β-葡聚糖酶

植物β－1，3－葡聚糖酶的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶参与了植物的多种生长发育过程，包括细胞分裂、小孢子发生、花粉萌发、育性、韧皮部胼胝质去除、受精、种子萌芽及植物生长调控等过程。20世纪70年代以前，对β-1,3-葡聚糖酶的研究主要集中于它对植物本身不同发育阶段的作用，随着分子生物学技术在植物抗病基因工程中的逐步应用，β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病研究取得了快速发展。目前，β-1,3-葡聚糖酶基因在植物抗病基因工程研究中已被认为是最具吸引力的基因之一。

1 β-1,3-葡聚糖酶基本生物学特性和分类

已知的β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族，其成员具有共同的氨基酸序列结构：(LIVM)一x一(LIVM-FVW)3一(STAG)-E-(ST)-G- W-P-(Srr)-X-G．(Lan等，1998)，β-1,3-葡聚糖酶分为外切酶和内切酶，目前主要研究的是内切酶。它的分子量为32-37kD，等电点从酸性到碱性。它的作用底物为以β-1,3-苷键连接起来的多聚糖，以随机作用方式将多聚糖分解成为糊精或寡聚糖。各种类型的β

-1,3-葡聚糖酶已从多种植物中分离出来。根据其等电点、定位、mRNA表达模式及序列的同源性等特点可将其分为四种不同类型。I类葡聚糖酶为碱性，主要存在于液泡中，体外具较强抑菌活性。碱性β-1,3-葡聚糖酶通常具有1个液泡定位的羧基末端多肽(carboxyl terminal polypetide，CTPP)结构，CTPP中往往含有糖基化位点即CTPP切除信号氨基酸结构， CTPP的缺乏使得β-l,3-葡聚糖酶分泌到胞外，因此，CTPP存在与否成为β-1,3-葡聚糖酶分类的重要依据。现已分离出三种编码I类葡聚糖酶的cDNA，它的前体蛋白含有N一端信号肽及C一端液泡导向肽序列。在根及老叶中组成型表达．占可溶性蛋白的5％-10％，且主要分布在叶的表皮细胞层中。受病源菌、乙烯、水杨酸、伤口、UV等因素诱导，但被auxin ／cytokine所抑制，并受发育的调节。Ⅱ类葡聚糖酶具有较低等电点，被称为酸性葡聚糖酶。主要分布在细胞间隙，在体外无抑菌活性，它的氨基酸序列中不具有C一端延伸序列。与I类酶有55％同源性，但Ⅱ类酶与I类酶在血清学上具有相似性。它主要包括PR2(又称PR-36)。PR-N，PR-O(又称PR-37)，能被病原菌诱导，I类葡聚糖酶与Ⅱ类葡聚糖酶相比．只有54％~59％的同源性。Ⅲ类酶属于分布在胞外的诱导物释放型β-1,3-葡聚糖酶(PR-Q’)，分子量为35KD(又称PR-35)。PR-Q’由烟草花叶病毒(TMV)诱导表达，其诱导速度慢于或相同于Ⅱ类葡聚糖酶，持续时间也较短嘲。Ⅳ类葡聚糖酶为酸性胞外非诱导型β-1,3-葡聚糖酶(PR-O’)，分子量为25KD,是一种二聚体，不能被病原物诱导㈣。与Ⅱ类、Ⅲ类酶相似性较小，且与前三种酶均不能发生抗血清交叉反应。

2 β-1,3-葡聚糖酶抗病机制研究

植物受病原物侵染时常产生一些PR蛋白进行抵御，β-1,3-葡聚糖酶即是其中之一。PR类蛋白是由植物寄主基因编码的、在病理或相关条件下诱导产生的蛋白质,PR类蛋白与植物系统获得性抗性fSystemic acquired resistence,SARl和系统诱导性抗性fInduced Systemic Resistance ISRl的建立密切相关。根据蛋白质之间氨基酸序列的相似程度，目前已经发现的PR蛋白可分为十一类，β-1,3-葡聚糖酶属于PR2类，在植物的抗病过程中扮演着重要角色。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的重要结构成分。许多真菌的菌丝尖端β-1,3-葡聚糖暴露在表面，能够直接受到β-1,3-葡聚糖酶的攻击。体外抑菌实验表明，β-1,3-葡聚糖酶对菌丝生长具有抑制作用。不过，只有液泡定位的碱性葡聚糖酶能够降解菌丝壁，从而抑制生长，而胞间定位的类型则没有抑菌活性。当然，真菌也合成一些葡聚糖酶抑制蛋白fGlucanase Inhibitor Protein RIPl，RIP特异性地抑制寄主内源葡聚糖酶的活性旧，这反映了植物与微生物共进

化的一种关系。更为重要的是，在水解过程中由真菌细胞壁释放出来的寡糖能够作为植物多种抗病反应的激发因子。激发子作为病原菌——植物相互识别的重要信号分子，是指能诱导植物产生任何防卫反应的因子fHahn 1996)。杜良成和王钧(1992)的研究已证实病菌来源的激发子可诱导植物B-1,3-葡聚糖酶不同程度的表达。SA作为一种非生物激发子，可诱导植物PR基因表达。被用于PR基因启动子的调控机制研究ffShah和 Klessig，1996)。激发子和SA诱导植物的全面抗病反应，可作为诱导物诱导与抗病反应有关的酶类如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4一香豆酸-CoA联结酶)等的积累，由此对植保素、木质素等抗病物质的合成与积累，增强植物的抗病性起促进作用。这方面的报道集中在大豆与大豆疫病菌的互作研究中。在大豆中，已经发现葡聚糖激发子结合蛋白GEBP fGlucan Elicitor Binding Protein GEBP)，定位于大豆根部细胞的质膜上，能够特异性地结合β-1,3-葡聚糖酶降解过程中释放出来的寡糖激发子，诱导植物的防卫反应。

3 β－l,3-葡聚糖酶在植物中的发育调节及其可诱导性

β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶，它们不仅在植物抗病中起作用，还在植物发育中起作用，包括谷类发芽、胚轴和胚芽鞘发育、韧皮部运输和胼胝质的运动、微管组织运输调节和细胞壁生物合成、花的发育、小孢子形成、花粉管发育、果实成熟、植物衰老以及固定和愈创性葡聚糖的清除以及调控胚乳发育、育性调控及种子后成熟．也用于研究转化体基因沉默现象等方面。这些不同的发育过程均与β-1,3一葡聚糖酶有密切关系， Leubner Metzger等利用反义基因技术揭示了3-1,3-葡聚糖酶在打破烟草种子休眠中所起的重要作用。Stieglitz(1977)在研究Lilium的小孢子发育过程中发现，β-1,3-葡聚糖酶在小孢子从四分体状态释放出来之前有一个增长的峰值。随后小孢子的胼胝质壁被溶解，释放出成熟的花粉类。已证实此过程中内切葡聚糖酶起关键作用。但此酶在小孢子成熟之前如何被准确诱导的机理还不清楚。将修饰过的β-1,3-葡聚糖酶导人烟草中使其在绒毡层中提前表达，使转基因植株育性降低。而在牵牛及高粱体中一些雄性不育突变体中发现是因为葡聚糖酶在小孢子发育过程中提前释放．从而造成小孢子发育异常。Van de Rhee(1993)对碱性葡聚糖酶5’调控序列的研究表明：在1476b0的启动子序列中，1476至44bp之间的片段对发育调控的表达是必需的。

在正常植物体中葡聚糖酶在整株植物中的分布是不均衡的，根部和基部老叶中含有很高的酶活性，而顶部幼叶中几乎检测不到，究其原因，可能是由于发育调节或激素对它的控制作用。Felix(1985)研究认为，组织培养中，烟草中一种特异的内切β-1,3-葡聚糖酶受到生长素和分裂素的调节。当两种激素同时加人培养基时，90％的酶活性被抑制，而当从前者培养基移人加有一种激素或不加激素的培养基时，此酶的表达量到第七天时比前者增加了约10倍。Eichholz(1983)认为是激动素(kinetin)阻碍了B-1,3-葡聚糖酶的重新合成p回。 Felix(1986)则认为阻碍β-1,3-葡聚糖酶的合成并不是激动素独立作用的结果，而是由于分裂素和生长素两者生理浓度共同决定。

β-1,3-葡聚糖酶基因的表达不仅与病原菌侵染有关，还与其他生物或非生物诱导物有关。非生物诱导包括物理因素和化学因素。1987年Dean R．A．发现，机械或干冰损伤、电磁处理可不同程度地诱导烟草对霜霉病(Peronosporatabacina)的抗性；紫外线处理各种豆类的下胚轴可使植株叶片获得对炭疽病fColletotrichumlinderthianum)的抗性。后来陆续报道X一射线、局部热处理等也具有诱导抗病性的功能。已有100多种化学物质被用作诱导因子，较早使用的是乙酰水杨酸钠、多聚腺苷酸等，可以诱发烟草对TMV的抗性，由此形成了20世纪70-80年代对诱导抗性研究的第一个热潮。董汉松等在烟草抗赤星病的研究中建立了诱导因子谱，同时也发现有诱导感病性的化学物质，如马来酰肼等，表明感病性也和抗病性一样，可以由不同的物质诱导产生。生物诱导包括：(1)真菌。这类因子包括病原和非病原菌、致病力不同的菌株及其不同结构和分子组分，前人已有不少综述。在烟草抗赤星病诱导中，已从全国各烟区分离的209个赤星菌株中选出致病力弱的菌株用作诱导因子，并已成功地用于大田试验，取得良好效果。(2)细菌。可用作诱导因子的细菌包括死体和活体，病原细菌和非病原细菌及细菌的不同成分，如菌

体脂多糖(LPS)、胞外多糖(EPS)等。目前，已有不少报道证明，细菌的无毒基因favrl或过敏／致病基因(hrp)产物，起抗病防卫激发子的作用。(3)病毒。1929年首次报道病毒的交叉保护现象。今后，有两方面的工作值得注意，一是已证明病毒诱导的抗病性对不同作用、不同类型病原物都有效。例如，烟草普通花叶病毒仃MV)可诱导对TMV和霜霉病等12种病害的抗性：二是病毒辅助因子的作用，如含卫星RNA 的CMV诱导烟草对赤星病的抗性。董汉松研究表明，RNA的存在使效果明显增强，但田波实验室报道认为，抗病诱导作用主要。

4 β-1,3-葡聚糖酶基因信息研究

β-1,3-葡聚糖酶cDNA编码长度为359个氨基酸的多肽．前体酶在N端含有21个亲水碱基．是蛋白转移的信号肽序列，C端含有22个残基．推测其中含有N糖基化位点．这在成熟蛋白中是没有的，在最初的多肽合成后，前体酶进行加工，将前体酶中的信号肽序列和糖基化位点切除，随后才产生成熟的酶。

从20世纪60年代起，许多植物中的B—l'3一葡聚糖酶基因信息已被逐渐研究清楚，如大麦、水稻、玉米、高粱、小麦、拟南芥、鹰嘴豆、大豆、早熟禾、三叶胶树、西红柿、亚麻、香蕉、烟草、菜豆、豌豆、桃树、马铃薯、葡萄等。Mohnen和Shinshi(1985)最早获得碱性葡聚糖酶基因序列，它们利用激素诱导的烟草总RNA构建了eDNA文库。利用分离的mRNA体外翻译后杂交筛选的方法获得了含有约lkb 插入片段的β-l，3一葡聚糖酶基因片段的克隆，并由此获得了对应的mRNA和完整基因序列，其基因全长为1083bp，开放阅读框编码359个氨基酸组成的多肽，分子量为39KD。而成熟蛋白的分子量比前体蛋白小4KD。其中N端信号肽约为2KD．因此前体蛋白还经历了其他的加工过程，即C端多肽序列(2KD)在进入液泡时被切除，成为成熟的葡聚糖酶[31,32]。Linthorst(1991)对烟草编码B-1,3-葡聚糖酶的基因结构进行分析认为，在烟草基因组中，至少有7个基因编码酸性B-1,3-葡聚糖酶，而碱性酶也是拥有至少4个基因的家族编码。对其中较典型的一种酸性和碱性葡聚糖酶基因组克隆进行分析表明。酸性酶基因编码序列中包含1个341bp的内含子．位于推测的信号肽序列之后，碱性酶基因克隆与前者相仿．对两个克隆的核苷酸序列比较表明有57％的一致性，但其上游调控区、内含子序列和下游序列则无明显相似性。二者在氨基酸序列上有49％的同源性，酸性酶编码结束位置正好位于碱性酶C端多肽起始位置，成熟碱性酶分子量为37 KD，p14．89。

Chve(1995)对橡胶(Hevea brasiliensis)乳汁管中高效表达的B-1,3-葡聚糖酶基因进行了较为详尽的分析。利用烟草(N．plumbaginifoli)B-1,3-葡聚糖酶cDNA(gnl)做探针，从橡胶cDNA文库中分离到一个含有约1．2kb插入片段的编码B-1,3-葡聚糖酶的克隆。此cDNA由一个40b05’非翻译区，一个1125b0编码区及一个76bp的3’端非翻译区和多聚腺苷酸尾所组成。编码区为一个374个核苷酸的碱性蛋白，分子量为41kD,它的核苷酸序列与gnl相比有68％一致性，氨基酸序列有66％一致性。氨基酸序列分析表明，前体蛋白含有C端和N端延伸，N端富含丝氨酸并紧接着一个疏水区域，属于典型信号肽序列。C 端序列与gnl相比有一定的保守性，特别是靠近C端多肽末端的几个疏水氨基酸构成的疏水／酸性结构构成了一种定向信号。用叶柄切片进行的原位杂交表明，橡胶中β-1,3-葡聚糖酶,mRNA定位于乳汁管细胞中。基因组Southern分析则暗示，在H．brasiliensis中， B-1,3-葡聚糖酶由一个低拷贝基因家族编码。 Northern印迹分析表明，β-1,3一葡聚糖酶的 mRNA在乳汁道中的含量比叶中的高。到目前为止，已从烟草、菜豆、马铃薯等多种植物中分离到各种类型的β-1,3-葡聚糖酶基因，鉴于它在植物发育及防卫反应中的重要作用，对其分子生物学方面的深入研究将为进一步揭示其作用机制及今后的利用打下理论基础。

5存在问题及展望

B-1,3-葡聚糖酶的抑菌活性引起人们的重视，但是迄今为止在转入该酶基因的小麦、烟草、猕猴桃和玫瑰等植物获得的转基因植株中，其抗性表现不尽一致。这表明不同的植物在抑菌的细节上可能存在差别，还有待进一步探讨。由于一些实验表明，几丁质酶和B-1,3-葡聚糖酶在体外的协同抑菌效果，因

此．更多的转化研究则是将β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶共同导入受体植物基因组中。Jonggedik等将烟草的Class I型几丁质酶基因转化番茄时发现，二者有明显的协同效果，番茄发病率降低36％-58％．而单基因表达时抗病能力没有增强，但这也不能完全证明在所有植物中两者协同表达都可以提高植物的抗病性。如对于卵菌纲的真菌而言，由于其菌丝壁不含几丁质，转化几丁质酶基因可能就没有效果，而导入β-1，3一葡聚糖酶单一基因可能将更有意义。

PR类的β-1，3-葡聚糖酶或组成型、或诱导型表达．在不同组织中有不同的表达反应．而且酶也被运输到细胞的不同部位，对于抵御真菌病原的攻击具有积极意义。但到目前为止，还没有证据表明该酶在“病原一寄主”的相互作用中表现为“基因对基因”模式，因此，我们推测其参与的可能是一种对病原攻击广泛的、非特异性的反应。然而，Neuhaus等(1992)将烟草液泡定位的碱性β-1。3一葡聚糖酶Gla的反义基因导人烟草后．虽然 Gla的表达在RNA水平和蛋白质水平显著减少。但其感病性没有明显变化。所以作物可能存在多种补偿机制以适应β-1，3一葡聚糖酶表达水平的下降。恰恰相反的是，利用Gla的反义基因转化栽培烟草和野生烟草时。转基因植物表现出TMV抗性明显提高。由于β-l，3一葡聚糖酶表达量下降，可能导致TMV侵染部位葡聚糖酶降解要缓慢些，所以葡聚糖酶可能是病毒传播的一个物理障碍。

葡聚糖酶在植物中广泛分布，而且以多种类型存在。它除了具有防卫功能外，还与植物发育紧密相关。目前，I类葡聚糖酶与几丁质酶在抗真菌病基因工程中的应用已有较多的尝试，也取得了一些预期效果．而将其应用在雄性不育基因工程中则刚开始。多种因素参与了植物对于病原攻击的防御反应，这些因素的协同表达往往能增强寄主的抗病能力。因而多因素的改造将成为植物抗病育种的一个发展方向。当然它也面临着种种问题，如构建载体、转化植物的难度、外源基因的沉默以及数量性状基因的利用等。内蒙古农业科技2006(5)

何江峰1，韩冰2，赵宏鑫1(1．内蒙古农业大学生物工程学院，内蒙古呼和浩特010018；2．内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010021)

木聚糖酶研究进展

木聚糖酶研究进展 刘亮伟 河南农业大学生命科学学院 郑州 450002 文化路 95 号llw321@https://www.sodocs.net/doc/8e17535752.html, 科学技术的进步给21世纪的人类带来了便利,也给人类带来了前所未有的压力：人口膨胀、能源危机、环境污染、资源匮乏，所有这些问题的本源是能源危机。与能源匮乏相矛盾，自然界通过光合作用赋予人类大量可再生资源：如纤维素和半纤维素，作为继纤维素后第一大生物资源的半纤维素在农业和木材工业中是常见的废弃物，它作为可再生资源的一个有利条件是它比纤维素更易于提取和水解。秸秆中半纤维素含量占其总干重的25～50%，其化学结构较纤维素复杂得多，由D-木糖通过β-1,4-糖苷键相连成的主链和少量L-阿拉伯糖侧链所组成[1]，这种D-木糖单元在硬木和软木中平均聚合度分别是150－200和70－130，要得到能够利用的单糖必须通过以木聚糖酶为主的半纤维素酶系协同作用进行水解而完成[2]。 内切-1,4-β-木聚糖酶（E.C 3.2.1.8）是一种内切糖苷酶，能够水解木聚糖这类自然界中最丰富的半纤维素，同自然界中五碳糖的循环相联系，在能量循环中占有重要地位。在古代人们就已经在生产过程中间接地利用各种酶进行生产：如酿酒、制作奶酪、烘焙面包、修饰淀粉等。1986年，Viikarri发现了木聚糖酶在纸浆漂白和造纸工业中能够降低环境污染物品的用量[3]，伴随着人类对于可持续性发展和环境的重视，木聚糖酶在工业上的应用明显增加，在1997-2002年间的5年中，纸浆造纸业用酶由1.0亿美元增加到1.92亿元，增长率为16.2%，是所有酶制品行业中增长率最快的。 1木聚糖酶的应用 1.1在纸浆造纸工业中应用 木聚糖酶最重要的用途是在纸浆造纸工业中对于纸浆的漂白。因为环境污染最大的来源是纸浆造纸工业中的废水。根据资料显示仅仅美国每年用于纸浆漂白的氯化物或次生氯化物用量就有200多万吨[4]。因为纸浆漂白污水中含有有毒物质，并且这些物质能在生态系统的生物和非生物组成中积累，如氯苯、氯二苯和其它氯化木质素次生物[5; 6]。这些化学物质对环境危害很大，据有关研究显示既便是远离造纸厂10公里以外的鱼群都会受到纸浆漂白污水中有害物质的负面影响[7]，这种受到污染的鱼可以直接或间接地影响人类的身体健康。木聚糖酶的作用就是对木聚糖进行水解从而加快了纸浆中木质素的释放，色素物质所以能够比较容易地从纤维素中释放出来。经实验证实，木聚糖酶的漂白效果比木质素降解酶好得多，这是因为木质素大部分交联在半纤维素上，而半纤维素比木质素更容易解聚[8]。利用木聚糖酶相应地比其它酶进行多聚物降解时，碳水化合物水解速度要快2-3倍[9]。经木聚糖酶处理后的纸浆漂白可以降低20%-40%漂白剂用量 [10]。

酶活力测定方法

蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。 纤维素酶DNS酶活力测定方法 DNS, 活力, 纤维素酶, 测定 1 定义" |0 `. y6 t9 b" ^ 2 x 1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。 2 原理 纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。! Y" m& p' q; I& K B& e$ T( B4 } 3.试剂和溶液 3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定） 3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液 取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。4 C) c+ }( l2 R( M( p! L 3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）; h1 a. l3 Z3 k6 t2 | 4仪器和设备 4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃) 4.2分光光度计 含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。$ ]1 h& A) p) K 5测定步骤 5.1 标准曲线绘制. [* |! P6 u* G& u2 ^6 J4 Q 分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。1 H, `% F/ `7 X/ U. W 5.2待测酶液的制备（同β－葡聚糖酶酶活测定） 1 L- {5 h8 W; q+ V4 u2 Y 5.3 比色测定 精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40℃预热5min，加入经40℃预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40℃水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。 同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。 6.计算0 W+ i$ S: }( _1 o7 ], R5 m( N

魔芋葡甘聚糖膜的制备及改性

1 引言 1.1魔芋的基本性质 魔芋，多年生草本植物，我国有60多种，种植历史已达两千年之久，主要分布在在湖北、云南、四川、贵州等省，且多在山区，亩产可达数千斤。魔芋作为传统健康食品在我国和日本有悠久的历史。近年来关于KGM 在食品领域的应用研究日益引人注目。[1-2]其主要成分是魔芋葡甘聚糖（KGM），KGM 是由D-葡萄糖和D-甘露糖按1∶1.6 的比例以?-1，4 糖苷键连接的杂多糖，其分子量达106 D，在KGM 分子链上平均每17 个糖残基C-6 位上连有一个乙酰基[3-4]。是具有分支的大分子杂多糖。具有优良的亲水性、胶凝性、增稠性、黏滞性、可逆性、悬浮性、成膜性与赋味性等特性, 尤其优良的成膜性已引起国内外的重视[5].其水溶胶在适当条件下成膜, 可作为一种可食性和自然降解的膜材料。魔芋葡甘聚糖膜存在着成膜时间长、膜的强度低、抗菌能力差以及吸湿度大等问题。因此,已有应用各种方法对其进行改性以改善膜的性能.近年来魔芋葡甘聚糖改性产物在食品，医药，化工，纺织和环保等领域有很好的应用前景。因此，对魔芋葡甘聚糖膜进行改性对扩大其应用范围有重要意义。[6-7] 1.2.KGM的化学结构和性质 KGM的化学结构如图1： 图1. 魔芋葡甘聚糖的化学结构 KGM在酸性条件下分别经高峰淀粉酶，甘露糖酶和纤维素酶水解，其产物经薄层色谱和凝胶电泳分析表明，KGM是主链由D-甘露糖和D-葡萄糖以?-1，4吡喃苷键连接的杂多糖。根据来源不同，KGM分子中甘露糖和葡萄糖的摩尔比为1.6—4.2,在主链甘露糖的C 位上存在?-1，3键结合的支链结构，大约每32个糖残 3 基上有3个左右支链，支链仅含几个残基，并且在有些糖残基上有乙酰基团。约每19个糖残基上有一个，以酯的方式相结合。常见的KGM中甘露糖和葡萄糖的摩尔比约为1.5—1.7(通常为1.6)，乙酰基含量为15%。不同品种与来源的KGM 的分子量不同，一般来讲，其粘均分子量约为7—8*105，光散射法测得KGM的重

β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA)试剂盒使用说明

β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）试剂盒使用说明 分光光度法货号：BC0830 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存； 试剂二：液体30mL×1瓶，4℃保存； 产品说明： β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。 β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。 自备仪器和用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 粗酶液提取： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管 样本100100 蒸馏水100 试剂一100 充分混匀，放入37℃水浴60min。 试剂二600600 充分混匀，沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，550nm处记录各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数），ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 β-1,3-GA活性计算： 标准条件下测定回归方程为y=0.0958x-0.0192；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。 （1）按蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-GA(U/mg prot)=[(ΔA+0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr)=10.438×(ΔA +0.0192)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-GA(U/g鲜重)=[(ΔA+0.0192)÷0.09585×V1]÷(W×V1÷V2)=10.438×(ΔA

酶制剂在工业上的应用现状与展望

《酶工程》课程论文 学院：材料与化工学院 专业班级：2011级生物工程（2）班 姓名：李丹丹 学号：20110412310047 评阅意见 评阅成绩 评阅教师： 2014年6月12日

酶制剂在工业上的应用现状与展望 姓名：李丹丹 学院和专业：材料与化工生物工程2班 摘要：酶制剂是一类特殊的食品添加剂，具有催化高效性，专一性等显著特点。文章综述了食品工业中酶制剂利用及新动向，包括淀粉糖、油脂、蛋白质加工、面包、啤酒、饮料工业以及改善苦味的酶类的应用。并介绍了酶与食品的关系、酶制剂在食品生产中用于保藏、改善质量和增加营养价值、增加品种种类、提高便捷性和提高食品生产效率等作用,还介绍了酶制剂在饲料中的应用。并对酶制剂在食品工业中和在动物饲料方面的发展方向进行展望。关键词：酶制剂食品工业饲料工业应用 1.酶制剂的简介 酶是一类具有专一性生物催化能力的蛋白质。而从生物体中提取的具有酶活力的制品，称为酶制剂。酶制剂主要用于食品加工和制造业方面，它在对提高食品生产效率和产量、改进产品风味和质量等方面有着其它催化剂所无法替代的作用。另外，酶制剂在日化、纺织、环境保护和饲料等行业也有着较广泛的应用。随着发酵工业的发展，酶制剂的主要来源已被微生物所取代，它具有不受季节、地区和数量等因素影响的特性，还具有种类多、繁殖快、质量稳定和成本低等特点。随着微生物育种技术的发展，酶制剂的种类越来越多，分类也越来越细。目前我国已工业化生产的、且用于食品工业的酶制剂主要有：淀粉酶、异淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等，它们在食品加工中都起着十分重要的作用。当然，尽管目前我国酶制剂行业的发展已有了长足进步，但与发达国家相比，还有很大差距。为进一步加快酶制剂产业技术的进步，今后应注重在调整产品结构、增加新品种、提高产品质量和竞争力、实现规模化经营和拓宽应用领域等方面作深入的研究。 2．酶制剂在食品工业中的应用 利用淀粉酶可以将淀粉水解为葡萄糖或不同DE值的淀粉糖浆，再经过葡萄糖异构酶的作用产生果葡糖浆；果胶酶用于果汁的加工和澄清，可提高果酒的得率，改善澄清效果，加快过滤速度；乳糖酶可分解牛奶中的乳糖，提高人体对牛奶的消化性；脂肪酸可改进食品风味；蛋白酶可用于蛋白胨和氨基酸混合液的制造，生产糖果使用的蛋白发泡剂，用在面包、糕点和通心粉的生产上可缩短揉面时间、增强面团延伸性和改进产品质量，用在肉类加工上可嫩化肉类、软化肠衣和提高质量，用在乳酪制造上可缩短生产时间等。 2．1用于保藏 溶酶菌现已广泛地被用作水产品、肉食品、蛋糕、酒精、料酒、饮料以及日用化妆品的防腐剂。由于食品中的羟基和酸会影响溶酶菌的活性，因此，它一般与酒、植酸、甘氨酸等物质配合使用。目前与甘氨酸配合食使用的溶酶菌制剂，应用于面食、水产、熟食及冰淇淋等食品的防腐。在低度酒中添加20mg/kg的溶酶菌不仅对酒的风味无任何不良影响，还可防止产酸菌的生产，同时受酒类澄清剂的影响很小，是低度酒类较好的防腐剂，如日本就把溶酶菌用于清酒的防腐。 乳制品保险牛乳中含有13mg/dl的溶酶菌，在人乳中含量为40mg/ml。在鲜乳或奶粉中加入一定量溶酶菌，不但可起到防腐作用，而且还有强化作用，能增进婴儿健康。 将各种肉类和水产熟制品（如鱼丸、香肠及红肠等），用含1%明胶和0.05%溶酶菌的混合液浸渍后再包装保存，可延长其保质期。各类糕点特别是奶油蛋糕是容易腐败变质的食品，在制作过程中加入溶酶菌就具有一定的防腐、保鲜作用。此外，溶酶菌还可应用于pH值为6.0~7.5的饮料的防腐。 海产品及水产品如虾、鱼和蛤蜊等在含甘氨酸、溶酶菌和食盐的溶液中浸渍5min后，沥干，在5℃下保存9d后，无异味、无色泽变化。 3．2提高食品质量和增加营养价值

蛋白酶活力测定方法

酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）

简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。

葡甘露聚糖

性状 白色或奶油至淡棕黄色粉末。可分散于PH值为4.0~7.0的热水或冷水中并形成高粘度溶液。加热和机械搅拌可提高溶解度。如在溶液中加中等量的碱，可形成即使强烈加热也不熔融的热稳定凝胶。淡黄至褐色粉末。基本无臭、无味。其水溶液有很强的拖尾（拉丝）现象，稠度很高。对纤维物质有一定分解能力。主要成分为多糖。 用途 食品；保健品；医药用品；美容器具；胶凝剂；增稠剂；乳化剂；稳定剂；成膜剂。KGM在保健品中的运用机理葡甘露聚糖是自然界分子量最大、粘度最高的膳食纤维，具有极高的浓度。众所周知，可溶性膳食纤维最重要的品质在于其粘度，粘度是降低饭后所增加的血糖浓度指数并保持其总体稳定最重要的因素。粘度越高，功效越好。葡甘露聚糖具有最强的持水能力，能吸附其自身体积200倍的水分子形成粘稠的溶液。由于其特殊的葡萄糖和甘露糖的β-1-4链式结构，它不被人体的消化酶所影响，并不会产生热量。不含有糖份，脂肪，淀粉和蛋白质等具有热量的物质

●魔芋葡甘露聚糖的营养保健功能 由于魔芋葡甘露聚糖特殊的性能，现代医学证明，作为一种医药添加剂，它能够有效地降低胆固醇、血糖和减肥，在医药行业将有广泛的应用前景，可用于治疗高血脂、糖尿病、肥胖和便秘等 1.降血糖，增加胰岛素敏感度糖尿病患者通常需要检测食物的升糖指数（食物在体内转化成葡萄糖的能力）来控制饮食的健康。例如，软饮料中的糖和淀粉能够相对快速地转化成葡萄糖进入血管。糖尿病患者必须选择低升糖指数的食品，这是因为血糖的急速增加会加剧胰腺产生胰岛素，并导致胰岛素抵抗，这两个因素都会使饭后血糖浓度快速上升。葡甘露聚糖与低升糖指数食物效果相当。在消化过程中，营养物质通过食物流到达小肠的表面进而被吸收。葡甘露聚糖在溶解后形成的胶凝体在捕获到营养物质后将其包裹在胶体内，并能减缓食物在消化道内流动的速度。被包裹起来的营养物质因接触不到消化酶无法被小肠所吸收，魔芋葡甘露聚糖能够捕获膳食糖份中的营养物质如多糖和淀粉。因此，血液吸收糖的速度减缓了，糖尿病患者也能明显地体验到饭后稳定的血糖了。血糖的平稳使其对胰岛素的作用更敏感，从而避免血糖的高低波动给胰腺带来大的压力，同时对糖尿病患者和预防类型Ⅱ糖尿病（不能产生足够

ad木聚糖酶(XYNB)的分离纯化与性质研究

南京工业大学 硕士学位论文 耐热木聚糖酶（XYNB）的分离纯化与性质研究 姓名：孙雷 申请学位级别：硕士 专业：生物化工 指导教师：韦萍;李环 20060601

摘要 木聚糖是植物半纤维素的重要组成部分，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生物质资源。木聚糖结构复杂，它的完全降解需要多种水解酶的共同作用。内切-β-1,4-木聚糖酶（1,4-β-D-木聚糖水解酶，EC3.2.1.8）以内切的方式作用于木聚糖的主链，产生不同链长的寡糖及少量的木糖，是木聚糖降解酶系中关键的酶。木聚糖酶的耐高温和热稳定性是工业化应用的理想特性，在生物转化、制浆造纸，食品饲料等工业中存在很大的应用潜力。 本文综述了木聚糖酶的分离纯化技术以及性质和结构研究进展，研究了重组大肠杆菌1020产生的耐热木聚糖酶（XYNB）的纯化方法与性质。 采用不同的破碎方法，对表达的木聚糖酶在细胞中的分布进行分析，确定了表达的耐热木聚糖酶XYNB主要分布中可溶性细胞质中。纯化前对表达的酶进行细胞定位是本论文的一个特色。 XYNB是胞内酶，采用反复冻融和超声波联合的方法破碎，发现对湿菌泥反复冻融三次后，酶的释放量最大；50 mL 20%的菌悬液，采用500 W，间歇时间10 s，超声波破碎15 min后，酶的释放量最大。利用热变性除去杂蛋白，选择变性温度70℃，时间30 min，回收率可达到69.4%，纯化倍数4.9。结合Ni-NTA 亲和层析，采用梯度洗脱方法，一步得到电泳纯XYNB，回收率29.4%，纯化倍数13.4。采用热变性和一步亲和层析分离得到电泳纯的耐热木聚糖酶XYNB，简化了分离纯化步骤，是本论文的一个特色。 酶学性质研究表明XYNB的最适pH在6.5左右，在pH 6.0-10.0能保持最高活力的60%以上，在pH值低于6.0和高于10.0时，活力显著下降。在50-100℃范围内，酶催化活力随着温度的升高不断上升，酶在80-100℃范围内表现出50%以上的酶活力。在pH8.0，70℃，保温6 h后，酶活力变化不大；100℃保温1.5 h 后，残余50%的酶活力。1mmol/L Hg2+显著影响酶活力，其它金属阳离子和EDTA 对酶活的影响不大。XYNB对Oat spelt xylan 酶促反应的K m为0.23 mg/mL，最大反应速度V max为0.36 μmol/(min﹒mL)。 采用生物信息学手段分析XYNB的序列和结构，发现XYNB属于F/10族，与Thermotoga sp. strain FjSS3-B.1的xyn A有85%一致性，与Thermotoga

葡甘聚糖的提取工艺综述

魔芋葡甘聚糖的提取工艺综述 摘要目的:综述魔芋葡甘聚糖的提取及分离方法研究现状。方法:对国内外文献进行归纳、分析及总结。结果:魔芋葡甘聚糖是天然高分子多糖，理化性质稳定。结论:魔芋葡甘聚糖在医药、化工、食品等方面具有广泛的应用前景，在药用辅料方面值得开发。 关键词: 魔芋葡甘聚糖提取分离综述 0 前言 魔芋属天南星科, 多年生草木植物。研究表明, 魔芋精粉中约含40 %～70 %的葡甘聚糖, 还含有少量蛋白质、食物纤维、淀粉、游离还原糖、氨基酸及微量无机盐等[1 ]。魔芋的主要活性成分为葡甘聚糖,它是对魔芋进行深加工利用的重要成分。魔芋葡甘聚糖的含量高,分子量大,其精粉及其相应产品的质量就好。由于葡甘聚糖及其改性产物水溶胶的高粘度、稳定性、乳化性、高膨胀性、成膜性、凝胶性和特定的生物活性,使得它们在食品、医药、化工、日化、造纸、纺织、石油和环保等领域具有很好的应用前景。因此,研究魔芋葡甘聚糖的提取分离方法具有重要的意义。 1 魔芋葡甘聚糖(KGM)的提取[ 2 ] 1.1粗提 魔芋粉 80g→150ml石油醚→60cC-65℃加热回流0.5h→过滤斗回收石油醚后→150mL 90%乙醇→70-80℃加热回流0.5h→过滤→回收乙醇→滤渣→60℃干燥→粗魔芋葡甘露聚糖。样品重71g，产品收率为89%。用分光光度法[6.71测得葡甘露聚糖含量为74.2%o 1.2精制 1.2.1乙醇沉淀法 粗魔芋葡甘聚糖(5g)→配成1%溶胶→95%乙醇沉淀→80%乙醇洗涤两次→85%乙醇50℃洗涤30min→95%乙醇沉淀→60℃干燥→粉碎→KGM。用分光光度法16,71测得KGM的含量为90.1%，产品收率为90.5%o 1.2.2酸水解法 粗魔芋葡甘聚糖(5g) →配成1%溶胶酸→水解(10%HCI调pH2-pH3,85℃-90℃水解15h)→95%

β-1,3葡聚糖酶检测试剂盒使用说明

β-1,3葡聚糖酶检测试剂盒使用说明 分光光度法货号：BC0360 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存； 试剂二：液体42mL×1瓶，4℃保存； 标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入1ml蒸馏水溶解，配制成10mg/ml葡萄糖溶液备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。 标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml。 产品说明： β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。 β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。 自备仪器和用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤： 粗酶液提取： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管（葡萄糖溶液）样本或标准液100100100蒸馏水100100 试剂一100 充分混匀，放入37℃水浴60min。 试剂二600600600 充分混匀，沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，540nm处记录各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数），ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 β-1,3-GA活性计算： 根据标准管吸光度（x）和浓度（y，mg/ml）建立标准曲线，将ΔA带入公式中计算出样品中产生的还原糖的含量y值（mg/ml） （1）按蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-GA(U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)=y÷Cpr （2）按样本鲜重计算

木聚糖酶在大肠杆菌中的表达

嗜热内切木聚糖酶基因xyn10B 克隆及其在大肠杆菌中的表达 食品科学093 谢江英 2009016513 自 Horflcoshi 于 1973 年首次报道了来自细菌中的木聚糖酶以来，国外科研工作者已分离出百余种不同微生物来源的木聚糖酶，并将其基因在各种宿主菌中得到活性表达。由于高产野生的微生物生产木聚糖酶时，释放出的产物较为复杂，往往产生大量的纤维素酶，导致在应用中产生不必要的麻烦。如在纸浆预漂白时，纤维素会被意外降解。并且这些酶的性质极为相近，分离纯化的成本较高，不利于木聚糖酶的推广使用，通过基因工程的方法来构建一些高效表达或胞外分泌的工程菌株，将有助于解决木聚糖酶的大量收集和纯化问题。我国对木聚糖酶的研究最近十几年才开始，大多限于天然木聚糖酶高产菌株的筛选，木聚糖酶的分离、纯化及性质分析，仅克隆和表达了少数木聚糖酶基因，而运用基因工程手段产业化生产木聚糖酶制剂在国内还刚刚起步。本研究从Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 分离出木聚糖酶基因 xyn10B，连接于表达载体 pET-28a（+）的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达质粒pET28a-xyn10B，转化大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codon plus-RIL，构建基因工程菌，实现木聚糖酶高效表达。 1 实验材料 1.1 菌株和质粒 （1）热解纤维素菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725； （2）质粒 pET-28a； （3）大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codonplus-RIL； 1.2 实验材料及主要试剂 1.2.1抗生素 氨苄青霉素，卡那霉素 1.2.2 试剂 胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖；PCR引物合成；DNA测序；不同来源底物； 其他常用化学试剂。 1.2.3 工具酶 限制性内切酶Nco I、Xho I、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000 DNA Marker 和λ-HindⅢ digest DNA Marker）。 1.2.4 试剂盒 PCR产物回收试剂盒，质粒小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒， Ni-柱纯化柱料。 2.培养基及主要试剂配制 （1）TAE buffer：核酸电泳缓冲液 Tris-乙酸 0.04 mol/L EDTA 0.001 mol/L （2）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris碱 15.1 g 甘氨酸 94 g SDS 5 g 去离子水补齐至1000ml。 （3）考马斯亮蓝染色液配方 甲醇/水（1 :1，v/v） 90 ml

β-葡聚糖测定方法

β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004) ? 1.原理 β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。 ? 2. 操作 ? 2.1.标准葡萄糖曲线的制作 2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL， 沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。 2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、 3.00mL、 4.00mL、 5.00mL、 6.00mL 和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为 0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL 葡萄糖标准溶液。 2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别 加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。 以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。 以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线 ? 3. 酶样测定 吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。 吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。 ?吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s-5s。以标准空白样(2.1.1)为空白对照，在540min处测定吸光度A 。 B

β-葡聚糖酶是一类分解β-葡聚糖的酶

β－葡聚糖酶是一类分解β－葡聚糖的酶，它主要分解大麦等麦类中以β－1，3和β－1，4混合键连接的β－D－葡聚糖和细菌地衣多糖，也称地衣多糖酶。β－葡聚糖酶主要由植物和微生物产生，在动物饲粮（尤其是含有大麦的饲粮）中添加能有效地解决β－葡聚糖的抗营养作用，降低食糜粘度。 产品规格 型号酶活剂型包装规格 FE303A2000 IU/g粉状20 kg/袋或桶 FE303B4000 IU/g粉状20 kg/袋或桶 FE303C6000 IU/g粉状20 kg/袋或桶 FE303AL2000 IU/ml液体30 kg/桶或200 kg/桶FE303BL4000 IU/ml液体30 kg/桶或200 kg/桶FE303CL6000 IU/ml液体30 kg/桶或200 kg/桶 产品特点 ●采用新型国际专利菌种生产，产品性能优良，使用效果得以保证； ●先进的全自动液体深层发酵技术，领先的后处理加工工艺，保障了产品的 高纯度、高稳定性和良好的均匀度； ●采用基因工程技术改良发酵菌种，使内切酶活性大幅度提高，是普通产品 的2.5～3.5倍； ●有良好的对高温高湿的耐受能力，在饲料制粒条件下，制粒后的酶活可以 保持85％以上，保证了其在颗粒饲料中的使用效果； ●有良好的对动物胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和高浓度金属离子的耐受能力， 保证了其在动物生产中的使用效果。 产品功能 ●有效降解植物饲料中的抗营养因子——β－葡聚糖，消除其抗营养作用， 降低食糜粘度，提高饲料养分的消化率和吸收利用率； ●与纤维素酶、木聚糖酶一起作用，有效摧毁植物细胞壁结构，促进植物细 胞内其它营养物质释放，提高原料中营养物质的利用率； ●促进内源酶的分泌，提高消化道中内源酶活性，促进营养物质的消化和吸 收，提高饲料利用率；

毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)

重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验 一、实验目的 1)熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。 2)掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。 3)熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。 二、毕赤酵母简介 甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。 毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。

β-葡聚糖的研究

啤酒生产过程中β-葡聚糖研究与测定 郑翔鹏 福建省燕京惠泉啤酒股份有限公司362100 摘要：研究了啤酒生产过程中β-葡聚糖的变化，发现刚果红显色法用于啤酒生产中半成品、成品的测定具有一定的可行性，同时运用的数学统计方法分析，测定的结果表明了其在整个生产过程的变化以及与相应影响因素的关系，起到指导生产的作用。 关键词：β-葡聚糖；刚果红显色法；啤酒 前言 β-葡聚糖是麦芽中非淀粉质多糖的主要组成部分，其占麦芽干物质的5%~8%，是通过β（1、3）、β（1、4）糖苷键随机排列的线性连接而成的。麦芽中水不溶性的β-葡聚糖主要存在于完整胚乳细胞壁中，热水可溶性β-葡聚糖酶，主要存在于胚乳细胞之间和蛋白质混合在一起。β-葡聚糖在水中溶解时，浓度低时直接与水分子相互作用增加溶液粘度，浓度大时，β-葡聚糖分子自身相互作用缠绕成网状结构，能吸收水分子形成凝胶，使溶液的粘度大大的增加；啤酒中适量的β-葡聚糖对口味的丰满有益，能增进口感的柔和性。 在糖化过程中，麦芽中游离的β-葡聚糖及其的分解产物溶于醪液中，使醪液的粘度上升；在35~50℃时，通过内-β-1、4葡聚糖酶和大麦内-β-葡聚糖酶的作用，高分子的β-葡聚糖逐步分解为β-葡聚糖糊精和低分子物质，醪液的粘度逐之下降；在45~55℃，麦芽浸出物继续溶解，β-葡聚糖继续游离，此时，内-β-1、4葡聚糖酶和大麦内-β-葡聚糖酶的活力逐步减弱，β-葡聚糖分解缓慢，但研究表明，内-β-1、4葡聚糖酶在50~55时仍具有一定的活力，可继续分解β-葡聚糖；在60~70℃时，β-葡聚糖溶解酶使大量的β-葡聚糖从其相结合的蛋白质中分离出来，在这个温度上，温度越高，游离出来的β-葡聚糖含量就越高，在65℃以上内-β-1、4葡聚糖酶的活力逐渐失活；在70℃以上，由于上述各种β-葡聚糖分解酶均已逐渐失活，此时由β-葡聚糖分解酶溶解的β-葡聚糖保持不变。 其中，影响β-葡聚糖分解的因素为：首要的还是大麦的品种与质量，溶解良好的麦芽，其的高分子β-葡聚糖含量远低于溶解不良的，而含的酶量远高于溶解不良的；粉粹条件也有一定影响，一般说细粉溶解出较多的β-葡聚糖；糖化的条件的影响，低温下料和低温糖化，β-葡聚糖的分解较明显，而高温糖化对高分子β-葡聚糖难分解到满意的程度，特别是对溶解不良的麦芽，但是，对麦汁中β-葡聚糖含量起作用的是麦芽质量，糖化方法只能起到调节的作用，当然了，延长低温休止时间，对β-葡聚糖的分解是有利的，PH值的影响不是很明显。研究表明，45℃糖化时只有少数的β-葡聚糖释放到麦汁中去，而在65℃糖化有大量的β-葡聚糖浸出到麦汁中，因此，就糖化温度以及糖化其他物理性质对糖化过程中β-葡聚糖的浸出比β-葡聚糖酶的影响更大，这将表明，麦汁中的β-葡聚糖含量主要取决于制麦过程中胚乳细胞壁所经受酶的水解程度。 对于麦汁、发酵液以及成品酒中β-葡聚糖的检测分析，作者根据多种分析方法研究分析实践，如利用苯酚法等，最终确定刚果红显色法进行分析研究。通过研究表明，该方法具有良好的线性，操作简单、方便，对于实际样品的检测有一定的指导生产的作用。 本文主要基于该检测方法上，研究整个啤酒酿造过程中β-葡聚糖的变化情况，同时根据不同品种的啤酒其β-葡聚糖的差异，表明一定的问题。 1、实验材料与方法 1.1实验材料 标准β-葡聚糖（美国Sigma公司生产） 刚果红（进口分装） 磷酸缓冲溶液（PH=8.0） 分光光度计（hp公司生产） 恒温水浴槽

β-葡聚糖酶活性测定(精)

β-葡聚糖酶活性测定 β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。 β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。 1 材料与方法 1.1 菌株与培养基 1.1.1 发酵产酶菌株 黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。 1.1.2 固态发酵培养基 麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100 ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。 微量元素液的组成为：2 mol/l HCl溶液 5 ml、FeSO4 2.5 g、MnSO4·H2O 0.98 g、ZnCl2 0.83 g、CoCl2 1.0 g、蒸馏水100 ml。

木聚糖酶在工业上的应用

真菌中的木聚糖酶:性能及其在工业上的应用 摘要：木聚糖是半纤维素的主要类型。这是一个由木二糖通过1,4位糖苷键连接的线性聚合物。在自然界中，多糖的分子骨干可以被4-O-甲基-α-D-吡喃葡糖醛酸、乙酰基、α-L-阿拉伯呋喃糖基等比例添加。木聚糖的水解主要是酶的复合物承担，但主要参与的酶是内切β-1，4-D-木聚糖酶和β-D-木糖苷。这些酶可由真菌、细菌、酵母、海洋藻类、原生动物、蜗牛、甲壳类动物、昆虫、种子等产生,但是主要商业来源是丝状真菌。最近,有很多工业对木聚糖及其其水解酶感兴趣,主要是其可用于补充动物饲料、生产面包、食物和饮料、纺织品、纤维素纸浆的漂白、乙醇和木糖醇的生产。本文描述了一些木聚糖的特性和它的新陈代谢,木聚糖酶的生化特性以及其商业应用。

一、木聚糖结构 阿拉伯木聚糖已确定在小麦、黑麦、大麦、燕麦、大米、高粱、以及其他一些植物中发现，如：盘固草、竹笋和黑麦草。尽管这些多糖是次要部分对于的整体的谷物,但它们是构成植物细胞壁的重要组成部分(Izydorczyk和Biliaderis 1995)。葡糖醛酸和葡糖苷酸阿拉伯木聚糖主要位于二层膜结构中，他是一种粘合剂，使非共价键结构与木质素、纤维素和其他聚合物形成一种共价键而粘合，对细胞壁的完整性起到至关重要作用。木聚糖在被子植物中是半纤维素的主要类贡献者，占总干重的15-30%,但在裸子植物中木聚糖的含量会少点，含有7- 12%(Haltrich 1996年)。 图1 O-乙酰基-4-O-甲基葡糖醛酸(a),硬木和阿拉伯-4-O-甲基葡糖醛酸(b),柔软木头的结构。木聚糖酶参与分解木聚糖的有:乙酰酯酶、α-葡萄糖醛酸酶、切木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃。β-木糖苷酶(c)实现了水解；数据显示碳原子被Ac乙酰基群替换

植物聚多糖葡甘聚糖的性质与应用

植物聚多糖魔芋葡甘聚糖的性质与应用1 摘要：本文全面介绍了魔芋的主要成分——葡甘聚糖（Konjac Glucomannan 简称KGM ）的结构、提纯方法、物理化学性质和其在医药卫生领域的保健功能及药用价值；综述了近年国内外的研究开发现状和其在食品、化工、纺织、医药、石油钻探等领域的应用，从而展示了KGM 这一丰富的可再生资源的学术研究价值以及在医药、化工、纺织等领域中的广阔的应用前景。 关键词： 魔芋；葡甘聚糖；聚多糖 1.葡甘聚糖的来源和化学结构 魔芋的主要成份是葡萄糖甘露聚糖，简称葡甘聚糖，在干魔芋块茎中含量高达55～80％ [1, 2]。它是由D-葡萄糖(G)和D –甘露糖(M)按1:1.6或1:1.69的摩尔比通过β-1，4-吡喃糖苷键结 合而成的复合多糖。在其主链上甘露糖的C3位置上往往存在着通过β-1，3糖苷键结合的支链结构，除葡萄糖和甘露糖残基外，还有少量乙酰基存在 [3, 4]。 KGM 的结构如图1所示。 图1 KGM 的大分子结构 Figure 1 The Macromolecular Structure of KGM 由于KGM 的性质受其提取工艺和纯度的影响较大，因此KGM 的分离和提纯方法的研究一直备受关注，文献中多有报道[5-7]。其中常用的是乙醇沉淀法、铜盐法和真空冷冻干燥法。铜盐法以及早期的乙醇沉淀法在提纯KGM 的过程中由于进行了高温处理，使KGM 失去水溶性而只能溶解在20%NaOH 溶液中。真空冷冻干燥法由于保持了物质的结构与形态，未受到高温的影响而保持了良好的水溶性。目前，真空冷冻干燥法是一种比较好的采用较多的方法。近年来，生物催化剂酶亦被用于KGM 的提纯[8, 9]。这种方法利用淀粉酶和蛋白酶将魔芋精粉中所含的淀粉和蛋白质分解除去，然后再用乙醇将KGM 从反应体系中提取出来，从而得到高纯度的、水溶性良好的葡甘聚糖。相对于一般的化学方法，利用酶提纯的方法得到的葡甘聚糖的纯度要高的多。 2 魔芋葡甘聚糖的物理性质及其应用 2.1 魔芋葡甘聚糖的亲水性及其应用 葡甘聚糖是一种高分子量的水溶性非离子天然聚合物，其平均分子量因产地、品种、加工方法以及原料储存时间的不同而不同 [10]，一般可达到106数量级。KGM 溶于水，不溶于甲 M M M M O C -O