工程[J].中国生物工程杂志,2003,23(2):12-16.[3]谢禄山,谭晓风.乙酰辅酶A 羧化酶基因研究综述[J].中南林学院学报,2005,25(4):89-95.[4]韩春春,王继文,魏守海.乙酰辅酶A 羧化酶(ACCase)的结构与功能[J].安徽农业科学,2006,34(3):413-414,416.[5]卢善发.植物脂肪酸的生物合成与基因工程[J].植物学通报,2000,17(6):481-491.[6]Roesler K,Shintani D,Savage L,et al.Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds.Plant Physiol,1997,113:75-81.[7]Davis MS,Solbiati J,Cronan JE Overproduction of acetyl-CoA
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对转基因棉花的浅析
对转基因棉花的浅析 摘要：1990年，美国利用生物技术，合成B.t杀虫基因，导入棉花获得抗虫转基因棉花，成为世界上第一个拥有转基因抗虫棉的国家。我国“抗虫棉研究”在“七五”期间开始进行。“八五”期间，在“863”计划资助下，也人工合成了CryIA(b)和CryIA(c)杀虫基因导入我国棉花主栽品种获得成功，成为继美国之后，第二个拥有自主研制抗虫棉的国家。 关键词：转基因；棉花；抗虫；种植 正文： 转基因棉花是指把其他物种中的有用基因导入棉花的基因组后，获得了该基因功能的棉花。1990年，美国利用生物技术，合成B.t杀虫基因，导入棉花获得抗虫转基因棉花，成为世界上第一个拥有转基因抗虫棉的国家。我国“抗虫棉研究”在“七五”期间开始进行。“八五”期间，在“863”计划资助下，也人工合成了CryIA(b)和CryIA(c)杀虫基因导入我国棉花主栽品种获得成功，成为继美国之后，第二个拥有自主研制抗虫棉的国家。“九五”开始，“抗虫棉”的研究又被国家“863”计划立为重大项目，进一步开展单价基因、双价基因及多价基因抗虫棉的研究，分离新的抗虫基因及抗刺吸式口器害虫（蚜虫）新基因的分离，改造及合成融合蛋白基因，对获得的新基因进行重组，构建高效植物表达载体。同时“九五”期间，“863”计划还将根据目前单价抗虫棉可能存在的棉铃虫产生抗性的问题，在生产中使用的持久性问题，环境释放安全性问题，遗传分离及稳定性问题，以及田间加代选择农艺性状以及蚜虫危害等问题作深入的研究。（中国转基因棉花产业化背景） 1、转基因棉花的现状 1.1我国的转基因棉花情况 来自中国农业科学院棉花研究所的最新统计显示，今年全国转基因抗虫棉种植面积达4000多万亩，占棉花总面积一半以上。今年全国转基因抗虫棉种植面积达4656万亩，而国产转基因抗虫棉种植面积达到70％左右。目前全国种植转基因抗虫棉的省份有11个。其中河北、山东、河南、安徽4省实现了100％的种植,据中国农业科学院棉花研究所有关负责人介绍，我国目前已经建成高效、工厂化的棉花转基因技术体系，培育成功的转基因棉花新品种已达8个，年产转
转基因棉花的应用研究
转基因棉花的应用研究 1.引言 自1990年美国合成苏云金芽胞杆菌基因（BT基因）并导入棉花获得世界上第一株抗虫转基因棉花以来，世界各国纷纷展开对转基因农作物的研究，发达国家把发展转基因技术作为抢占未来科技制高点和增强农业国际竞争力的战略重点，发展中国家也积极跟进。研究的主要方向分别是抗虫、耐除草剂、抗病、纤维改良、抗旱和耐盐碱[1]。 上个世纪90年代，在中国大部分种植棉花的地区持续性发生棉铃虫害，给棉花生产带来了巨大的威胁，大大增加了棉花种植成本，给种植棉花的农户造成了一定的经济损失。“八五”期间，中国人工合成的Cry1Ab和Cry1Ac杀虫基因导入棉花中获得成功，成为了世界上继美国之后第二个拥有自主研制抗虫棉的国家[2]。培育更加具备优良性状的转基因棉花品种，应用于棉花生产，解决棉花 病虫害给棉花生产带来的巨大损失，减少化学农药的使用量，保护环境和生态平衡，成为了当代转基因技术研究工作者的目标。 2.转基因棉花的技术来源与应用实践 2.1 转基因技术介绍 随着生物基因技术的出现，在技术工具理性的驱动下，人类获得了打破物种间固有边界并根据人类自身的意愿重新改造生物的能力。转基因技术的原理是将人工分离或修饰过的优质基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。其理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学[3]。基因片段的来源可以是 提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA 片段。 转基因技术的应用可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。转基因作物的大规模商业化种植始于1996年，主要的转基因作物有棉花、大豆、玉米和油菜[4]。转基因技术的遗传转化方法按是否需要通过组织培养分成两大类，一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，比较成熟的主要有花粉管通道法[5]。 2.2转基因棉花介绍 棉花，属于锦葵科棉属，是世界上最主要的经济作物之一。全世界植棉国家和地区有96个，其中产量较高的国家有中国、美国、印度等[6]。中国是世界产棉大国，年植棉面积470万公顷，棉花产量占世界总产量的1/4[7]。病虫害对棉花的种植有很大的影响，制约了棉花的发展。与此同时，化学农药的大量使用导致了一些棉花害虫抗药性的产生，严重威胁了棉花的生产，并且使环境污染日益恶化。 随着转基因技术的发展，利用植物基因工程和遗传育种技术手段培育的转基因抗虫、耐除草剂棉花，为棉花害虫和草害的控制提供了新的手段。转基因棉花受到了棉农的喜爱，得到了进一步的推广。转基因棉花，就是将人们预想的可以得到表达的基因（比如抗病虫害的苏云金芽胞杆菌基因）通过遗传转化方法进行
棉花转基因技术研究
收稿日期:2008201215 基金项目:国家“863”计划现代农业技术领域重大项目资助(编号2006AA10A211)。 作者简介:魏艳丽,(1978-)女,助理研究员,从事农业微生物研究。 3为通讯作者,E 2mail :yanght @https://www.sodocs.net/doc/734796859.html, 文章编号:100224026(2008)0320038204棉花转基因技术研究 魏艳丽1,黄玉杰1,李红梅1,孙红星1,2,杨合同1,23 (1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心,山东省应用微生物重点实验室,山东济南250014; 2.山东理工大学,山东淄博255049) 摘要:棉花是一种重要的经济作物,在我国广泛种植。 培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最 根本和最有效的方式。本文介绍了转基因棉花主要的研究方法,包括转化方法以及转入的基因等,并对转基 因棉花的发展趋势作了相关探索。 关键词:转基因;棉花;遗传转化;Bt 中图分类号:S562.032 文献标识码:A A Survey of Cotton Transgene Technology WEI Y an 2li 1,H UANG Y u 2jie 1,LI H ong 2mei 1,S UN H ong 2xing 1,2,Y ANG He 2tong 1,23 (1.Biotechnology Research Center ,Shandong Academy o f Sciences ;K ey Laboratory o f Applied Microbiology o f Shandong Province ,Jinan 250014,China ; 2.School o f Life Sciences ,Shandong Univer sity o f Technology ,Zibo 255049,China ) Abstract :C otton is one of im portant industrial crops ,and is widely planted in China.The cultivation of transgenic cotton is considered the m ost efficient way of increasing yield and res olving environmental problems.We introduced three dominant approaches in the development of genetic cotton and s ome useful target genes ,and forecast its probable future w ork. K ey w ords :transgene ;cotton ;genetic trans formation ;Bt 1 引言 棉花是一种以利用纤维为主的农作物。据估计,棉花每年创造的产值有1800～2000亿美元,全世界有18亿人口以种植棉花为生[1]。棉花同时又是一种非常容易感染病虫害的农作物,我国棉花每年因虫害造成 的产量损失约为10%～15%,而每年用于棉花防治的杀虫剂的剂量约占杀虫剂使用总量的2Π3[2]。随着生物 技术特别是基因工程技术的成熟,人们认识到利用转基因技术改造棉花,是提高棉花产量以及解决环境问题的根本途径。 1979年Price 和Smith 报道通过克劳茨基棉细胞悬浮培养得到胚状体[3],1986年,美国Agracetus 公司的第21卷 第3期 2008年6月 山东科学SH ANDONG SCIE NCE V ol.21 N o.3Jun.2008
转基因棉花种子生产经营许可规定
根据《中华人民共和国种子法》《农业转基因生物安全管理条例》和《农作物种子生产经营许可管理办法》规定，我部修订了《转基因棉花种子生产经营许可规定》，现予公布，自2016年10月18日起施行。农业部2011年9月6日发布的《转基因棉花种子生产经营许可规定》（农业部第1643号公告）同时废止。 特此公告。 农业部 2016年9月18日 转基因棉花种子生产经营许可规定 第一条为加强转基因棉花种子生产经营许可管理，根据《中华人民共和国种子法》《农业转基因生物安全管理条例》《农作物种子生产经营许可管理办法》，制定本规定。 第二条转基因棉花种子生产经营许可证，由企业所在地省级农业主管部门审核，农业部核发。 第三条申请领取转基因棉花种子生产经营许可证的企业，应当具备以下条件： （一）具有办公场所200平方米以上，检验室150平方米以上，加工厂房500平方米以上，仓库500平方米以上； （二）具有转基因棉花自育品种或作为第一选育人的品种1个以上，或者合作选育的品种2个以上，或者受让品种权的品种3个以上；生产经营的品种应当通过审定并取得农业转基因生物安全证书。生产经营授权品种种子的，应当征得品种权人的书面
同意； （三）具有净度分析台、电子秤、样品粉碎机、烘箱、生物显微镜、电子天平、扦样器、分样器、发芽箱、PCR扩增仪及产物检测配套设备、酸度计、高压灭菌锅、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、成套移液器等仪器设备，能够开展种子水分、净度、纯度、发芽率四项指标检测及品种分子鉴定； （四）具有种子加工成套设备，成套设备总加工能力1吨/小时以上，配备棉籽化学脱绒设备； （五）具有种子生产、加工贮藏和检验专业技术人员各3名以上，农业转基因生物安全管理人员2名以上； （六）种子生产地点、经营区域在农业转基因生物安全证书批准的区域内； （七）符合棉花种子生产规程以及转基因棉花种子安全生产要求的隔离和生产条件，生产地点无检疫性有害生物； （八）有相应的农业转基因生物安全管理、防范措施； （九）农业部规定的其他条件。 第四条申请转基因棉花种子生产经营许可证的企业，应当向审核机关提交以下材料： （一）转基因棉花种子生产经营许可证申请表（式样见附件1）； （二）单位性质、股权结构等基本情况，公司章程、营业执照复印件，设立分支机构、委托生产种子、委托代销种子以及以
农杆菌介导棉花转基因的方法
目录 摘要 (4) 1 前言 (4) 1.1植物转基因的意义 (4) 1.2棉花转基因常用的方法 ............................. 错误！未定义书签。 1.2.1基因枪法 (5) 1.2.2 PEG法 (5) 1.2.3显微注射法、电击法及激光法 (5) 1.2.4花粉管通道法 (6) 1.2.5农杆菌介导法 (6) 1.3植物耐盐相关的SOS2 基因 (9) 1.3.1SOS2 基因的定位克隆 (9) 1.3.2SOS2 编码一个假定的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶错误！未 定义书签。 1.4农杆菌介导棉花的作用 (10) 2 供试材料 ............................................................. 错误！未定义书签。 2.1棉花的胚性愈伤 ......................................... 错误！未定义书签。 2.2介导菌种 ..................................................... 错误！未定义书签。 3 方法与结果 ......................................................... 错误！未定义书签。 3.1实验方法 ..................................................... 错误！未定义书签。 3.1.1平板划线 ............................................ 错误！未定义书签。
棉花转基因技术研究进展
农业生物技术课程论文 题目：棉花转基因技术研究进展 院（系）：农学院 专业：农学 班级：农学081 姓名：秦绍龙 学号：01108012 成绩： 完成日期：2011年5月25日
棉花转基因技术研究进展 摘要：近些年来，转基因技术被广泛应用于遗传育种中，尤其是在棉花遗传育种和基因改良方面取得了重大的突破，本文主要通过查阅参考文献，综合阐述了三大转基因技术手段及其在棉花抗虫、抗病、抗除草剂以及品质改良等方面的应用与最新进展，并对棉花转基因研究进展中存在的主要问题进行分析。 关键词：棉花；转基因；育种；外源基因；进展 转基因技术又称外源基因导入技术, 它是通过采用农杆菌介导技术、花粉管通道技术与基因枪导入技术, 将外源基因导入受体作物的细胞，并得到整合与表达的一种现代高新育种技术。在国家“863”项目的支持下，我国自20世纪80年代末开始棉花转基因育种技术研究与开发应用,该项技术在我国发展很快，也取得了一些重大的成就与技术突破。在转基因技术的正确指引下，目前棉花转基因育种中已获得了大量转基因抗病、抗虫、抗除草剂等方面的优良抗性株系,并选育出了多个转基因抗病虫品种,这些品种在增强抗病虫性的同时，基本上延续了受体亲本原有的高产、优质的良好性状，但所选育的转基因棉花品种仍不同程度地存在种子活力低、前期生长发育偏慢、中期易发生茎枯病、后期易脱肥早衰、抗性范围窄且随生育进程强度下降等缺陷。 一、转基因棉花研究的概况 自从1983年，人类首次获得转基因烟草、马铃薯以来，植物转基因技术在基础研究和应用开发中获得了显著进展，成功培育一批具有抗虫、抗病、耐除草剂和高产优质等外源优异性状的农作物新品种，对农业的生产方式和经济效益产生了深刻影响。棉花是利用转基因技术进行遗传改良最为成功的作物之一，仅我国自主研制的CryA+CpTI双价抗虫等基因就已被转育到41个棉花品种中。棉花作为主要的经济作物之一，对一个国家国民经济发展起到了举足轻重的作用，也曾一度被列入我国战略储备物资行列。近年来，随着基因工程技术的不断发展，利用生物技术来创新棉花种质资源和培育新品种是一条非常有效的途径，极大地推动了棉花遗传育种的发展随着国际转基因技术的不断发展和转基因生物安全性方面的相关法律法规的不断完善，转基因作物的大面积推广和种植势不可挡。美国转基因抗虫棉大田种植已超过其棉田总面积的70%，澳大利亚和中国超过30%，全球转基因棉花种植面积达到680万公顷，占世界棉花种植面积的20%。 棉花为我国主要农作物之一，其基因工程方面的研究进展迅速，在抗虫、抗病、抗除草剂、棉纤维品质改良和生态效应方面均取得了一系列重要研究成果。1992 年中国农科院
棉花转基因
基金项目：863子项目“特殊生境植物资源的开发利用技术”（No ：2007AA021401）转基因专项“转新型基因的棉花种质资源材料创造”（No ：2008ZX08005-004）。 第一作者简介：张煜星，男，1967年出生，副教授，博士生，从事植物基因工程研究。通信地址：571101海口市城西学院路，中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室周鹏转张煜星，Tel ：015109875070，E-mail ：zyx2027193@https://www.sodocs.net/doc/734796859.html, 。 通讯作者：男，1963年出生，研究员，博士生导师，从事植物基因工程研究。E-mail ：Zhp6301@https://www.sodocs.net/doc/734796859.html, 。 收稿日期：2009-04-16，修回日期：2009-05-07。 棉花accD 基因植物表达载体的 构建与遗传转化的研究 张煜星1,2,3，崔燕3，祝建波3，周鹏2 （1海南大学农学院，海南儋州571737； 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室，海口571101； 3石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆石河子832003） 摘要：乙酰辅酶A 羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。采用PCR 方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase 羧基转移酶β-CT 亚基编码基因accD ，ACCase 羧基转移酶α-CT 亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD 基因进行体外重组，构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD 。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥，收种子，在含卡那霉素的MS 培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草，经不定芽诱导、生根培养，获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR 、RT-PCR 检测后，初步表明目的基因已在植株中转化成功，并可以正常转录。 关键词：陆地棉；拟南芥；accD 基因 中图分类号：S336文献标识码：A 论文编号：2009-0791 Construction of Plant Expression Vector on accD Gene fom Gossypuum hirsutum and Its Genetic Transformation Zhang Yuxing 1,2,3,Cui Yan 3,Zhu Jianbo 3,Zhou Peng 2(1College of Agronomy,Hainan University ,Danzhou Hainan 571737; 2National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops, Institute of Bioscience and Biotechnology,CATAS,Haikou,571101; 3Laboratory of Agricultural Biotechnology ,College of Life Science,Shihezi Universit ,Shihezi Xinjiang 832003) Abstract:The acetyl-CoA carboxylase (ACCase)is the rate-limiting enzyme of fatty acids synthesis.The accD Gene and transit peptide of CAC3Gene was amplified from Gossypuum hirsutum Genome and Arabidopsis thaliana Geneome.Plant Expression Vector of Fusion Transit Peptide of CAC3Gene and accD Gene was constructed.The Vector of pBI-CAC3tp -accD were transferred into Agrobacterium tumefaciens https://www.sodocs.net/doc/734796859.html,ing infiltration and leaf discs method,the gene were transferred into Arabidopsis thaliana and tobacco cell.The seeds of Arabidopsis thaliana were selected on solid medium containing Kanamycin.Transferred leafs of tobacco were selected on solid medium containing Kanamycin.Transgenic Arabidopsis thaliana (T1)and tobacco plants were found containing purpose gene by PCR.After RT-PCR,it shows that the CAC3tp -accD gene could transcript normally.Key words:Gossypuum hirsutum,rabidopsis thaliana,accD Gene 中国农学通报2009,25(18):36-40 Chinese Agricultural Science Bulletin
转基因棉花在生产应用上的风险与安全控制
转基因棉花在生产应用上的风险与安全控制 植物转基因技术的诞生，对生物工程技术和世界农业都产生了巨大影响。棉花是纤维植物，由于遗传转化的限制，棉花的转基因研究起步较晚，但近几年进展迅速。一方面，随着转基因技术的发展，抗虫、抗病、抗除草剂基因等先后成功导入棉花载体中并应用于大田生产，使得转基因抗虫棉成为我国唯一大面积种植并实现产业化的转基因农作物。对缓解棉铃虫给棉花生产造成的为害、减少化学农药的使用量和保护生态环境起到了重要的作用；另一方面，随着转基因棉花的大面积应用，其安全性问题逐渐引起了人们的重视，转基因棉花的田间种植是否会引起外源基因向其他物种渗透，是否会对生态环境造成危害，这都是转基因植物进入商业化生产前都必须明确的问题¨1。但目前人们还很难准确预测外源基因导入一个新的遗传背景会产生什么样的后果心1。因此，必须采取措施预防转基因棉花在生产应用中可能存在的安全风险，作者以目前应用面积最大的转Bt基因抗虫棉为基础，进行转外源基因棉花在生产上应用对生态环境安全的影响分析，并提出转Bt基因抗虫棉在生产应用上的风险预防和安全控制措施。 1 转基因棉花在生产应用上的风险
1.1抗除草剂棉花有成为杂草的可能 杂草生长迅速并且具有强大生存竞争力，能够广泛传播，阻碍农作物的生长。所以，杂草常常给农业生产造成巨大损失。虽然转基因棉花在抗病虫性、抗逆性和生活力等方面比非转基因棉花强，但由于棉花不具有杂草特性，不会入侵其他植物栖息地，破坏自然种群平衡，一般情况下，转基因棉花不会出现杂草化问题。但近年来棉田除草普遍使用除草剂对棉花造成伤害，为了减少除草剂对棉花的伤害而开展的抗除草剂棉花选育。有使其成为杂草的可能，如果抗除草基因从棉花漂移到杂草上，也就有可能出现抗（耐）除草剂的“超级杂草”。1.2基因漂移威胁棉花近缘物种基因漂移是指基因通过花粉授精杂交等途径在种群之间扩散的过程。棉花是常异花授粉作物，转基因棉花的外源基因花粉可以通过风力、昆虫等向近缘非转基因植物转移，不仅影响近缘物种的遗传纯度，使近缘物种有获得选择优势的潜在可能性，如果近缘物种获得抗病、抗虫或抗除草剂基因。也可能使其成为另一种“超级杂草”。这样会促使大量化学农药的应用，造成严重的环境危害。另外，随着转基因棉花的大面积推广应用，还可能向其他物种渗透，若大量外源基因漂移进入野生植物基因库并扩散开来，可能会影响基因库的遗传结 构，给生物多样性造成危害心1。
转基因技术及其在棉花育种中的应用
转基因技术在棉花育种中的应用 杨金惠 812031001 作物领域 2012级 摘要：棉花是一种重要的经济作物，在我国广泛种植。培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。本文介绍了转基因棉花主要的研究方法，包括转化方法以及转入的基因等，并对转基因棉花的发展趋势作了相关探索。此外，本文总结了转基因技术在棉花遗传改良中的应用，包括棉花抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆以及品质改良等方面的最新进展，并对棉花转基因研究中存在的主要问题和今后的研究与应用前景进行分析和展望。 关键词：转基因；棉花；育种 1973 年美国科学家科恩等人第一次将两种不同的DNA 分子进行体外重组, 并且在大肠杆菌中表达以来, 基因工程技术发展飞速, 该技术正在极大地改变着地球生物固有的进化进程。据不完全统计, 目前全球已有60 多种转基因园艺植物和大田作物相继问世, 其中转基因工程技术在棉花品种改良中的应用, 成效卓著。 自从1983年人类首次获得转基因烟草、马铃薯以来，植物重组DNA技术在基础研究和应用开发中获得了显著进展，培育成功一批具有抗虫、抗病、耐除草剂和高产优质等外源优异性状的农作物新品种，对农业的生产方式和经济效益产生了深刻影响。棉花是利用转基因技术进行遗传改良最为成功的作物之一，仅我国自主研制的,CryA+CPTI双价抗虫等基因就已被转育到41个棉花品种中。美国转基因抗虫棉大田种植已超过其棉田总面积的70%，澳大利亚和中国超过30%，全球转基因棉花种植面积达到680万公顷，占世界棉花种植面积的20%。 1.转基因技术 棉花转基因技术是指将外源DNA通过物理、化学或生物学方法导入棉花细胞并得到整合和表达的过程。在棉花遗传转化体系中，主要有农杆菌介导、花粉管通道和基因枪3种转化方法。本研究拟对. 种方法的主要技术特点及研究和应用动态进行综述，旨为棉花分子育种提供参考。 1.1．农杆菌介导法 1.1.1农杆菌转化技术的理论基础 与棉花遗传转化有关的根癌农杆菌是一种土壤习居菌，在自然状态下能感染棉花等大多数双子叶植物营养器官的伤口，导致冠瘿瘤的发生。根癌农杆菌含有一种Ti质粒，侵染时通过棉花器官的伤口进入寄主组织，但其本身不进入寄主植物细胞，只把Ti质粒的T-DNA片断导入棉花的基因组中并得以表达，且外源DNA 表达通常表现出典型的孟德尔遗传规律。由于Ti质粒本身能插入大到50kb的外源DNA，因此利用此转化载体，将Ti质粒上致瘤基因切除，代之以有益的外源DNA 序列，并插入由真核型启动子和细菌抗生素抗性选择标记基因或报告基因组成的嵌合基因，将改造后的农杆菌侵染棉花器官或细胞，在加有相应选择因子的培养基上选择转化再生植株，进而可得到转基因植株。 1.2.花粉管通道法 1.2.1花粉管通道转化技术的理论基础 从整体上说，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的。但从进化的角度来看，任何生物DNA均由4种核苷酸组成，这样就可能在顺序上出现不同程度的相同排
转基因棉花
转基因抗虫棉的发展以及存在的问题 张文亮26 摘要：棉花是重要的农作物以及经济产物，自上个世纪90年代以来， 由于棉铃虫在我国大部分棉区持续性大发生或爆发，给棉花生产带来 了巨大的威胁，因此开始进行抗虫棉的研究。本文叙述了抗虫棉的发 展过程以及抗虫棉的特点，从而对转基因抗虫棉有了更深刻的了解， 不仅仅停留在其优点，也发现了它的潜在危害，毕竟所有事物都是有 两面性的。 关键词：转基因棉花、抗虫棉、抗虫性、Bt蛋白、 Abstract：Cotton is one of the important crops and economic product, since the 90s of last century, because of the cotton bollworm in major cotton growing areas of China continuing occurrence or outbreak, cotton production has brought great threat, so start study on insect resistant cotton. This paper describes the Bt cotton in the development process and characteristics of the insect resistant cotton, thus of insect resistant transgenic cotton have more profound understanding, not only stay in the utility model has the advantages of, also found the potential harm, after all, all things are two sides.
转基因棉花环境安全性研究进展
转基因棉花环境安全性研究进展 随着转基因技术的大力推广与发展．转基因产品在给人类带来巨大经济利益的同时．食品与环境安全的问题备受社会关注。其中转基因棉花大面积种植尤为重要．利益与安全应该同步发展与推广才能得到人们认可。2008年，全球共有10个国家（前5位包括：美国、阿根廷、巴西、印度、加拿大）增加种植了混合型转基因棉花，其中美国种植转基因棉花达78%：印度多数种植转Bt基因棉花，种植面积占印度种植棉花总面积的82%m。种植的转基因棉花既是主要的纤维经济作物．同时也是仅次于大豆的重要油料和蛋白质作物．全球种植转基因棉花的面积为2100万hm2．位居种植转基因农作物物种的第3位，而国内种植转基因棉花的面积达到530万hm2。北美地区和澳大利亚是种植转基因抗除草剂棉花面积最大的地区与国家，在2007年孟山都第二代抗草甘膦棉花在美国与澳大利亚种植面积达80×104 hm2。抗除草剂有效解决棉花杂草的危害，并扩大除草剂施用范围，降低了除草费用．达到低投入和高产出的目的。因此，在广泛种植转基因棉花过程及生产应用中存在风险随之产生，主要包括：抗除草剂棉花有成为杂草的可能：基因漂移威胁棉花近缘物种：转基因棉花的应用会加速害虫抗性进化：转基因棉花对
非靶标有益生物的影响：转基因棉花对土壤生态环境的影响。笔者旨在对转基因棉花的研究情况进行综述、讨论及展望。 1 种植转基因棉花的优势 1.1 种植转Bt基因棉花对环境的影响 首先．经过长时间种植转Bt基因棉花对环境影响较明显：棉田中的益虫增多，周围其他农田受益，整个农田生态系统呈良性发展态势。Bt基因具有天然杀虫特性，能够杀死害虫中的蛋白质。在国内主要防治棉铃虫．对其他害虫也有间接防治效果，在转基因棉花田中瓢虫、蜘蛛和草蛉等益虫的数量都出现上升．它们会捕食蚜虫等害虫，从而间接起到防治虫害的效果。同时不仅是转基因棉花田受益，这些益虫还会进入邻近的大豆、花生、玉米等非转基因作物田．使整个地域的农田生态系统向有益方向发展。转Bt基因抗虫棉对鳞翅目靶标害虫具有良好的控制作用，减少了化学杀虫剂的使用，降低了对环境的污染，保证了人畜的安全，提高了农民的收益。Mat in等研究发现，印度转基因棉花单产相对增加34.3%．而中国只增加6.11%．美国更少．仅为2.36%。朱行等通过对印度种植转基因棉花研究发现，种植转基因棉花单产增加31%．杀虫剂使用量减少39%．利润增长88%，同时还保护环境，增进健康。Huang对农户种植Bt抗虫棉与非转基因棉的成本收益进行比较指出．农药施用量大幅度减