无菌工艺验证指导原则

无菌工艺验证指导原则

1 概述

无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲，无菌药品应完全不含有任何活的微生物，但由于目前检验手段的局限性，绝对无菌的概念不能适用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌”。一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL）来表征。而这种概率意义上的无菌保证取决于合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及生产过程中严格的GMP管理。

无菌药品通常的灭菌方式可分为：1）湿热灭菌；2）干热灭菌；3）辐射灭菌；4）气体灭菌；5）除菌过滤。按工艺的不同分为最终灭菌工艺（sterilizing process）和无菌生产工艺（aseptic processing）。其中最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药品的方法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工艺。部分或全部工序采用无菌生产工艺的药品称为非最终灭菌无菌药品。基于无菌药品灭菌/除菌生产工艺的现状，本指导原则主要对在注射剂与无菌原料药的生产中比较常用的湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。本指导原则中的湿热灭菌工艺验证主要包括灭菌条件的筛选和研究，湿热灭菌的物理确认，生物指示剂确认等内容；无菌生产工艺验证主要包括无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、过滤系统的验证等验证内容。

最终灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大差异。最终灭菌无菌产品的无菌保证水平为残存微生物污染概率≤10-6，非最终灭菌无菌产品的无菌保证水平至少应达到95%置信限下的污染概率<0.1%。由此可见，非最终灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，为尽量减少非最终灭菌无菌产品污染微生物的概率，鼓励企业在生产中采用隔离舱等先进技术设备。

基于质量源于设计的药品研发与质量控制的理念，为保证无菌药品的无菌保证水平符合要求，研发者在产品的研发过程中应根据药品的特性选择合适的灭菌方式，并系统地评估生产的各环节及各种因素对无菌保证水平的影响，根据风险的高低与风险发生的可能性等来针对性地验证灭菌工艺的可靠性，验证的内容、范围与批数等取决于工艺与产品的复杂性以及生产企业对类似工艺的经验多少等因素。只有在研发中经过系统而深入的研究与验证，获得可靠的灭菌工艺，并在日常的生产过程中严格执行该工艺，才能真正保证每批药品的无菌保证水平符合预期的要求。当然，在药品的整个生命周期内，随着对所生产的药品的特性和生产工艺等的了解越来越全面和深入，灭菌工艺也在不断的完善，此时就会涉及到对变更后的工艺如何进行验证的问题，本指导原则也适用于此种情况。

由于灭菌/除菌工艺验证的工作在我国开展的时间不长，基础还不牢靠，因此必然在实际工作中会遇到很多难以预料的问题，故本指导原则只是一个一般性原则，药物研发者应从药物研发的客观规律出发，具体问题具体分析，必要时根据实际情况采用其他有效的方法和手段。同时，本指导原则作为阶段性产物，

必将随着药物研究者与评价者对灭菌工艺研究与验证的认知加深，而不断进行修订与完善。

2制剂湿热灭菌工艺

2.1湿热灭菌工艺的研究

2.1.1 湿热灭菌工艺的确定依据

灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺的决策树（详见附件1）进行，湿热灭菌工艺是决策树中首先考虑的灭菌工艺。湿热灭菌法是利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。高温在杀灭微生物的同时，可能对药品的质量也有所影响。如果产品不能耐受湿热灭菌，则需要考虑采用无菌生产工艺。所以，对于药品的灭菌工艺的考察和确定，首先是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能否耐受湿热灭菌的高温。

目前湿热灭菌方法主要有两种：过度杀灭法（F0≥12）和残存概率法（8≤F0<12）。用其它F0值小于8的终端灭菌条件的工艺，则应该按照无菌生产工艺要求。

以上两种湿热灭菌方法都可以在实际生产中使用，具体选择哪种灭菌方法，在很大程度上取决于被灭菌产品的热稳定性。药物是否能耐受湿热灭菌工艺的高温，除了与药物活性成分的化学性质相关外，还与活性成分存在的环境密切相关，所以在初期的工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性进行综合分析，以确定能否采用湿热灭菌工艺。

2.1.1.1活性成分的化学结构特点与稳定性

通过对活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断活性成分的稳定性，如果活性成分结构中含有一些对热不稳定的结构基团，则提示主成分的热稳定性可

能较差。在此基础之上，还应该通过设计一系列的强制降解试验对活性成分的稳定性做进一步研究确认，了解活性成分在各种条件下可能发生的降解反应，以便在处方工艺的研究中采取针对性的措施，保障产品能够采用湿热灭菌工艺。

2.1.1.2 处方工艺的研究

在对活性成分的结构特点与稳定性进行研究的基础上，可以有针对性的进行处方工艺的优化研究。如活性成分易发生氧化反应，则需要考虑是否需要在工艺中去除氧并采取充氮的生产工艺，或在处方中加入适宜的抗氧剂；如活性成分的稳定性与pH值相关，则需要通过研究寻找最利于主成分稳定性的pH值，当然此时需要关注该pH值在临床治疗时能否接受；如果主成分是因为某些杂质的存在影响了稳定性，则需要通过适宜的手段去除相关的杂质；如果是主成分在某种溶剂系统中稳定性较差，则需要考虑更换溶剂系统，此时同样需要考虑所选用的溶剂系统在临床应用时能否被接受；湿热灭菌的不同灭菌温度和灭菌时间的组合对产品的稳定性的要求有所不同，可以在保证提供所需的SAL 的基础上，通过灭菌时间和灭菌温度的调整来确定药物可以耐受的湿热灭菌工艺。

总之，需要通过各个方面的研究，使药物尽可能的可以采用湿热灭菌工艺。只有在理论和实践均证明即使采用了各种可行的技术方法之后，活性成分依然无法耐受湿热灭菌的工艺时，才能选择无菌保证水平较低的无菌生产工艺。

2. 2.1.3稳定性研究

无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产品的稳定性研究。考察最终灭菌程序对产品性质稳定性影响的试验可包括产品的降解、含量、pH值、颜色、缓冲能力以及产品的其它质量特性。

灭菌时，杀灭微生物的效果和活性成分的降解都随着时间和温度而累积。这意味着加热和冷却的变化将影响产品的稳定性，同时影响杀灭效果。因此，稳定性研究用样品最好选取处于最苛刻的灭菌条件的产品，如：可采用在热穿透试验中F0最大的位置上灭菌的产品进行稳定性考察，以确保灭菌产品的质量仍能符合要求。

2.1.2过度杀灭法的工艺研究

通常来说，与残存概率法相比，过度灭杀法所需的被灭菌品开始生产阶段和日常监控阶段生物负荷的信息较少，但是过度杀灭要求的热能比较大，其后果是被灭菌品降解的可能性增大。

过度杀灭法的目标是确保达到一定程度的无菌保证水平，而不管被灭菌产品初始菌的数量及其耐热性如何。过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物的耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121℃值大于0.5分钟。因此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高的无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏的假设，从技术角度看，对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了。

但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。仅从控制热原的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。如果实际生产中能够严格遵循GMP的要求，这一点是可以实现的。

2.1.3残存概率法的工艺研究

与过度杀灭法相比，残存概率法方法所需的信息量要大得多，包括被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段的信息、指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的试验菌）以及生物负荷的信息。只有积累了这类有价值的信息后，才能制定比过度杀灭法F0值低的热力灭菌程序，同时产品的无菌保证水平不会降低。使用热力较低灭菌程序更有利于药品的稳定性，使产品的有效期延长。正是因为这个原因，残存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。

通常说来，不耐热药品的灭菌可能不能使用过度杀灭法，需要设计一个灭菌程序能够恰当地杀灭生物负荷，同时不导致产品不可接受的降解。这种情况下，灭菌程序的确认就需研究产品的生物负荷和耐热性。根据以下公式可以比较清楚的说明这一点：

无菌保证值= F0 / D - lgN0

其中，无菌保证值是SAL的负对数，N0为灭菌开始时产品中的污染微生物总数，D为污染微生物的耐热参数。所以，菌工艺的无菌保证值与F0、N0、D 密切相关。

2.1.

3.1 灭菌前生物负荷的控制

采用残存概率法进行终端灭菌的产品，除了需要关注灭菌过程本身，还需要在生产过程中采用一些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。具体的措施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、工艺参数的控制等等。

灭菌前微生物污染水平的监测将在下面的章节详细阐述。产品过滤在终端灭菌的产品中仅仅作为辅助的控制手段，但是在工艺确定的过程中，也应该对滤膜

的孔径、材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。在工艺参数控制方面，由于微生物的特性，通常在药液放置期间也会逐渐繁殖，尤其一些营养型的注射液，如葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等，其环境更有利于微生物的生长和繁殖，因此应通过工艺筛选和验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放置的最长时限，并相应确定产品的批量、生产周期等关键工艺参数。

2.1.

3.2 灭菌前微生物污染的监测

灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充分考虑到产品从灌封到灭菌前的放置时间。一般而言，如果灌装持续一段时间，可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。污染水平检查可以采用如下的方法：先用灭菌的5%吐温充分湿润0.45um的滤膜，然后定量过滤药液，将此滤膜移至营养琼脂平板上，在30~35℃下培养3~7天，计数。

分离获得的污染菌需要进行耐热性的检查。污染菌的耐热性检查可以采用以下的测定方法：先用灭菌的5%吐温充分润湿0.45um 的滤膜，然后过滤污染水平监测所取的药液样品，再将此膜移至装有无菌的待监测产品的试管中，在沸水浴上煮沸约30分钟，然后在30-35℃下在硫乙醇酸盐肉汤中培养，观察是否有耐热菌生长。

当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时，可采用定时煮沸法将它和已知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，可再测试耐热污染菌的D值（D值的具体检测方法详见附件2），然后根据灭菌的F0值及污染菌的数量与耐热性对产品的无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌进行鉴别、调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。

2.2湿热灭菌工艺的验证

湿热灭菌工艺的验证一般分为物理验证和生物学验证两部分，物理验证包括热分布、热穿透试验，生物学验证主要是微生物挑战试验。物理验证是证实灭菌效果的间接方式，而微生物挑战试验则直接反映灭菌的效果，两者不能相互替代。

2.2.1物理确认

2.2.1.1空载热分布试验

空载热分布的目的是主要是了解整个灭菌设备的运行情况，确认灭菌室内的温度均匀性，测定灭菌腔内不同位置的温差状况，确定可能存在的冷点。空载热分布试验通常采用足够数量的热电偶或热电阻作温度探头，进行编号后将它们固定在灭菌柜腔室的不同位置。温度探头的安放位置需要根据设备类型和不同位置下的灭菌风险评估而定，应包括可能的高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、靠近温度记录探头处，其他的探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内，以使温度的检测具有较好的代表性。温度探头在试验前后至少需要两个温度点进行校正。温度探头安放结束后，即可以按照设定的灭菌程序进行灭菌。

2.2.1.2装载热分布试验

装载热分布试验的目的是了解设备在装载条件下内部的温度分布状况，包括高温点、低温点的位置，为后续的评估和验证打下基础。装载热分布一般在空载热分布的基础上进行。温度探头的个数和安放的位置一般同空载热分布试验，注意一定要在空载热分布试验确定的冷点安放温度探头。温度探头安放在待灭菌的容器的周围，注意不能介入待灭菌的容器。

装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况，进行试验时，应尽可能使用待灭菌产品，如果采用类似物，应结合产品的热力学性质等进行适当的风险评估。待灭菌产品的装载方式和灭菌工艺的各项参数的设定应与正常生产时一致，应采用图表的方式说明产品的装载情况，并评估探头放置是否合理。如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格，应评估验证所采用的样品和装载方式是否能充分反映所有样品的实际装载情况。每一装载量的热分布试验需要至少进行三次。温度探头在试验前后同样均需要进行校正。

2.2.1.3 热穿透试验

热穿透试验是考察灭菌柜和灭菌程序对待灭菌产品适用性的一项试验。热穿透试验的目的是确认产品内部也能达到预定的灭菌温度。对于药物而言，灭菌程序既要赋予产品一定的F0值，以保障产品的SAL≤10－6 。同时灭菌程序又不应使产品受热过度而造成药物部分降解，以致同一灭菌批次的产品出现质量不均一。

热穿透试验所用的温度探头的个数和安放位置需要根据热分布试验的结果确定。一般可以采用足够数量的温度探头。应将热穿透温度探头置于液体容器中的冷点，即整个包装中最难灭菌的位置。如果有数据支持或有证据表明将探头放在产品包装之外也能够反映出产品的热穿透情况，风险能够充分得到控制，也可以考虑将探头放在容器之外。插有温度探头的产品的安放位置包括热分布试验确定的冷点和高温点、其他可能的高温点、灭菌柜温度探头附近、温度记录探头处。

热穿透试验的步骤及要求与装载的热分布试验基本相同，每一装载方式的热穿透试验也需要至少进行三次。通过热穿透试验可以确定在设定的灭菌程序下，

灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够到达设定的温度。结合灭菌前微生物污染的检测，可以确定灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够获得设定的F0值。

对于F0值最大点位置的样品，由于其受热情况最为强烈，因此应评估该位置下产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳定性没有影响。

2.2.1.4热分布和热穿透试验数据的分析处理

在物理确认试验中，应确认关键和重要的操作参数并有相应的文件和记录。通常需要关注的主要参数包括

- 每个探头所测得温度的变化范围

- 不同探头之间测得的温度变化范围

- 探头测得的温度与设定温度之间的差值

- 探头测得超过设定温度的最短及最长时间

- F0 的下限及上限

- 灭菌阶段结束时的最低F0值

- 灭菌阶段的最低和最高压力

- 饱和蒸汽温度和压力之间的关系

- 灭菌阶段腔室的最低和最高温度

- 热穿透温度探头之间的最大温差或F0 的变化范围

- 热分布试验中温度探头间的最大温差

- 最长平衡时间

- 最少正常运行的探头数

合格标准应结合灭菌条件、灭菌设备的特点以及产品的实际情况制定。通常情况下，灭菌柜腔室最冷、最热点和平均温度之间的温差应不超过2.5℃。保温时间内温度波动应在±1.0℃之内，如果温度差别过大，提示灭菌柜的性能不符合要求，需要寻找原因并进行改进，重新进行验证。另外对于热敏感的药物，还应该控制灭菌柜的升温和降温时间，以保证热能的输入控制在合理的范围以内，不会对产品的热稳定性造成影响。

2.2.2 生物学确认

湿热灭菌工艺的微生物挑战试验是指将一定量已知D值的耐热孢子（生物指示剂）在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能达到产品所需的标准灭菌时间和F0。此项验证工作能够如实反映灭菌工艺条件对微生物的杀灭效果，从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要求。

2.2.2.1生物指示剂选用的一般原则

一般情况下，生物指示剂选择的原则性要求是：孢子稳定、非致病菌、易于培养、有效期长、保存及使用方便、安全性好。针对具体的灭菌工艺和具体的产品，还应注意所用的生物指示剂的耐热性应强于待灭菌产品中的污染菌。

湿热灭菌工艺常用的生物指示剂有以下几种，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌等。对于采用过度杀灭法的灭菌程序，生物指示剂系统主要是嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子。残存概率法由于其热输入量比较低，因此在验证中使用的生物指示剂的耐热性可以小于嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子。

2.2.2.2生物指示剂的使用和放置

实际验证过程中可以直接采用市售的生物指示剂成品或将生物指示剂接种在待灭菌产品上。采用市售品时，只要供应商具有相应的质量体系认证资质，在测试中其提供的生物指示剂的D值就可以被接受。采用将生物指示剂接种到待灭菌产品的方法，由于生物指示剂在不同介质或环境中的耐热性会有所不同，首先应考虑产品对生物指示剂耐热性的影响。所以对于具体的品种而言，如果需要将生物指示剂接种至产品之中，应测定生物指示剂在该产品中的耐热性，即D值。如果生物指示剂与产品不相容，可以用与产品相似的溶液来代替产品。

生物指示剂的用量需要根据生物指示剂在待灭菌样品中的耐热性来确定，其用量应符合挑战性试验的要求。生物指示剂的用量可以采用阴性分数法或者残存曲线法计算，可以根据实际情况（如污染菌的耐热性，拟用的生物指示剂的D 值等）选择合适的计算方法，具体检测方法见附件3。

应结合产品特点和热分布、热穿透的实际结果来确定生物指示剂的放置位置。装有生物指示剂的容器应紧挨于装有测温探头的容器，在灭菌设备的冷点处必需放置生物指示剂。灭菌柜的其他部位应装载产品或者类似物，以尽可能的模仿实际生产时的状况。

2.2.2.3灭菌

生物指示剂的验证应该按照产品设定的灭菌工艺进行灭菌。

2.2.2.4检查和培养

可以根据生物指示剂的生长特性以及验证时的包装方式，采用适当的方法进行检查和培养。将指示剂放入培养基中进行培养。需要注意不同的生物指示剂所

需要的培养条件也各不相同，针对使用的生物指示剂确定培养条件，同时应放置阴性和阳性对照样品。

2.2.

3.5试验结果的评价

根据生物指示剂的D值和接种量推算产品在灭菌过程中实际达到的SAL值。验证新的灭菌工艺时，每个产品的每个规格的每一灭菌程序，至少需要连续进行三次生物指示剂验证试验。如果试验的重现性好，所有试验的结果均提示SAL≤10-6，则验证结果提示该灭菌工艺为验证合格的灭菌工艺。如果各次验证的结果不一致，需要分析原因，采取相应的改进措施后重新进行验证工作。3制剂无菌生产工艺

3.1无菌生产工艺的研究

无菌药品应首选采用终端灭菌工艺。如不能耐受终端灭菌工艺条件，应尽量优化处方工艺，以改善其耐热性。如确实无法耐受终端灭菌工艺，则可采用无菌生产工艺。无菌生产工艺通常包括无菌分装生产工艺和除菌过滤生产工艺。3.1.1无菌分装生产工艺的研究

无菌分装生产工艺是将采用经验证的灭菌/除菌工艺过程处理后的原料药或者原料药和辅料，用无菌生产的方法分装到采用经验证的灭菌工艺处理的容器中，密封得到的。无菌分装生产工艺的工艺研究和生产过程控制的重点是影响无菌保证水平的工艺步骤，主要包括物料（包括原料药、辅料、内包装材料等）的质量控制、原材料暴露于环境中可能再污染的操作步骤等。

关于物料的质量控制，采用无菌分装生产工艺的制剂所涉及的各种物料，都必须采用适当的灭菌/除菌工艺处理后方可使用。各种物料的灭菌/除菌工艺，都

应是经过验证的、控制良好的工艺。同时需要对各种物料的无菌性、细菌内毒素水平等进行严格控制，通过研究确定相应的质控标准。

无菌分装的生产工艺是将原料药或者原料药和辅料经分装设备分装至内包装材料中后密封得到。分装步骤是影响产品质量和无菌保证水平的关键生产步骤，应结合生产设备和产品特点进行工艺参数的研究，包括分装速度和分装时间等。

无菌分装生产工艺能否达到设定的无菌保证水平，与整个生产过程的控制密切相关，应按照GMP要求及产品具体生产工艺情况进行生产环境和生产过程的控制。在进行无菌生产工艺验证时，应采用最差条件进行验证，在实际生产过程中，对生产过程和工艺参数的控制均不能超过经验证的最差条件的控制范围。

3.1.2 过滤除菌生产工艺的研究

过滤除菌的无菌生产工艺是通过除菌过滤器，将药液中的微生物除去得到无菌滤液。采用过滤除菌工艺时，同样需要对影响无菌保证水平的工艺步骤及工艺参数进行详细的研究，主要包括物料的质量控制、除菌过滤器的选择及除菌过滤工艺参数的研究、除菌过滤生产过程的控制等。

对于采用过滤除菌生产工艺的制剂，需注意对配制药液使用的原料药、辅料（包括注射用水）等原材料的微生物种类及数量进行检查，掌握潜在的污染微生物的总体特性情况，通过研究确定相应的质控标准。采用过滤除菌生产工艺的制剂所使用的内包装材料，必须采用适当的经验证的灭菌工艺处理后方可使用。除菌过滤生产工艺所使用的除菌过滤器，通常为标称孔径0.2微米或更小的除菌级的过滤器。除菌过滤器的过滤效能是评价除菌过滤工艺的重要参数，需要

对除菌过滤器的过滤效能进行验证。通常，影响除菌过滤器的除菌过滤效能的因素包括：①药液的性质，如药液的粘度、表面张力、pH值、渗透压等；②过滤步骤的工艺参数，如过滤的压力、流速、时间、温度等；③除菌过滤器的相关参数，如除菌过滤器与药液的相容性、除菌过滤器的过滤总量和使用周期等。除菌过滤器的过滤效能可因产品和操作条件不同而显著不同。除菌过滤器的选择及工艺参数的研究可结合上述影响除菌过滤器的过滤效能的因素进行。在实际生产过程中，在过滤除菌前后均需要进行滤器完整性测试。由于微生物通过过滤器的概率随着待过滤溶液中微生物数量的增加而增加，除菌过滤工艺中需对待过滤溶液的微生物负荷情况进行研究和控制，通常情况下，最终除菌过滤前，料液的微生物负荷应不超过10cfu/100ml。应通过研究确定无菌生产各操作环节的时间控制范围，如料液配制后待过滤的存放时间、药液过滤操作的时间、过滤后至灌装前放置的时间、灌封操作的时间、灭菌后的内包装材料及密封件允许的放置时间等。各生产环节操作时间的确定需提供相应的试验数据。

3.2 无菌生产工艺的验证

无菌生产工艺的验证主要包括培养基模拟灌装试验，应当尽可能模拟常规的无菌生产工艺，包括所有对无菌结果有影响的关键操作，及生产中可能出现的各种干预和最差条件。新建的无菌生产工艺的生产线在正式投产前必须进行连续三批无菌培养基模拟灌装试验。在生产用的设备、设施、人员结构及工艺方法有重大变更时都应进行培养基模拟灌装试验。实际生产中每半年应至少进行一次培养基模拟灌装试验。

对于除菌过滤无菌生产工艺的验证，还包括对除菌过滤系统的验证，如过滤器的微生物截留验证、过滤器与待过滤药液的相容性验证、过滤器的完整性验证等。

3.2.1培养基模拟灌装试验

3.2.1.1培养基

培养基模拟灌装试验需要选择合适的培养基，并对培养基的质量进行控制。应当根据产品的剂型、培养基的选择性、澄清度、浓度和灭菌的适用性选择培养基。一般选用胰胨大豆肉汤培养基（TSB），按每30g加1L过滤纯化水的比例，配制足够量。某些特殊情况下也可以选用厌氧生长培养基，如硫乙醇酸盐培养基（FTM）。

培养基的质量控制主要包括培养基的微生物生长性能和无菌性。

培养基的微生物生长性能：在按照标准操作规程制备培养基并灭菌后，可按照中国药典附录进行培养基微生物生长性能试验，确认所制备的培养基应出现明显的所接种的微生物的生长。

培养基的无菌性：可按照中国药典附录进行培养基无菌性检查，结果应符合规定。

在培养基模拟灌装试验中，需进行阳性对照试验，即取低浓度的菌种接种于进行阳性试验用的对照容器中，与培养基模拟灌装试验在同一条件下进行培养。除了中国药典附录中规定的阳性菌，建议使用生产环境中常见的微生物，如枯草芽孢杆菌、白色念珠球菌，或者在同一生产环境中曾被检出过的菌种。接种量一般每个容器102以下，每个菌种接种2瓶，通常需均证实有菌生长，该培养基模拟灌装试验方有效。

如果试验中需要使用模拟分装用粉末，同样需要对模拟分装用粉末进行选择和质量控制。模拟分装用粉末的选择一般遵循以下原则：①可以在干粉状态下灭菌，灭菌后的无菌性达到药典规定的标准；②流动性较好，可以用分装机分装；

③可溶于液体培养基；④在模拟试验应用的浓度下无抑菌性。常用的模拟分装材料有乳糖、甘露醇、PEG6000、PEG8000等，也可以采用培养基干粉作为模拟分装用无菌粉末。

3.2.1.2模拟无菌生产工艺的操作过程

培养基模拟灌装试验中使用的内包装材料的清洗、灭菌，分装设备的清洗、消毒及与产品接触的分装设备部件的清洗、灭菌、安装过程均应遵循与实际生产操作相同的标准操作规程。培养基模拟灌装试验过程中应制订取样计划，对使用的内包装材料间隔一定数量后随机取样进行无菌性检查；同时，全部与产品接触的设备表面应无菌。某些特殊情况下，如胶塞具有抑菌性，则需要考虑更换采用其他相当的但无抑菌性的胶塞。

应当注意有足够数量的培养基与容器的内表面充分接触，灌装培养基时，每个容器的灌装体积一般为1/3-1/2之间，最多不能超过容器的85%。应注意，对于冻干粉针剂的验证试验，在培养基灌装半压塞后，只需模拟样品进入和移出冻干机的过程即可，而不必模拟冻干过程，以保证一旦有细菌，能够保持较好的生存能力。同时，还应模拟一些可能造成污染的操作步骤，如抽真空，充氮等步骤。

培养基模拟灌装试验应当尽可能模拟常规的无菌生产工艺，应当包括所有对无菌结果有影响的关键操作，包括生产中可能出现的各种干预和最差条件，各种干预和最差条件的考虑需要体现风险控制的理念。通常可能出现的各种干预和

除菌过滤系统的验证一般包括：微生物截留研究、析出物研究、化学兼容性研究和药液吸附研究。

3.2.2.1微生物截留研究

过滤器的微生物截留验证的目的：除菌过滤器微生物截留试验是通过模拟实际过滤工艺，过滤含有一定量生物指示菌的溶液，确认除菌过滤器的微生物截留能力。

过滤器的微生物截留验证的设计：

（1）挑战用微生物的选择

通常采用缺陷性假单胞菌作为挑战性试验用菌。在有些情况下，缺陷性假单胞菌可能不能代表最坏条件，则需要考虑采用其他细菌。如果使用其他细菌，应保证该细菌足够细小至足以挑战除菌级别滤器的截留性能，并能模拟产品中发现的最小微生物。应尽可能的进行微生物负荷的鉴别和量化研究，掌握所分离的微生物的形态学特征，为挑战性微生物的选择提供依据。

挑战性微生物的大小可以通过其可穿过0.45微米级别的滤膜来确证。通常情况下，标准培养条件下生长的缺陷性假单胞菌，在高挑战浓度（如≧107）时，能少量穿过0.45微米级别的滤膜。

（2）微生物截留试验条件

在试验室模拟生产工艺条件，将定量缺陷性假单胞菌加入到料液中，进行过滤。根据实际生产条件，考虑确定微生物截留试验的过滤时间及温度、压差、流速等。建议对实际生产的过滤工艺进行一次彻底评估，包括溶剂性质（例如水性

的、酸、碱、有机的）、过滤时间、工艺压差、工艺流速、工艺温度和过滤器设计规范，以便合理设计微生物截留试验条件。

过滤时间和压差会影响细菌截留试验的结果。在完整的生产时间进行微生物截留试验可以对那些与时间有关的因素进行评估，如过滤器兼容性，完整性的维持，时间依赖性的穿透等。

微生物截留试验过程中的压差应达到或超过实际生产过程的最大压差和/或最大流速（在过滤器制造商的设计规范内）。在验证过程中同时模拟压差和流速可能是不可能的。在设计挑战试验条件时过滤器的使用者应该确认哪个参数与特定工艺的相关性更高，以便为微生物截留试验条件的确定提供依据。

微生物截留验证研究应包括多个批次的滤膜（通常三个批次）。在用于微生物截留验证研究的三个批次的滤膜中，至少应有一个批次是进行预研究时或使用前物理完整性测试时的数值通过但是接近（例如，10％之内）过滤器生产商提供的合格规范限值的。（3）微生物截留验证研究中使用的过滤膜的物理完整性检测数值应包括在实验报告中。物理完整性检测应使用已有规范值的水、产品或其它润湿流体来进行测试，并在进行微生物挑战前完成。

如果微生物截留验证研究后，测试用微生物在任何过滤器的下游被检测到，那么就需要对此进行调查。如果调查确认测试用微生物能穿透完整性检测达标的过滤器，那么就应重新考虑此种过滤器在这些工作条件下的适用性。

需要关注的是，过滤器的重复使用通常是不被推荐的。如果需要重复使用除菌级过滤器，需要说明理由，重复使用的相关参数（如过滤量等）也需要经过严格的验证后确定相应的范围。

3.2.2.2析出物和释放物研究

20.化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 2005年颁布

指导原则编号： 【H】G P H 5-1 化学药物质量控制分析方法验证 技术指导原则 二○○五年三月

目 录 一、概述 (1) 二、方法验证的一般原则 (2) 三、方法验证涉及到的三个主要方面 (2) （一）需要验证的检测项目 (2) （二）分析方法 (3) （三）验证内容 (3) 四、方法验证的具体内容 (3) （一）专属性 (3) 1、鉴别反应 (4) 2、杂质检查 (4) 3、含量测定 (4) （二）线性 (5) （三）范围 (5) 1、含量测定 (6) 2、制剂含量均匀度 (6) 3、溶出度或释放度 (6) 4、杂质 (6) （四）准确度 (6) 1、含量测定 (7) 2、杂质定量试验 (7) （五）精密度 (7) 1、重复性 (8) 2、中间精密度 (8) 3、重现性 (8)

（六）检测限 (8) 1、直观法 (8) 2、信噪比法 (9) （七）定量限 (9) 1、直观法 (9) 2、信噪比法 (9) （八）耐用性 (10) （九）系统适用性试验 (10) 五、方法再验证 (11) 六、方法验证的评价 (12) （一）有关方法验证评价的一般考虑 (12) （二）方法验证的整体性和系统性 (12) 七、参考文献 (13) 八、著者 (13)

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 一、概述 保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价应遵循的基本原则，其中，对药品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。为达到控制质量的目的，需要多角度、多层面来控制药品质量，也就是说要对药物进行多个项目测试，来全面考察药品质量。一般地，每一测试项目可选用不同的分析方法，为使测试结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的科学性、准确性和可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法进行验证。 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能有效控制药品的内在质量。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。 方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用，并成为质量研究和质量控制的组成部分。只有经过验证的分析方法才能用于控制药品质量，因此方法验证是制订质量标准的基础。方法验证是药物研究过程中的重要内容。 本指导原则重点探讨方法验证的本质，将分析方法验证的要求与所要达到的目的结合起来进行系统和规律性的阐述，重点阐述如何科学合理地进行论证方案的设计。 本指导原则主要包括方法验证的一般原则、方法验证涉及的三个主要方

药品微生物检验替代方法验证指导原则

药品微生物检验替代方法验证指导原则 本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。 随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。 在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 微生物检验的类型及验证参数 药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。 由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。 表1 不同微生物检验类型验证参数 注： 尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。 进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么，验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。 替代方法验证的一般要求 在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含样品的情况下，替代方法

生物样品定量分析方法验证指导原则

9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
1. 范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。 应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。
2. 生物分析方法验证
2.1 分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质 替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液 中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和 分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质 不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结 果的偏差。
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无菌工艺验证指导原则

无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂） （征求意见稿） 国家食品药品监督管理总局 食品药品审核查验中心

二〇一六年十月 目录 1.目的 (1) 2.定义 (1) 3.范围 (1) 4.原则 (2) 5.无菌制剂生产工艺及模拟范围 (2) 6.模拟试验方案的设计及实施过程要求 (3) 6.1. 无菌工艺模拟试验的前提条件 (3) 6.2.基于风险的方案设计 (4) 6.3.模拟介质的选择与评价 (4) 6.4.灌装数量及模拟持续时间 (8) 6.5.容器装量 (9) 6.6. 模拟试验方法的选择 (9) 6.7. 最差条件的选择 (10) 6.8.干预 (12) 6.9.容器规格 (13) 6.10.培养与观察 (14) 6.11. 计数与数量平衡 (15) 6.12. 环境（包括人员）监控 (15) 6.13. 人员因素 (16) 6.14. 不同剂型应考虑的特殊因素 (16) 6.15. 方案的实施 (19) 7.可接受标准与结果评价 (20)

8.污染调查及纠正措施 (21) 9.模拟试验的周期与再验证 (21) 10.无菌工艺模拟试验的局限性 (212) 11.术语 (23) 12. 参考文献 (24)

无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂） 1.目的 为指导和规范无菌制剂生产企业开展无菌工艺模拟试验，充分评价无菌制剂产品生产过程的无菌保障水平，确保无菌制剂的安全性，依据《药品生产质量管理规范》（2010版）及附录，制定本指南。 2.定义 本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或其他介质，模拟制剂生产中无菌操作的全过程，评价该工艺无菌保障水平的一系列活动。 3.范围 3.1.本指南涵盖了无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的相应要求、试验的基本流程等内容，适用于无菌制剂的无菌工艺验证。 3.2.本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相 关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，进一步提高无菌制剂的无菌保障水平。 4.原则 在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，

药物非临床药代动力学研究技术指导原则

附件5 药物非临床药代动力学研究技术指导原则 一、概述 非临床药代动力学研究是通过体外和动物体内的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, 简称ADME）的过程和特征。 非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要 作用。在药物制剂学研究中，非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据。在药效学和毒理学评价中，药代动力学特征可进一步深入阐明药物作用机制，同时也是药效和毒理研究动物选择的依据之一；药物或活性代谢产物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据。在临床试验中，非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床试验给药方案提供有关参考信息。 本指导原则是供中药、天然药物和化学药物新药的非临床药代动力学研究的参考。研究者可根据不同药物的特点，参考本指导原则，科学合理地进行试验设计，并对试验结果进行综合评价。 本指导原则的主要内容包括进行药物非临床药代动力学研究的 基本原则、试验设计的总体要求、生物样品的测定方法、研究项目（血

药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性及转运体的影响）、数据处理与分析、结果与评价等，并对研究中其他一些需要关注的问题进行了分析。附录中描述了生物样品分析和放射性同位素标记技术的相关方法和要求，供研究者参考。 二、基本原则 进行非临床药代动力学研究，要遵循以下基本原则： （一）试验目的明确； （二）试验设计合理； （三）分析方法可靠； （四）所得参数全面，满足评价要求； （五）对试验结果进行综合分析与评价； （六）具体问题具体分析。 三、试验设计 （一）总体要求 1. 受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较

美国FDA药物分析程序及方法验证指导原则(中文版)

药品及生物制品的分析方法和方法验证指导原则 目录 1.介绍...................... (1) 2.背景..................... .. (2) 3.分析方法开发. ..................... . (3) 4.分析程序内容.............................................. ......... ..................................... .. 3 A.原则/范围 (4) B.仪器/设备............................................. . (4) C.操作参数.............................................. .. (4) D.试剂/标准............................................. . (4) E.样品制备.............................................. .. (4) F.标准对照品溶液的制备............................................ .. (5) G.步骤......... ....................................... (5) H.系统适应性..... (5) I.计算 (5) J.数据报告 (5) 5.参考标准和教材............................................ (6) 6分析方法验证用于新药，仿制药，生物制品和DMF (6) A.非药典分析方法............................................. (6) B.验证特征 (7) C.药典分析方法............................................. .. (8) 7.统计分析和模型 (8) A.统计 (8) B.模型 (8) 8.生命周期管理分析程序 (9) A.重新验证 (9) B.分析方法的可比性研究............................................ . (10) 1.另一种分析方法............................................... .. (10) 2.分析方法转移的研究 (11) C.报告上市后变更已批准的新药，仿制药，或生物制品 (11) 9.美国FDA方法验证............................................... . (12) 10.参考文献

9012生物样品定量分析方法验证指导原则

中国药典2015年版 9012生物样品定置分析方法验证 指导原则 一、范围 准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 G L P原则或GC P原则。 二、生物分析方法验证 (一）分析方法的完整验证 分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。 一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。 有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。 对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。 1.选择性 该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。应该使用至少6个受试者的适宜的空白基质来证明选择性（动物空白基质可以不同批次混 9012生物样品定量分析方法验证指导原则 合），它们被分别分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%,并低于内标响应的5%时，通常即可以接受0 应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。 2.残留 应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。 3.定量下限 定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的。 4.标准曲线 应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线。通过加人已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中研究的每种分析物和每一分析批，都应该有一条标准曲线。 在进行分析方法验证之前，最好应该了解预期的浓度范围。标准曲线范围应该尽量覆盖预期浓度范围，由定量下限和定量上限(校正标样的最髙浓度）来决定。该范围应该足够描述分析物的药动学。 应该使用至少6个校正浓度水平，不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质〉。每个校正标样可以被多次处理和分析。 应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。空白和零浓度样品结果不应参与计算标准曲线参数。 应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。 校正标样回算的浓度一般应该在标示值的:t l5%以内，定量下限处应该在±20%内。至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。如果某个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新评价，包括回归分析^ 最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以使用预先配制并储存的校正标样。 5.准确度 分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示为：（测得值/真实值)x l00?^应采用加人已知 ? 363

方法学验证指导原则

一、准确度 准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（％)表示。准确度应在规定的范围内测定。 1.化学药含量测定方法的准确度 原料药采用对照品进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。制剂可在处方量空白辅料中，加入已知量被测物对照品进行测定。如不能得到制剂辅料的全部组分，可向待测制剂中加人已知量的被测物对照品进行测定，或用所建立方法的测定结果与已知准确度的另一种方法测定结果进行比较。准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。 2.化学药杂质定量测定的准确度 可向原料药或制剂处方量空白辅料中加人已知量杂质进行测定。如不能得到杂质或降解产物对照品，可用所建立方法测定的结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的校正因子或不能测得对主成分的相对校正因子的情况下，可用不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量。应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％) 或面积比（％ )。 3.中药化学成分测定方法的准确度 可用对照品进行加样回收率测定，即向已知被测成分含量的供试品中再精密加人一定量的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。在加样回收试验中须注意对照品的加人量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。 回收率：％= (C - A ) /S X 100% 式中：A为供试品所含被测成分量；B 为加入对照品量； C 为实测值。 4.校正因子的准确度 对色谱方法而言，绝对（或定量）校正因子是指单位面积的色谱峰代表的待测物质的量。待测定物质与所选定的参照物质的绝对校正因子之比，即为相对校正因子。相对校正因子计算法常应用于化学药有关物质的测定、中药材及其复方制剂中多指标成分的测定。校正因子的表示方法很多，本指导原则中的校正因

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则(中文版)

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则 摘要： 几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）反应，抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。在人体内，抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。但是对于某些治疗性蛋白质，抗药抗体反应能引起各种临床的不良反应，包括温和事件及严重不良事件。临床前研究表明，抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构的注意。为了评估生物药物分子的免疫原性，以及将实验结果与临床事件联系起来，在临床前研究和临床研究中，很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法。这里方法学验证显得尤为重要，并且方法学验证是药物上市申请必不可少的。现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限，特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。因此，本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议。在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的性能验证。笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。这些建议被视为最佳的例子，旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检测方法。 1．简介： 生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达，比常规的小分子药物更大（一般大于1~3KD）。由于以上特性，生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。生物制药的免疫原性与产品的内在因素（种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂）、外在因素（给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量）、患者因素（自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法）相关。 抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状，包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征（例如，药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则【】HGPH 5-1指导原则编号: 化学药物质量控制分析方法验证 技术指导原则 二??四年十一月 目录 一、概 述 ..................................................................... ............................................ 1 二、方法验证的一般原 则 ..................................................................... ................ 2 三、方法验证涉及到的三个主要方 面 (2) ,一,需要验证的检测项 目 ..................................................................... . (2) ,二,分析方 法 ..................................................................... .. (3) ,三,验证内 容 ..................................................................... .......................... 3 四、方法验证的具体内 容 ..................................................................... . (3)

,一,专属 性 ..................................................................... (3) 1、鉴别反 应 ..................................................................... (3) 2、杂质检 查 ..................................................................... (4) 3、含量测 定 ..................................................................... (4) ,二,线 性 ..................................................................... . (5) ,三,范 围 ..................................................................... . (5) 1、含量测 定 ..................................................................... (5) 2、制剂含量均匀度...................................................................... (5)

灭菌无菌工艺验证指导原则

灭菌/无菌工艺验证指导原则（第二稿） 目录 1概述 (2) 2制剂湿热灭菌工艺 (3) 2.1湿热灭菌工艺的研究 (3) 2.1.1 湿热灭菌工艺的确定依据 (3) 2.1.2过度杀灭法的工艺研究 (5) 2.1.3残存概率法的工艺研究 (5) 2.2湿热灭菌工艺的验证 (7) 2.2.1物理确认 (7) 2.2.2 生物学确认 (9) 3制剂无菌生产工艺 (10) 3.1无菌生产工艺的研究 (10) 3.1.1无菌分装生产工艺的研究 (10) 3.1.2 过滤除菌生产工艺的研究 (11) 3.2 无菌生产工艺的验证 (12) 3.2.1培养基模拟灌装试验 (12) 3.2.2 除菌过滤系统的验证 (14) 4原料药无菌生产工艺 (17) 4.1 无菌原料药生产工艺特点 (18) 4.1.1 溶媒结晶工艺 (18) 4.1.2 冷冻干燥工艺 (19) 4.2 无菌原料药工艺验证 (19) 4.2.1 验证批量 (19) 4.2.2 最差条件 (19)

1概述 无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲，无菌药品应完全不含有任何活的微生物，但由于目前检验手段的局限性，绝对无菌的概念不能适用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌”。一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL）来表征。而这种概率意义上的无菌保证取决于合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及生产过程中严格的GMP管理。 无菌药品通常的灭菌方式可分为：1）湿热灭菌；2）干热灭菌；3）辐射灭菌；4）气体灭菌；5）除菌过滤。按工艺的不同分为最终灭菌工艺（sterilizing process）和无菌生产工艺（aseptic processing）。其中最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药品的方法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工艺。部分或全部工序采用无菌生产工艺的药品称为非最终灭菌无菌药品。基于无菌药品灭菌/除菌生产工艺的现状，本指导原则主要对在注射剂与无菌原料药的生产中比较常用的湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。本指导原则中的湿热灭菌工艺验证主要包括灭菌条件的筛选和研究，湿热灭菌的物理确认，生物指示剂确认等内容；无菌生产工艺验证主要包括无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、过滤系统的验证等验证内容。 最终灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大差异。最终灭菌无菌产品的无菌保证水平为残存微生物污染概率≤10-6，非最终灭菌无菌产品的无菌保证水平至少应达到95%置信限下的污染概率<0.1%。由此可见，非最终灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，为尽量减少非最终灭菌无菌产品污染微生物的概率，鼓励企业在生产中采用隔离舱等先进技术设备。 基于质量源于设计的药品研发与质量控制的理念，为保证无菌药品的无菌保证水平符合要求，研发者在产品的研发过程中应根据药品的特性选择合适的灭

有关物质分析方法验证技术指导原则

摘要：本文介绍了在对有关物质检查所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。 关键词：有关物质检查分析方法验证可接收标准 药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。由于这些有关物质的存在会影响到药品的纯度，进而可能会产生毒副作用，所以有关物质的控制是药品研发的一个重要方面，也是我们在药品审评中一直重点关注的要点之一。而要对有关物质进行严格的控制，就离不开专属性强、灵敏度高的分析方法，这就涉及到分析方法的筛选与验证。从现有的申报资料看，药品研发单位已基本上意识到分析方法验证的重要性，但是对验证时各具体指标是否可行尚没有一个明确的可接受标准，从而难以对验证结果进行评判。为解决这一问题，本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。 1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差

（RSD）。 该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。 2．线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。 3．精密度 1）重复性 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。 2）中间精密度 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。 4．专属性 可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则

指导原则编号： 【H】G P H 5 -1 化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 （第二稿） 二OO四年三月十九日

目录 一、概述 (4) 二、方法验证的一般原则 (5) 三、方法验证涉及到的三个要素 (5) 1、需要验证的检测项目 (5) 2、分析方法 (6) 3、验证内容 (7) 四、方法验证的具体内容 (7) （一）专属性 (7) 1、鉴别反应 (7) 2、杂质检查 (7) 3、含量测定 (8) （二）线性 (8) （三）范围 (9) 1、含量测定 (9) 2、制剂含量均匀度 (9) 3、溶出度或释放度 (9) 4、杂质 (10) （四）准确度 (10) 1、含量测定 (10) 2、杂质定量试验 (10)

（五）精密度 (11) 1、重复性 (11) 2、中间精密度 (12) 3、重现性 (12) （六）检测限 (12) 1、直观法 (12) 2、信噪比法 (12) （七）定量限 (13) 1、直观法 (13) 2、信噪比法 (13) （八）耐用性 (14) （九）系统适用性试验 (14) 五、方法再验证 (15) 六、方法验证的评价 (16) 1、有关方法验证评价的一般考虑 (16) 2、方法验证的整体性和系统性 (16) 七、参考文献 (17) 八、起草说明 (18) 九、著者 (20)

质量控制分析方法验证的技术指导原则 一、概述 保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价应遵循的基本原则，其中，对药品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。为达到控制质量的目的，需要多角度、多层面来控制产品质量，也就是说要对药物进行多个项目测试，来全面考察产品质量。一般地，每一测试项目可选用不同的分析方法，为使测试结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的科学性、准确性和可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法进行验证。 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能有效控制产品的内在质量。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法是否满足检测项目的要求。 方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用，并成为质量研究和质量控制的组成部分。只有经过验证的分析方法才能用于控制产品质量，因此方法验证是制订质量标准的基础。方法验证是药物研究过程中的重要内容。 本指导原则重点探讨方法验证的本质，将分析方法验证的要求与所要达到的目的结合起来进行系统和规律性的阐述，重点阐述如何科学合理地进行论证方案的设计。

药品质量标准分析方法验证指导原则样本

药品质量标准分析方法验证指导原则 《中国药典》 药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求。在建立药品质量标准时, 分析方法需经验证; 在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时, 则质量标准分析方法也需进行验证。方法验证理由、过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。生物制品质量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物学测定方法, 其中理化分析方法的验证原则与化学药品基本相同, 因此可参照本指导原则进行, 但在进行具体验证时还需要结合生物制品的特点考虑; 相对于理化分析方法而言, 生物学测定方法存在更多的影响因素, 因此本指导原则不涉及生物学测定方法验证的内容。 验证的分析项目有: 鉴别试验、限量或定量检查、原料药或制剂中有效成分含量测定, 以及制剂中其它成分( 如防腐剂等, 中药中其它残留物、添加剂等) 的测定。药品溶出度、释放度等检查中, 其溶出量等的测定方法也应进行必要验证。 验证指标有: 准确度、精密度( 包括重复性、中间精密度和重现性) 、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。在分析方法验证中, 须采用标准物质进行试验。由于分析方法具有各自的特点, 并随分析对象而变化, 因此需要视具体方法拟订验证的指标。表1中列出的分析项目和相应的验证指标可供参考。

一、准确度 准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度, 一般用回收率( ％) 表示。准确度应在规定的范围内测定。 1.化学药含量测定方法的准确度 原料药采用对照品进行测定,或用本法所得结果与已知准 确度的另一个方法测定的结果进行比较。制剂可在处方量空白辅料中, 加入已知量被测物对照品进行测定。如不能得到制剂辅料的全部组分, 可向待测制剂中加入已知量的被测物对照品进行测定, 或用所建立方法的测定结果与已知准确度的另一种方法测定结果进行比较。 准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。 2.化学药杂质定量测定的准确度 可向原料药或制剂处方量空白辅料中加入已知量杂质进行测定。如不能得到杂质或降解产物对照品, 可用所建立方法测定的结果与另一成熟的方法进行比较, 如药典标准方法或经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的校正因子或不能测得对主成分的相对校正因子的情况下, 可用不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量。应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比( ％) 或面积比( ％) 。 3.中药化学成分测定方法的准确度

同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则

同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则（2019年修订） （征求意见稿） 一、前言 同种异体植入性医疗器械是以同种来源组织为原料经加工或组成的产品。 我国目前对同种异体植入性医疗器械产品组织供体的病毒筛选多采用检测血清中病毒特异性抗体或抗原的方法，其中对人免疫缺陷病毒（HIV）还要求检测血清中的病毒核酸。但是，尽管对供体进行了严格的筛选，仍然存在漏检和未知病毒污染的风险，以及生产过程中带入外源病毒的风险。因此，要求同种异体植入性医疗器械产品在生产过程中采用有效的病毒灭活工艺，并对病毒灭活工艺的有效性进行科学的验证。 本指导原则是对同种异体植入性医疗器械生产过程中特定病毒灭活工艺的效果进行验证的一般要求，申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充实和细化，如采用的病毒灭活工艺及相关参数等，并依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用。 本指导原则是对申请人和审评人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导

原则相关内容也将进行适时的调整。 本指导原则为2011年发布的《同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则》的修订版。主要修订内容包括：修改指导原则中相关语言描述；完善指示病毒类型及举例的相关描述；调整病毒灭活/去除有效性验证的原则。 二、适用范围 本指导原则适用于需要对生产过程中特定病毒灭活工艺的效果进行验证的同种异体植入性医疗器械。 三、基本要求 （一）常用的病毒灭活方法 同种异体植入性医疗器械的病毒灭活有多种方法，企业应根据产品的特性选择合适的病毒灭活工艺。采用病毒灭活工艺应综合考虑以下问题，包括病毒灭活效果的验证；病毒灭活工艺对产品性能的影响；病毒灭活工艺本身的公认性、可靠性、重现性、易放大性及经济性。常用的病毒灭活方法举例如下： 1.巴斯德消毒法（巴氏消毒法） 巴氏消毒法是湿热灭活法之一，是国内外公认的病毒灭活方法。该灭活方法可灭活脂包膜和部分非脂包膜病毒。同种异体植入性医疗器械在充分清洗血液及骨髓成分后，可运用该方法进行病毒灭活。采用该方法时应考虑温度分布的均一性和灭活时间。 2.干热灭活法 干热灭活法主要用于冻干制品的病毒灭活。该方法的病毒灭活效果已为实验室验证和临床应用所肯定，可灭活HIV、乙型肝炎病毒

分析方法确认指导原则

分析方法确认指导原则 分析方法确认（analytical method verification）是指首次使用法定分析方法时，由现有的分析人员对分析方法中关键的验证指标进行有选择性的考察，以证明方法对所分析样品的适用性，同时证明分析人员有能力使用该法定分析方法。《分析方法验证指导原则》中提供了建立分析方法需要验证的指标，分析方法的确认并不是重复验证过程。本指导原则不涉及微生物分析方法的确认。 一、确认过程（verification process） 分析方法的确认过程，是指应用法定方法对药物及其制剂进行测定时，评价该方法能否达到预期的分析目的。 分析人员应具备一定的药物分析经验和知识，经培训后能够理解和执行法定方法。分析方法确认应当由上述分析人员开展，以确保法定方法能够按预期顺利实施。 如果法定方法确认失败，并且相关工作人员（或起草人员）未能协助解决失败的问题，也可能是该方法不适用于在该实验室测定待分析的样品。 二、确认要求（verification requirements） 1. 确认原则 分析方法确认无需对法定方法进行完整的再验证，但是需要将《分析方法验证指导原则》表1中列出的分析方法验证的指标用于方法的确认。分析方法确认的范围和需验证的指标取决于实验人员的培训和经验水平、分析方法种类、相关设备或仪器、具体的操作步骤和分析对象等。分析方法确认需验证的指标和检验项目(鉴别、杂质分析、含量测定等)有关，不同的检验项目，方法确认所需验证的指标也不同。 2. 考察指标 分析方法确认应包含对影响方法的必要因素的评估。对于化学药，方法确认应考虑原料药的合成路线和制剂的生产工艺等因素；对于中药，方法确认应考虑中药材种类、来源、饮片制法和制剂的生产工艺等因素，从而评价法定方法是否适用于原料药和制剂基质。 在原料药和制剂含量测定时，方法专属性是确认法定分析方法是否适用的关

生物样品分析方法验证指导原则- 欧洲

European Medicines Agency 7 Westferry Circus, Canary Wharf, London, E14 4HB, UK 1 2 3 London, 19 November 2009 Doc. Ref: EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE 4 (CHMP) 5 6 DRAFT GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 7 8 DRAFT AGREED BY THE EFFICACY WORKING PARTY September 2009 ADOPTION BY CHMP FOR RELEASE FOR CONSULTATION 19 November 2009 END OF CONSULTATION (DEADLINE FOR COMMENTS) 31 May 2010 9 Comments should be provided using this template to EWPSecretariat@emea.europa.eu 10 KEYWORDS CHMP, EMEA, Guideline, validation, bioanalytical method, analyses

GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 TABLE OF CONTENTS 1.INTRODUCTION (BACKGROUND) (3) 2.SCOPE (3) 3.LEGAL BASIS (3) 4.METHOD VALIDATION (4) 4.1C OMPLETE VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD (4) 4.1.1Selectivity (4) 4.1.2Carry-over (5) 4.1.3Lower limit of quantitation (5) 4.1.4Calibration curve (5) 4.1.5Accuracy (6) 4.1.6Precision (7) 4.1.7Dilution integrity (7) 4.1.8Matrix effect (7) 4.1.9Stability (8) 4.2P ARTIAL VALIDATION (9) 4.3C ROSS VALIDATION (9) 4.4L IGAND-BINDING ASSAYS (9) 5.ANALYSIS OF STUDY SAMPLES (10) 5.1A NALYTICAL RUN (11) 5.2A CCEPTANCE CRITERIA OF AN ANALYTICAL RUN (11) 5.3C ALIBRATION RANGE (12) 5.4R EANALYSIS OF STUDY SAMPLES (12) 5.5I NTEGRATION (13) 6.INCURRED SAMPLES REANALYSIS (13) 7.STUDY REPORT (13) DEFINITIONS (16)