ncbi普通pcr设计步骤

ncbi普通pcr设计步骤

一、引言

PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应，是一种常用的分子生物学技术，可用于从DNA样本中扩增特定的片段。NCBI （National Center for Biotechnology Information）是一个重要的生物信息学数据库，提供了大量的序列数据和相关工具。本文将介绍使用NCBI进行普通PCR设计的步骤。

二、目标序列的获取

在进行PCR实验前，首先需要获得目标序列的信息。可以通过NCBI 的数据库检索功能，根据目标基因或序列的名称进行搜索。找到目标序列后，记录其基因名、Accession号或序列的FASTA格式。

三、引物设计

1. 打开NCBI的Primer-BLAST工具，将目标序列粘贴到查询序列框中。

2. 设置引物设计的参数，包括引物长度、Tm值、引物间的距离等。根据实验需要，可对参数进行调整。

3. 点击“Design Primers”按钮，即可得到推荐的引物序列和其相关信息。

4. 根据实验需求和引物的特性，选择合适的引物序列进行进一步实验。

四、引物评估

在设计引物后，需要对其进行评估，以确保其适用于PCR实验。1. 使用NCBI的Primer-BLAST工具，将设计好的引物序列粘贴到查询引物框中。

2. 点击“Primer-BLAST”按钮，即可得到引物的评估结果。

3. 根据评估结果，判断引物的特异性和互补性等指标是否满足实验需求。

4. 若引物不理想，可对引物序列进行调整和优化，重新进行评估。

五、PCR体系的准备

在进行PCR实验前，需要准备PCR体系，包括引物、模板DNA、酶和缓冲液等。

1. 根据PCR反应的体积，计算所需的试剂量，包括引物的浓度和模板DNA的体积等。

2. 在无菌条件下，将所需试剂按照计算的比例加入PCR反应管中。

3. 轻轻混匀反应液，避免气泡的产生。

六、PCR条件的设置

PCR实验需要根据目标序列和引物的特性，设置合适的PCR条件。

1. 设置PCR反应的温度梯度，包括变性、退火和延伸的温度。

2. 设置PCR反应的时间，包括变性、退火和延伸的时间。

3. 根据实验需求，设置PCR反应的循环次数。

4. 若需要，可添加PCR增效剂或其他辅助试剂，以提高PCR反应的

效率和特异性。

七、PCR实验的进行

1. 将PCR反应管放入PCR仪中，开始PCR反应。

2. 监测PCR反应的过程，包括温度变化和反应管内的液体状态。

3. 根据实验需求，调整PCR反应的条件和时间。

八、PCR产物的分析

1. 将PCR反应产物进行电泳，以分析扩增结果。

2. 准备电泳仪和琼脂糖凝胶，将PCR产物和DNA标记物加入孔中。

3. 开启电泳仪，设置电压和电泳时间，进行电泳分离。

4. 观察电泳结果，判断PCR反应是否成功，目标片段是否扩增。

九、结果分析与验证

1. 分析电泳结果，判断目标片段是否得到扩增。

2. 若PCR反应成功，可以进行序列分析，验证目标片段的序列准确性。

3. 根据实验需求，可进行进一步的克隆、测序或其他实验。

结论

本文介绍了使用NCBI进行普通PCR设计的步骤，包括目标序列的获取、引物设计、引物评估、PCR体系的准备、PCR条件的设置、PCR 实验的进行和PCR产物的分析等。通过合理的设计和实验操作，可以获得所需的PCR产物，为后续的分子生物学研究提供基础数据。

在实验过程中，需要注意选择合适的引物和优化PCR条件，以提高PCR反应的特异性和效率。

引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计

PCR引物设计流程 （以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例） 一．流程图 二．确定模板 1.确定模板来源物种 近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等 常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼） 一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。 2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列 A.进入NCBI主页https://www.sodocs.net/doc/bf19140450.html,/，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到 如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。

B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq 条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考https://www.sodocs.net/doc/bf19140450.html,/refseq/about/。 C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同 一异构体（一般选择最长的异构体）。 D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions， transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。 E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设置 为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。 3.整理下载的模板序列

引物设计步骤与要点

引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。

PCR的基本步骤及注意

DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在 于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应 用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高 温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 --引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对 与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延 伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 编辑本段[PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl

PCR引物设计

一.聚合酶链式反应 （一）聚合酶链式反应基本原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）用于扩增位于两段已知序列之间的DNA 区段。在PCR反应中使 用了两段寡核苷酸作为反应的引物。PCR反应分为三步：① 变性，通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单 链DNA。②退火，当温度突然降低时，由于模板分子结构较 引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板 DNA ,一般要求引物：模板=108到1:1 ③延伸:在DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件 下，５’→ 3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸 反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一 个循环的模板，数小时后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达2×10６－７拷贝。 （二）PCR反应的组分和作用 1.缓冲液: 10—50mmol/L Tris.HCl 2.dNTP: 母液：10mmol/L dNTP, 终浓度200umol/L 3.酶：Klenow酶（0.5-5.0u） Taq 酶, Pfu, Tth, Tfl 4. 引物：引物浓度一般为：0.1-0.5umol/L (三) PCR反应条件的优化 1.Mg2+浓度: 0.5mmol/L 到 5mmol/L

2．退火温度: Tm=4(G+C)+2(A+T) Tm-5℃ 3.循环数再扩增 一般在30—35个 cyeles 再扩增时需将模板稀释104—105 4.热启动（hot start） （四）引物的设计 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置，以及扩增区域的Tm值,Tm值和扩增物产量和特异性有关。 1.引物设计的一般原则： A.引物长度：一般要求 18-30个碱基 小于15个碱基:随机引物（6个碱基）、武断引物 若额外的序列信息要加到引物中，例如T７RNA聚合酶结合位点，限制酶切位点，可以使用加长的引物。一般来说，引物5′端添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低温度的条件下进行4到5个扩增循环，然后在假定引物5′端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。 B.引物的末端核苷酸： 3′末端对于控制错误引发非常关键。 ※3′末端的碱基要尽量与模板互补配对，尽量避免错配。 ※避免3′端引物与引物之间的互补配对，形成引物二聚体。 C.GC的合理含量和Tm 值：

NCBI引物设计方法

Primer-Blast介绍 Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST 可以直接从Blast主页（https://www.sodocs.net/doc/bf19140450.html,/）找到，或是直接用下面的链接进入： https://www.sodocs.net/doc/bf19140450.html,/tools/primer-blast/ 这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。 Primer-BLAST的输入 Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟 其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。 模板（Template） 在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。 引物（Primers） 如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。 特异性（Specificity） 在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比 较重要的。这里提供了4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。 前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种：human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。 实例分析

引物设计的详细步骤

一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm 窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 ②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小些，最好不要超过9。 ③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 ④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以

引物设计的详细步骤

引物设计的详细步骤 详细步骤如下： 步骤一：了解引物设计的基本原理 引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。 步骤二：确定PCR反应的目标序列 在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。确定目标序列后，我们可以继续设计引物。 步骤三：确定引物的一些基本参数 在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。 引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。 GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。 Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。

避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性 以及避免引物形成二聚体。引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体， 从而降低PCR反应的效率和特异性。 步骤四：选择合适的引物设计工具 目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择 合适的引物。此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。 步骤五：进行引物特异性分析 设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标 序列而不扩增其他非特异性产物。这可以通过BLAST或其他相似性工具来 完成。特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。 步骤六：合成和测试引物 在确定引物的特异性后，我们可以选择合成引物并进行实验室测试。 在PCR反应中使用合成的引物，检测扩增产物的特异性和效率，并进行优 化调整。 总结： 引物设计是PCR实验中至关重要的一步。通过了解引物设计的基本原理，确定PCR反应的目标序列和一些基本参数，选择合适的引物设计工具，进行引物的特异性分析，最后合成和测试引物，我们可以设计出合适的引物，从而实现对目标DNA序列的扩增。

pcr的基本步骤

pcr的基本步骤 PCR的基本步骤 PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增DNA片段，从而使得DNA的检测和分析变得更加容易。PCR的基本步骤包括：DNA模板的制备、引物的设计、PCR反应体系的构建、PCR反应的进行和PCR产物的分析。 1. DNA模板的制备 PCR反应需要一定数量的DNA模板，这个模板可以是从细胞中提取的DNA，也可以是已经纯化的DNA。DNA的提取和纯化需要特定的实验步骤，这里不再赘述。 2. 引物的设计 引物是PCR反应中的关键因素，它们是用来扩增DNA片段的短链DNA分子。引物的设计需要考虑到PCR反应的特点，如引物的长度、GC含量、Tm值等。引物的设计可以使用在线工具或手动设计，但需要注意引物的特异性和避免引物间的二聚体形成。 3. PCR反应体系的构建 PCR反应体系包括PCR反应缓冲液、DNA模板、引物、dNTPs和聚合酶等。PCR反应缓冲液中含有特定的离子浓度和pH值，可以提供适宜的反应环境。dNTPs是四种脱氧核苷酸，它们是PCR反应

中的原料。聚合酶是PCR反应中的关键酶，它可以在适宜的温度下扩增DNA片段。 4. PCR反应的进行 PCR反应的进行需要特定的温度和时间，一般包括三个步骤：变性、退火和延伸。变性是将DNA双链分离为单链，需要高温（95℃）进行。退火是将引物与DNA模板结合，需要适宜的温度（一般为50-60℃）进行。延伸是聚合酶在引物的作用下合成新的DNA链，需要适宜的温度（一般为72℃）进行。 5. PCR产物的分析 PCR反应产生的产物可以通过凝胶电泳、测序等方法进行分析。凝胶电泳可以将PCR产物按照大小分离出来，从而判断PCR反应是否成功。测序可以对PCR产物进行精确的序列分析，从而确定PCR扩增的DNA片段的序列。 PCR是一种重要的分子生物学技术，它可以在短时间内扩增DNA 片段，从而使得DNA的检测和分析变得更加容易。PCR的基本步骤包括DNA模板的制备、引物的设计、PCR反应体系的构建、PCR反应的进行和PCR产物的分析。在进行PCR反应时，需要注意引物的设计和PCR反应体系的构建，以保证PCR反应的特异性和稳定性。

pcr技术的原理和步骤

pcr技术的原理和步骤 PCR技术的原理和步骤 PCR技术是一种基于DNA复制的技术，可以在短时间内扩增DNA 序列，从而使得微量的DNA样本也能够被检测到。PCR技术的原理和步骤如下： 一、PCR技术的原理 PCR技术的原理是利用DNA聚合酶（DNA polymerase）在一定条件下，对DNA进行连续的复制，从而扩增DNA序列。PCR技术的核心是DNA的复制，而DNA的复制需要三个基本元素：DNA模板、DNA聚合酶和引物（primers）。 DNA模板是PCR反应中的原始DNA序列，DNA聚合酶是一种酶类，能够在一定条件下将DNA模板复制成新的DNA序列，引物是一种短的DNA序列，能够在DNA模板上定位并启动DNA聚合酶的复制作用。 PCR技术的步骤 二、PCR技术的步骤 PCR技术的步骤主要包括：DNA模板的制备、引物的设计、PCR 反应体系的构建、PCR反应的条件和PCR产物的检测等。

1. DNA模板的制备 DNA模板的制备是PCR反应的第一步，DNA模板可以来源于各种生物样本，如血液、组织、唾液等。DNA模板的制备需要先将生物样本进行裂解，使得DNA能够被释放出来，然后通过离心等方法将DNA分离出来。 2. 引物的设计 引物是PCR反应中的关键因素之一，引物的设计需要根据所需扩增的DNA序列进行设计。引物的长度一般在20-30个碱基对之间，引物的GC含量应该在40%-60%之间，引物的两端应该含有一定的碱基序列，以便于引物与DNA模板的结合。 3. PCR反应体系的构建 PCR反应体系的构建需要将DNA模板、引物、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等反应物混合在一起，构建出PCR反应的体系。PCR 反应体系的构建需要注意反应物的浓度、pH值、离子强度等因素，以保证PCR反应的稳定性和可靠性。 4. PCR反应的条件 PCR反应的条件包括PCR反应的温度、时间和循环次数等。PCR 反应的温度一般分为三个阶段：变性、退火和延伸。变性阶段的温

PCR的实验步骤

PCR的实验步骤 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种用于复 制DNA片段的分子生物学技术。它能够在体外迅速扩增特定的DNA序列， 从而产生大量的目标DNA。PCR技术包括三个主要的步骤：变性、退火和 延伸。 1.设计引物 PCR的第一步是设计引物。引物是短的DNA片段，能够与目标DNA序 列的两个相邻区域配对，并为DNA聚合酶提供一个起始点。引物在PCR中 起到了不可或缺的作用，因为它们决定了所扩增的DNA片段的大小和序列。 2.变性 PCR的第二步是变性。在这一步中，反应混合物的温度被升高到94- 98摄氏度，以使被扩增DNA序列的双链结构解开，变为单链的模板DNA。 这一步通常需要较高的温度，以确保DNA的完全解链。 3.退火 在变性后，引物从溶液中结合到目标DNA的同系列上。PCR反应混合 物的温度会被降低到50-65摄氏度，以使引物与模板DNA结合。引物必须 在此温度下结合到模板DNA，以便聚合酶能够开始复制DNA。 4.延伸 延伸是PCR的最后一步。在此步骤中，反应混合物的温度被升高到 72摄氏度，以使DNA聚合酶能够在引物的引导下合成目标DNA的新链。 该温度是DNA聚合酶的最佳活动温度。在每个PCR周期中，DNA聚合酶通

过将新的核苷酸加入到模板DNA上的3'-OH端开始复制。此过程持续进行，直到达到所需的扩增循环数。 5.循环 PCR通常会进行多个循环，以便在每个循环中复制和产生更多的DNA。每个PCR循环包括变性、退火和延伸的完整步骤。每个PCR周期的循环数 取决于所需的DNA扩增量。 6.结束 一旦PCR循环完成，PCR反应混合物中将会生成大量的目标DNA。最后，反应混合物被冷却到4摄氏度，以停止任何酶活性的进一步延伸。 总结： PCR是一种能够快速扩增目标DNA序列的技术。它通过变性、退火和 延伸的循环步骤，能够在体外复制DNA片段。设计合适的引物是PCR成功 的关键。PCR技术广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪科学等领域，对 科学研究和医学诊断都具有重要意义。

pcr技术的原理和步骤

pcr技术的原理和步骤 一、前言 PCR技术（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在 分子生物学领域中广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增DNA片段，从而使其数量呈指数级增长。PCR技术的原理和步骤对于分子生物学 研究者来说非常重要。 二、PCR技术的原理 PCR技术的原理是利用DNA聚合酶，在高温条件下将DNA模板复制成多个同样的DNA片段。PCR反应需要三个主要组分：模板DNA、引物和聚合酶。 1. 引物 引物是一小段单链DNA序列，它与待扩增的目标序列互补配对，可以作为起始点启动扩增反应。通常需要设计两个引物，一个称为前向引 物（Forward primer），另一个称为反向引物（Reverse primer）。它们分别位于待扩增序列的两端，并且是互补配对的。当这两个引物 结合到待扩增序列上时，就形成了一个完整的PCR模板。 2. 聚合酶 聚合酶是一种特殊类型的酶，在高温条件下能够读取DNA模板并将新

核苷酸加入正在生长中的新链中。聚合酶的最常用类型是Taq聚合酶，它来源于一种热喜好性细菌，可以在高温下保持稳定。 3. PCR反应步骤 PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。 （1）变性 PCR反应开始时，将PCR管中的混合物加热到95℃，使DNA双链分离成两条单链。这个过程称为变性。此时，模板DNA和引物都变成了单链状态。 （2）退火 然后将温度降低到50-60℃，引物与模板DNA序列互补配对并结合在一起。这个过程称为退火。 （3）延伸 最后将温度升高到72℃，Taq聚合酶开始读取模板DNA，并在每个 引物的末端加入新核苷酸以扩增新链。这个过程称为延伸。每次循环后，扩增产物数量都会呈指数级增长。 三、PCR技术的步骤 PCR技术的步骤主要包括以下几个方面：

【设计】NCBI引物设计方法

【关键字】设计 Primer-Blast介绍 Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST 可以直接从Blast主页（https://www.sodocs.net/doc/bf19140450.html,/）找到，或是直接用下面的链接进入： https://www.sodocs.net/doc/bf19140450.html,/tools/primer-blast/ 这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体 基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression （注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。 Primer-BLAST的输入 Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。 模板（Template） 在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输 入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。 引物（Primers） 如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入 你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。 特异性（Specificity） 在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比 较重要的。这里提供了4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。 前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参照序列作为模板和参照序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可 以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种：human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。

实验四_PCR引物设计

实验四设计PCR引物 一、实验目的 学习引物设计软件PrimerPremier5的基本使用方法。 二、PCR引物设计原理与参数要求 引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增产物，在EB 染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。 ①引物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。 总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。 ②引物的二级结构：包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。 对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。 引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。 ③引物GC含量和Tm值：PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。

手把手教你做PCR引物设计来自小木虫

PCR引物设计的黄金法则 1。引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应. 3。引物GC含量在40％~60％之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5～10℃.若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm 为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5。引物3′端不能选择A，最好选择T. 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T 之间，所以3′端最好选择T。 6。碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7。引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成.引物之间不能有连续4个碱基的互补. 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过

荧光定量PCR实验指南设计(一)

荧光定量PCR实验指南〔一〕 一、根本步骤： 1、目的基因〔DNA和mRNA〕的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反响体系的配制； 5、反响条件的设定； 6、反响体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因〔DNA和mRNA〕的查找和比对； 从https://www.sodocs.net/doc/bf19140450.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save〞，保存格式为“.txt〞文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file〞菜单中的“import〞，打开后点击“save〞，保存为“.seq〞文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file〞菜单中的“open entrez sequence〞，导入后保存为“.seq〞文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进展排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence〞菜单中的“add〞，选择要比拟的“.seq〞的所有文件，点击“add〞或“add all〞，然后点击“Done〞导入要比拟的序列，再点击“assemble〞进展比拟。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比拟序列的

开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，假如想全部放在一组中进展比拟，就调整“project〞菜单下的“parameter〞，在“assembling〞的“minimum math percentage〞默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig〞菜单下的“reassemble contig〞即可。选择上下的原如此是在保证所分析的序列在一个“contig〞的前提下，尽量提高“minimum math percentage〞的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig〞的序列的排列进展修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save〞保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 细心地进展引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 防止引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 防止引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；