淋巴细胞分离

淋巴细胞分离与计数

淋巴细胞分离

原理：

外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

实验材料：

淋巴细胞分离液

肝素

稀释液（生理盐水）

RPMI1640粉末

实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜

操作流程：

1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加

0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝

3.稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混

匀）

4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清

楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2）

5.放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）

6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上

体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。

7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。

8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞

9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度.

10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个

大方格内的细胞总数。

单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝

4个大方格内细胞总数

──────────×10４×2(稀释倍数)

4

11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。

注意事项:

1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞

2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释

3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果

4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面

5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污

染

淋巴细胞计数：

实验流程：

1.准备计数板：

2.制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液

3.加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的

一侧加微量细胞悬液，

4.计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数

5.计算：将结果代入下式，得出细胞密度

胞数/毫升原

=（4大格细胞数之和/4）×104

注意事项：

1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液

2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡

3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右

4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml

5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、

计数

人周血淋巴细胞分离液技术要求

人外周血淋巴细胞分离液产品技术要求 3.1 产品规格及其划分说明 250ml/瓶、500ml/瓶、 3.2 性能指标 3.2.1 外观 乳光或微乳光液体。 3.2.2 澄清度 比重1.077 –1.080 g/mL 3.2.3 pH值（每升标示量/L） pH要求为7.1～7.3，允许偏差范围为±0.30。 3.2.4 渗透压/（m0sm/kgH2O） 渗透压为280～340 m0sm/kgH2O 3.2.5 细菌内毒素/（EU/ml） ﹤0.5 3.2.6 无菌检查 3.2.6.1 细菌数 不得检出 3.2.6.2霉菌数 不得检出 3.2.7 细胞分离实验 3.2.7.1 细胞形态 正常。 3.2.7.2细胞分离数量及存活率 数量：90%-95%；存活率：95%-98% 3.2.8 安全性检验项目 抗生素：不得检出。 3.3 检验方法 3.3.1外观检测方法 肉眼观察为乳光或微乳光液体 3.3.2 澄清度的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。 3.3.3 pH值的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅥH进行。 3.3.4 渗透压的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨG进行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5℅。 3.3.5 细菌内毒素的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。 3.3.6 无菌检查 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪH无菌检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检测法采用平皿法。

3.3.7 人周边血淋巴细胞分离计数及存活率检测实验 3.3.7.1 人周边血细胞分离实验 3.3.7.1.1方法提要 1）本实验所用容器具及溶液均为无菌，实验操作过程均为无菌操作。 2）分离外周血，并计数分离所得细胞及细胞存活率 3.3.7.1.2 实验试剂和材料 1）人外周血：新鲜血5ml(加肝素抗凝20u/ml) 2）分离液：本产品样品 3）1640无血清培养液 4）10%NCS 5）3%冰醋酸 6）台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒 3.3.7.1.3 仪器 1）医用超级洁净工作台：洁净级别为百级。 2）二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5±0.1）℅，能在（37±1）℃恒温。 3）细胞培养瓶：T25型、无菌。 4）玻璃试管 5）血球计数板 6）盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。 7）水平离心机 3.3.7.1.4 实验步骤 1）分离人周血淋巴细胞 A 新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释 B 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些） C 小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。 D 离心： 转速：1500/分 温度：20℃－28℃ 时间：20分钟 （注意：不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大) E取出试管，看看是不是分为好几层,顺次为血浆---单个核细胞淋巴细胞层－－分离液－－红细胞 F用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，备用 G用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）H离心。转速：2000－2300r/min （转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开) 时间：10分钟 温度：4℃ I震荡后，用培养液重悬至1ml J 取100ul重悬液放于96孔板中留着计数用，然后将剩余细胞悬液在离心机上离心 2）计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16

淋巴细胞分离液说明书

Lonza Walkersville, Inc. https://www.sodocs.net/doc/c34784744.html, biotechserv@https://www.sodocs.net/doc/c34784744.html, Tech Service: 800-521-0390 Document # INST-17-829-1 06/07 Walkersville, MD 21793-0127 USA ? 2007 Lonza Walkersville, Inc. Lymphocyte Separation Medium Instruction For Use 17-829E Introduction Lymphocyte Separation Medium (LSM) is a mixture of Ficoll? and sodium diatrizoate (Hypaque) with density adjusted to 1.077 g/ml. This sterile filtered product is intended for laboratory/manufacturing use, and is not for in vitro diagnostic use. It is commonly used to isolate lymphocytes from human blood. One protocol to accomplish this is presented here. Protocol 1. Anticoagulated blood (citrated or heparinized) should be used. Note: Always treat human and other primate source material as potentially infectious and take safety precautions. 2. Dilute blood 1:1 with calcium-magnesium-free PBS and layer 9 ml onto 6 ml LSM. Use a clear plastic centrifuge tube with a cap. For large volumes use a similar ratio of diluted blood to LSM. 3. Centrifuge at 400xg for 15 minutes. 4. Remove plasma-PBS without disturbing the interface. 5. Collect the interface with a cannula and dilute to 20 ml in serum-free medium, such as RPMI 1640. 6. Centrifuge at 70xg for 10 minutes. 7. Discard supernatant fluid and resuspend pellet in 2-3 ml serum-free medium. 8. Count nucleated cells on a hemocytometer or electronic counting device. 9. Lymphocytes will be concentrated at the interface, along with some platelets and monocytes. Granulocytes will be found mostly in the Lymphocyte Separation Medium and erythrocytes will pellet at the bottom of the tube. References 1. Boyum, A. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89. 2. Boyum, A. 1976. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 5:9-15. 3. Boyum, A. 1977. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology. 10-2:71-6. 4. Boyum, A. 1984. Separation of lymphocytes, granulocytes and monocytes from human blood using iodinated density gradient media. Methods Enzymol. 108:88-102. 5. Boyum, A. et al. 2002. Separation of Human Lymphocytes from Citrated Blood by Density Gradient (NycoPrep) Centrifugation: Monocyte Depletion Depending upon Activation of Membrane Potassium Channels. Scand. J. Immunol. 56-1:76-84. 6. Koistinen, P. 198 7. Human peripheral blood and bone marrow cell separation using density gradient centrifugation on Lymphoprep and Percoll in haematological diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 47-7:709-14. 7. Rola-Pleszczynski, M. and W.H. Churchill. 1978. Purification of human monocytes by continuous gradient sedimentation in ficoll. J. Immunol. Methods. 20:255-62. Product Use Statement THESE PRODUCTS ARE FOR RESEARCH USE ONLY. Not approved for human or veterinary use, for application to humans or animals, or for use in clinical or in vitro procedures. INST-17-829-1 06/07 Ficoll is a trademark of GE Healthcare. All other trademarks herein are marks of Lonza Group or its subsidiaries. 1

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下： 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书 【实验前准备】A ．适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml ）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注： 根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。

4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。 6.250g，离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 【参考值（参考范围）】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 （4.0-10.0）×109 含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞

T淋巴细胞提取

淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示

6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。

动物组织淋巴细胞分离液使用说明

动物组织淋巴细胞分离液使用说明 规格：4×200mL/kit 保存：18-25℃保存，有效期2年。动物组织淋巴细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后置于常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 试剂盒内容： 样本稀释液200mL 清洗液200mL 动物组织淋巴细胞分离液200mL F液200mL 操作步骤： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。 1.首先制备组织单细胞悬液。 2.取一支15ml离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g，离心20-30min。（注：根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液，混匀细胞。 6.250g，离心10min。

7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 注意事项： 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。

小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。

各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注意事项：

各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注 意事项： 各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注意事项: 本品为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液。主要成分是Ficoll 400与泛影酸葡甲胺。适用于从血液及组织匀浆中(小牛血清或人血清悬起匀浆的细胞 1X107/ml)分离所需细胞，在医疗和医学生 物中广泛应用。 其他人及动物多种比重细胞分离液。注:因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，所以用户在定制分离液时应提供所需分离液的比重、动物的种属及被分离细胞的名称。 使用方法 例:取新鲜抗凝血1ml，与全血及组织匀浆稀释液(LOT#:2010C1119)液1:1 混匀后，小心加 于2ml的细胞分离液之液面上，以1500-2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟，此时离心 管中由上至下细胞分四层。第一层;为血浆或组织匀浆液层。第二层;为环状乳白色淋巴细胞。 第三层;为透明分离液层。第四层;为红细胞层，收集第二层细胞放入含细胞洗涤液 (LOT#:2010X1118)4-5毫升的试管中，充分混匀后，以1500-2000转/分离心10-30分钟。沉 淀经反复洗2次即得所需细胞。(此方法效果较好，推荐使用) 注意事项

1. 启封后应置4?保存避免微生物的污染。 2. 细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待 溶液温度升至室温时，摇匀后使用。 3. 整个分离过程中，温度应控制在18-28?且在无菌环境 下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量。 应用 -从动物血液及组织中分离所需细胞 特点 -密度变化率依照Ficoll 400，泛影酸和氢氧化钠. -最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签 -生理学参数 -在低粘度时高密度 -无菌-即用型-溶液 产品规格 溶液水 PH 7.0-7.5 渗透压 280-340mOsmol/kg 内毒素 <5EU/ml 无菌已检测 保存期限 2年 贮藏 +18?-+25? 注意 TBD实验室的细胞分离培养基是敏光型的。这种培养基在运输和贮藏过程中应避光保温。由于 各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以 调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件(具体分离条件各实验室自定)。组织，血液，细胞要求新鲜，避免冷冻和冷藏。

2018年淋巴细胞分离

淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）

6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：

骨髓淋巴细胞分离液试剂盒使用说明

骨髓淋巴细胞分离液试剂盒使用说明 规格：4×200mL/kit 保存：18-25℃保存，有效期2年。骨髓淋巴细胞分离液试剂盒易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后置于常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 试剂盒内容： 动物骨髓淋巴细胞分离液200mL 样本稀释液200mL 清洗液200mL F液200mL 一、各种动物骨髓细胞的采集方法 1.大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物,剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清。沉淀以F液重复洗涤一次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。 2.大动物骨髓的采集： A．骨髓穿刺点定位 （1）胸骨：穿刺部位在胸骨中线,胸骨体与胸骨柄连接处,或选胸骨上1/3部。 （2）胫骨：穿刺部位在胫骨内侧,胫骨上端的下方1厘米处。 （3）肋骨：穿刺部位在第5～7肋骨各自的中点上。 （4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3厘米的髁嵴。 （5）股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处。

B．骨髓穿刺方法 （1）实验动物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范围直达骨膜，也可作全麻。 （2）操作人员带消毒手套，确定穿刺点，估计从皮肤到骨髓的距离并依此固定骨髓穿刺针长度。左手拇、食指绷紧穿刺点周围皮肤，右手持穿刺针在穿刺点垂直进针，小弧度左右旋转钻入，当有落空感时表示针尖已进入骨髓腔。用左手固定穿刺针，右手抽出针芯，连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时立即停止抽吸，收集骨髓细胞加入4-5mL F液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。 （3）左手压住穿刺点周围皮肤，迅速拔出穿刺针，用棉球压迫数分钟。如穿刺的是肋骨，除压迫止血外，还需胶布封贴穿刺点，防止发生气胸。 3.人骨髓的采集： 临床方法收集骨髓细胞加入4-5mL F液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。 二、骨髓淋巴细胞分离方法 1.取一支15mL离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3mL）。 2.用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g，离心20-30min。（注：根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

B淋巴细胞分离技术

B淋巴细胞分离技术 一、实验原理 膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下： 二、实验材料 1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。 2 pH值72 Hank s液，含5%小牛血清。 3 淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±0002 4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片 三、实验步骤 1、取肝素抗凝血2ml，用Hank s液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500 r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。 2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。

MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书

MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途： 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液，达到特定比重，然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物（大鼠、小鼠等）单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，分离出色，性能 稳定，细胞活性保证。 技术背景： 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞，采用Boyum（1968）的离心技术，可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容： 淋巴细胞分离液（200）毫升 产品说明书1份 产品特点： -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格

检测标准： 热源检测结果：＜0.5EU∕ml 无菌检测结果：已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞，包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。（注：上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离，需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1．准备无菌的锥形离心管 2．加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1：1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。 3．小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 （注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液） 4．小心放进台式离心机离心30分钟，速度为400g 5．小心取出离心管，切记不要震动 6．可见，最上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA抗凝剂 常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固 3.PBS缓冲液 PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。 5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml） 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层

图1 小鼠外周血离心前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1) 4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min 7.弃上清液，加入4mlPBS待用

脾淋巴细胞分离

小鼠脾脏单个核细胞的分离 一、实验目的 1.熟悉细胞分离的基本原理 2.掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 3.掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法 二、实验原理 1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。 2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。 三、实验材料 小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板 平皿，尼龙膜指套、研磨棒、 吸管、试管、EP管、移液器和tips PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK） 细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 8.显微镜 四、实验步骤 （一）取小鼠脾脏 1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。 2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。 （二）制备单个核细胞悬液： 1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使 单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲 洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min； 3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬 液。(放置冰上) 4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释） 5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度 a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力 （三）计算细胞浓度 1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.细胞计数：细胞浓度（个/mL)=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）

淋巴细胞的分离及鉴定

离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定 【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。 【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。因此 用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。 【实验步骤】 一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即 获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。 6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理 盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后， 可进行细胞类型鉴定。 二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片 2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟，PBS洗3次。 4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量 的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。 【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成 明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。 【实验结果】 如下图：

淋巴细胞分离液

使用美国Mediatech公司的cellgro淋巴细胞分离液，可显著提高分离率,分离层间隔清晰。货号：25-072-CV Lymphocyte Separation Medium(淋巴细胞分离液） Density(密度) = 1.077-1.080 g/mL at 20oC 【分离目的】 方便在人体外对机体各种免疫细胞分别作鉴定，计数或功能测定。 淋巴细胞分离以后可以做淋巴细胞抗原片制备，E花环试验，淋巴细胞转化试验，淋巴细胞培养（需无菌操作） 【分离原理】 人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低，根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。此次实验采用的1就是密度梯度离心法。其原理是：人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。 【材料】 1、肝素抗凝管，普通管（负压），采血针，血清收集管 2、淋巴细胞分离液(比重1.077– 1.080 g/mL）。 3、无Ca++、Mg++、Hank's 液 4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。 5置于冰箱的冷丙酮（固定细胞，保持细胞的完整性） 【方法】 1．采静脉血2ml加入肝素抗凝管（或枸橼酸钠），3ml加入普通管。 2．普通管斜面放置30MIN，此时可分离淋巴细胞。用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用玻璃棒），2000rPm离心20分钟，用毛细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中，于4℃冰箱保存备用，用于以后的ELISA实验，对流免疫电泳实验和伤寒试管凝集实验，溶血反应，免疫比浊测定补体C3或C4等等。 （剥离时也可用毛细吸管轻轻剥离）

T淋巴细胞分离技术

T淋巴细胞分离技术 (免疫细胞的分离、纯化和鉴定) 免疫细胞的分离、纯化技术 各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞＞树突状细胞=抗体产生细胞＞B淋巴细胞＞T淋巴细胞=红细胞。粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC） 外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。ficoll-hypaque 混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。 【原理】 血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque 混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得PBMC。【器材与试剂】 1.刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等。 2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液，淋巴细胞分层液。（8.2%的聚蔗糖溶液28份，35.7%泛影葡胺10份） 【方法】 1.静脉取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血样本)的试管中，混匀，使血液抗凝。用pH7.2 Hanks液或生理盐水将抗凝血稀释1倍。