脂质体制备方法

2 脂质体的制备方法

2.1 薄膜蒸发法该方法是将脂质及芯材（脂溶性药物）溶于有机溶剂，然后将此溶液置于大圆底烧瓶中，再旋转减压蒸干，磷脂在烧瓶内壁上会形成一层很薄的膜，然后加入一定量的缓冲溶液（生理盐水），充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落，即可制得脂质体。尽管薄膜分散法是使用最广泛的方法，由于这种方法比较原始，所以尚存在较多缺点。用该方法制备得到的脂质体的粒径较大且不均匀，为了使其粒径更小、更均匀，可通过超声波仪处理，在一定程度上降低脂质体的粒径，从而提高包封率。如采用此法制备得到的细辛脑脂质体的包封率达54. 1%[5]。

2.2 超声波法

MLVs的混悬液经超声波处理，再通过 Sepharose 2B或4B柱色谱仪可去除较大的脂质体和

MLVs 。常用的方法有探针型和水浴型。小量脂质悬液（高浓度脂质或黏性水溶液）需要高能

量时用探针型。水浴型更适于大量的稀释脂质。郑宁等[6]采用薄膜 -超声分散法制备依托泊苷脂质体，按均匀设计的最优组合制备脂质体的平均包封率为（61.58±0.83）% ，粒径均小于2卩m,体外释药达到了长效缓释的作用，60Co灭菌后脂质体较稳定。李维凤等⑺以薄

膜-超声法和乙醚注入法制备硝苯地平脂质体，结果表明薄膜蒸发法和超声法综合使用，所得脂质体粒径均匀,粒度小,且多为单室。

2.3复乳法（二次乳化法）这种方法是先将脂质溶于有机溶剂,加入待包封芯材的溶液,乳化得到W/O

初乳,其

次将初乳加入到 10 倍体积的水溶液中混合,进一步乳化得到 W/O/W 乳液,然后在一定温度下去除有机溶剂即可得到脂质体,其包封率变化较大,一般为20%-80% 。通过研究发现,

在第二步乳化过程和有机溶剂的去除过程中, 对脂质体的粒径有较大影响的因素是温度, 较

低的温度有利于减小脂质体的粒径。姚瑶等[8]采用二次乳化法制备的酪丝亮肽多囊脂质体,

不仅稳定性好，80%的粒径分布在 20-30卩m，且包封率为 92. 43%。

2.4反相蒸发法（逆相蒸发法）反相蒸发法最初由 Szoka 和 Papahadjopoulos 于 1978 年提出, 这

种方法适用于脂质成分中磷脂占有较大的比例, 且芯材中水溶性成分较多的情况。一般的制备方法是将脂质等膜材料溶于有机溶剂中,加入芯材药物的水溶液经过短时超声振荡形成稳定的W /O 乳液后,减

压蒸发除掉有机溶剂,形成所谓“反相胶团” ,在达到胶态后,滴加缓冲液,旋转蒸发使器壁上的凝胶脱落,然后在减压下继续蒸发,制得水性混悬液, 再除去未包入的芯材,即得到

单层脂质体。因这种方法可包裹较大的水容积, 所以一般适用于包封水溶性药物、大分子生物活性物质等的情况。李淑梅等[9]采用逆向蒸发法制备黄芪多糖脂质体,操作简单可行,包

封率为 44. 32%。

2.5 注入法将脂质和芯材溶于水中或者不相溶的有机溶剂中, 然后用微量注射器把有机相均速注射到水相（含水溶性药物）中,搅拌挥发除去有机溶剂,再超声得到脂质体。此法根据溶剂的不同可分为乙醇注入法和乙醚注入法。用乙醇注入法制备时若放慢注入速度可制得具有较高包封率的脂质体, 并且乙醇注入法避免了使用有机溶剂。乙醚注入法制备的脂质体大多为单层脂质体，粒径绝大多数在 2卩m以下，操作过程中温度比较低（40 — 50C），该方法适用于在乙醚中有较好溶解度和对热不稳定的芯材, 通过调节乙醚中不同磷脂的浓度, 可以得到不同粒径且粒径分布均匀的脂质体混悬液。许洁等[10]采用乙醇注入法制备环孢素 A 脂质体, 包封率高达 87. 09%。

2.6冷冻干燥法

采用低温干燥技术，通过反复包封、冻干和重新融合来实现较高的包封率。冻干法为提高脂质体储存期的稳定性提供了较好的解决方法，它改变了液态脂质体不稳定和易氧化的缺点，具有工艺稳定、适合于工业化生产、质量易于控制和产品稳定性好等特点。冻干法存在的问题是 :制备工艺

较复杂，成本相对高。胥传来等人[11]研究了冷冻 PST 脂质体的制备及其

物理稳定性，表明冻干后的 PST 脂质体总体物理稳定性提高，置于室温下的保质期大大延长。

2.7 冻融法

此法是首先制备包封有芯材的脂质体，然后冷冻。在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的脂质体膜破裂，冰晶的片层与破碎的膜同时存在，此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂质体。通过研究发现，冻融法制备的脂质体的包封率最高，但是粒径最大。反复冻融可以提高脂质体的包封率。该制备方法适于较大量的生产，尤其对不稳定的药物最适合。

脂质体制备方法

微脂体(又称脂质体)及其制备方法一二 微脂体(又称脂质体) 微脂体起源于1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式将此小球状的物体命名为微脂体（liposo me）并做出明确的定义: 指出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer) 所组成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶液形成，由于构造的特性，可同时作为厌水性（hydrophobic）及亲水性（hydrophilic）药品的载体，厌水性药品可以嵌入脂双层中，而亲水性药品则可包覆在微脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形成是两性物质在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度(transition temperature, Tc)，影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度越高，双键数越多则临界温度越低，常见的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的临界温度分别是42℃与56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)与POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 则低于0℃。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；此外，当外界温度处于临界温度时，微脂体脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不一致而使微脂体表面产生裂缝，造成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增加微脂体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。 微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类： (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm，特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(亲手整理)

Hieff TransTM 脂质体核酸转染试剂 产品描述 Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA 、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM 复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM 以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice ）运输。产品4oC 保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA 或RNA 有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA （μg ）: Hieff Trans TM （μl ）比值在1：0.5-1：5。 操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一） 【注】：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。 贴壁细胞：转染前一天（20-24小时），胰酶消化细胞并计数，细胞铺板（不含抗生素），使其在转染时密度为90-95%（0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate ）。 c c l 整 理

冷冻干燥工艺流程及其应用-

冷冻干燥工艺流程及其应用-

冷冻干燥工艺流程及其应用

目录 冷冻干燥工艺的原理及特点………………… 真空冷冻干燥机组成………………………… 冷冻干燥工艺……………………………………食品冷冻干燥技术的运用…………………… 冻干食品的特点…………………………………我国食品冻干技术面临的问题……………… 冷冻干燥工艺的应用前景…………………… 结论…………………………………………………参考文献……………………………………………

冷冻干燥工艺流程及其应用 1冷冻干燥工艺的原理及特点 1.1冷冻干燥工艺原理 冷冻干燥就是把含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成固体。然后在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结的冰架子中，从而使得干燥制品不失原有的固体骨架结构，保持物料原有的形态,且制品复水性极好。然后在适当的温度和真空度下进行冰晶升华干燥，等升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水，从而获得干燥的产品的技术。冷冻干燥过程可分为制品准备、预冻、一次干燥（升华干燥）、二次干燥（解吸干燥）、和密封保存五个步骤。利用冷冻干燥目的是为了贮存潮湿的物质，通常是含有微生物组织的水溶液，或不含微生物组织的水溶液。产品在冻结之后置于一个低水气压下,这时包含冰的升华,直接由固态在不发生熔化的情况下变成汽态。与其他干燥方式相比避免了化学、物理和酶的变化，从而确保了制品物性在保存时不易改变。实际需要的低水汽压是靠真空的状况下达到的。

图1：水的平衡相图 1.2冷冻干燥工艺存在的优缺点 1.2.1冷冻干燥工艺的优点 （1）冷冻干燥的过程中样品的结构不会被破坏,因为固体成分被在其位置上的坚冰支持着,在冰升华时会留下孔隙在干燥的剩余物质里。这样就保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性; （2）蛋白多肽类药物在高温下容易变性,造成干燥后生物活性的降低;冷冻干燥的过程是在低温状态下进行的,工艺过程对组分的破坏程度小,热畸变极其微弱,对不耐热药物特别是蛋白质多肽类药品非常适合[1]; （3）冷冻干燥的药剂为液体,定量分装比粉剂或片剂精度高;用无菌水溶液调配且通过除菌过滤、灌装,杂质微粒小、无污染。制品为多孔结构,质地疏松,较脆,复水性能好,重复再溶解迅速完全,便于

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

冻干蔬菜的加工工艺与条件

1概述 真空冷冻干燥技术是一项高新加工技术，被认为是生产高品质脱水食品的最好加工方法。其原理是在真空状态下，利用升华原理，使预先冻结的物料中的水分不经过冰的融化直接以冰态升华为水蒸汽被除去，从而使物料干燥，称为真空冷冻干燥，简称冻干。用此方法生产的食品称冻干食品。 ⑴冻干食品的优点主要有：①保持食品组织结构、营养成分和风味物质基本不变，特别是生理活性成分保留率最高，这是某些功能性食品采用冻干食品为基料的主要原因。②外观不干裂，不收缩，维持食品原有的外形和色泽；③产品无表面硬化，组织呈多孔海绵状，因此复水性能好，食用方便，浸泡即可复原，从而决定了它在即食方便食品中的地位；④重量轻，耐保藏，对环境温度没有特别的要求，在避光和抽真空充氮包装时，常温条件下可保持2年左右，其贮存、销售等经常性费用远远低于冷冻食品。 ⑵冻干食品的缺点冻干食品的生产需要一整套高真空设备和低温制冷设备，因此，设备的投资费用较大。此外，为了防止物料中冰晶的融化，升华温度不宜太高。更主要的是，真空状态下多孔性物料的导热系数低，传热速率低，致使本来温度就不高的冰晶升华速率变得更低，所以，冷冻干燥的时间一般较长。在如此长的时间，设备一方面要不停地制冷，另一方面要不停地供热，还要不停地抽真空，致使设备的操作费用较高。所有这些，导致了冻干食品的生产成本较高，大限制了冻干食品的发展。这也一直是科学工作者致力于研究的课题。 ⑶国外冻干食品发展概况真空冷冻干燥技术早期用于生物体的脱水，第二次世界大战后才用于食品工业。经过几十年的发展，技术日渐成熟，设备日趋完善。70年代以来，随着人们对方便食品的要求日益增多，使冻干食品市场日趋扩大，冻干食品在发达工业国家已相当流行，成为国际贸易的大宗食品。以日本为例，97年日本国冻干食品的产量为7000t，同年日本还向美国、进口此类食品5000多t，目前欧州有冻干食品生产企业近100家，美国有80多家，日本有40多家，年产量达几万t，品种近100种，包括蔬菜、水果、速溶固体饮料、肉类、水产品等。主要用途是方便食品配菜、婴儿食品、方便主食品，特种场合需要等，中国则以汤料配伍为主。 我国在50年代引进真空冷冻干燥技术，引用于医药及生物制品。60年代末到70年代中期，、、、等地相继建起了冻干食品生产基地。但后来由于形势的原因以及当时的冻干产品成本高缺乏市场而相继停产或拆除。到了80年代后期，一些外商看中了中国丰富的原料市场，开始在大陆投资设厂。到了90年代，随着商品经济的发展和人民生活水平的提高，市场冻干食品的需求越来越大，特别是外商为打开中国市场，纷纷提供设备贷款以及包销部分产品，促使一些食品企业大胆引进国外设备建厂，而国一些厂家亦争先恐后推出国产冻干设备，一时间，冻干食品行业呈现一派兴旺和蓬勃发展的景象。但真正有经济效益的企业并不多，相当企业由于未经充分论证后即仓促建线生产，在原料供应、销售市场、工艺技术等均不占优势的情况下，只好暂时停产以观市场，昂贵的进口设备闲置或部分闲置，实在令人惋惜。更有个别企业花巨资购买（国产）或引进的是低劣冻干设备，产量低、品质差，根本不能进行商业化生产。 目前，、、、、、、新疆、等地又相继建成了一批冻干食品生产基地。截止97年12月止，中国大陆地区共有300台（套）食品用冻干机在运转，年产成品约几千t，主要品种有蘑菇、香菇、

长循环脂质体的研究

长循环脂质体的研究 《中国医药报》 2007-9-25 平安健康网 脂质体为一种新型药物载体，形状为球形，直径大小约为几十纳米到几十微米。脂质体在血液中的稳定性是发挥药物载体作用的关键。血液中有多种破坏因素：高密度脂蛋白（HDL）是破坏脂质体的主要成分，载脂蛋白A－1（apoA－1）易从HDL上脱落并与脂质体磷脂结合，且HDL和脂质体易发生apoA－1与磷脂的互换，脂质体膜形成孔洞；同时脂质体在血液中激活补体系统，最终形成攻膜复合体，脂质体膜出现亲水性通道，引起药物渗漏和水、电解质的大量进入，最终渗透裂解脂质体；血清白蛋白与脂质体磷脂结合形成复合物，降低其稳定性；血液中的磷脂酶可水解磷脂，该反应强弱由磷脂结构决定；脂质体进入循环系统后，未经修饰的脂质体大部分运转至肝脏和脾脏等单核吞噬细胞系统（MPS）丰富的部位，少量被肺、骨髓及肾摄取；肝细胞膜受体对直接暴露于表面的磷脂负电基进行识别，因而脂质体首先被肝枯否细胞吞噬。这些因素综合使传统脂质体的半衰期仅十几分钟。改变脂质体的组成、粒径、形态和表面电荷，将减少MPS的摄取。还可预先注射空白脂质体使MPS摄取呈饱和状态，然后再给予药物脂质体以增加非MPS摄取，延长药物的半衰期，但该法可能引起MPS的毒性反应。 长循环脂质体的研制给脂质体药物传输系统注入了新的活力和希望，但长循环脂质体最初的研究是从仿生学角度出发的。人们早就发现，体循环中的红细胞具有所有哺乳类动物细胞的共同特征，即具有含有数个唾液酸残基的糖蛋白和糖脂的多糖蛋白质复合物。红细胞膜磷脂分布不对称，其外层主要含有卵磷脂、鞘磷脂和胆固醇。因而进入20世纪80年代后，出现了一种新型脂质体———仿红细胞脂质体，延长了脂质体在血循环中的滞留半衰期。虽然仿红细胞脂质体具有较长的半衰期，但由于神经节苷脂价格昂贵，合成和提取都较困难，因此人们开始寻找其他途径来制备长循环脂质体。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

长循环脂质体

长循环脂质体 脂质体在血液中的稳定性是发挥药物载体作用的关键。血液中有多种破坏因素：高密度脂蛋白（BCD）是破坏脂质体的主要成分，载脂蛋白易从BCD上脱落并与脂质体磷脂结合，且BCD和脂质体易发生, 与磷脂的互换，脂质体膜形成孔洞;同时脂质体在血液中激活补体系统，最终形成攻膜复合体，脂质体膜出现亲水性通道，引起药物渗漏和水、电解质的大量进入，最终渗透裂解脂质体；血清白蛋白与脂质体磷脂结合形成复合物，降低其稳定性；血液中的磷脂酶可水解磷脂，该反应强弱由磷脂结构决定；脂质体进入循环系统后，未经修饰的脂质体大部分运转至肝脏和脾脏等单核吞噬细胞系统丰富的部位，少量被肺、骨髓及肾摄取；肝细胞膜受体对直接暴露于表面的磷脂负电基进行识别，因而脂质体首先被肝细胞吞噬。这些因素综合使传统脂质体的半衰期仅十几分钟。因而进入20世纪80年代后，出现了一种新型脂质体———仿红细胞脂质体，延长了脂质体在血循环中的滞留半衰期。虽然仿红细胞脂质体具有较长的半衰期，但由于神经节苷脂价格昂贵，合成和提取都较困难，因此人们开始寻找其他途径来制备长循环脂质体。 长循环脂质体的分类 现阶段的长循环脂质体有两类：含神经节苷脂的仿红细胞脂质体和聚乙二醇衍生物修饰的PEGs脂质体。含神经节苷脂增强膜刚性，降低血液成分破坏，减少MPS的摄取，脂质体在血液中的滞留量与被MPS摄取量的比值高于传统脂质体几十倍］，但含神经节苷脂难以大量获得，具有一定的免疫毒性。1990年Blume 等研制出PEGs 脂质体，该脂质体表面含聚乙二醇(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺衍生物（PEG-DSPE）。PEG-DSPE是两亲线型聚合物，它们在脂质体表面交错覆盖成致密的构象云，形成较厚的立体位阻层，阻碍了MPS的作用（因此又称为立体稳定脂质体）。而且PEG-DSPE有很长的极性基团，增强脂质体的溶剂化作用，有效阻止其表面的调理作用，降低MPS对脂质体的亲和力\。正是PEGs 脂质体使盐酸多柔比星脂质体上市成为可能 长循环脂质体的作用机制

脂质体及其制备方法的选择

脂质体及其制备方法的选择 1.脂质体概述 1965年，英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现了脂质体。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为４纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。此两位学者曾获得过诺贝尔奖提名。 某些磷脂分散在过量的水中形成了脂质体，该脂分子本身排成双分子层，在磷脂的主要相变温度(Tm)以上，瞬间形成泡囊，且泡囊包围水液，根据磷脂种类及制备时所用温度，双分子层可以是凝胶或液晶状态。在凝胶态时磷脂烃链是一种有规律的结构，在液态时烃链是无规律的，每一种用来制备脂质体的纯磷脂由凝胶状态过渡到液晶状态时均具有特征的相变温度。这种相变温度(Tin)是根据磷脂性质而变(见下表)，它可在-20～+90℃之间变化，双分子层的不同成分混合物可引起相变温度的变化或相变完全消失，当双分子层通过相变温度时，被封闭的水溶性标示物的漏出量增加。 脂质体的相变行为决定了脂质体的通透性、融合、聚集及蛋白结合能力，所有这些都明显影响脂质体的稳定性和它们在生物体系中的行为。

脂质体根据其脂质膜的层数和腔室的数量，可以分为单层脂质体，多层脂质体和多囊脂质体，单层脂质体。不同类型的脂质体其结构特点各不相同，见下图表。 1971年，英国Rymen等人开始将脂质体用作药物载体。所谓载体，可以是一组分子，包蔽于药物外，通过渗透或被巨嗜细胞吞噬后载体被酶类分解而释放药物，从而发挥作用。它具有类细胞结构，进入动物体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第四代靶向给药技术，也是目前国际上最热门的制药技术。至于药物在脂质体中的负载定位，其取决于所载药物的性质，见下图。

实验十五 脂质体的制备.

实验十五脂质体的制备 一、实验目的 1. 掌握注入法制备脂质体的工艺。 2. 掌握脂质体包封率的测定方法。 二、实验原理 60年代初 Banghan 等发现磷脂分散在水中可形成多层囊,并证明每层囊均为双分子脂质膜组成且被水相隔开,称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。197l 年Ryman 等人提出将脂质体作为药物载体, 即将酶或药物包囊在脂质体中。近年来脂质体作为药物载体在传递给药系统中的研究有了迅速的发展。 脂质体系一种人工细胞膜, 它具有封闭的球形结构, 可使药物被保护在它的结构中, 发挥定向作用。特别适于作为抗癌药物载体,以改善药物的治疗作用,降低毒副作用等。脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂, 如豆磷脂,卵磷脂等;合成磷脂,如二棕榈酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中, 磷脂分子定向排列, 其亲水基团面向两侧的水相, 疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层, 并进一步形成椭圆形或球状结构——脂质体。常用的附加剂为胆固醇,它也是两亲性物质,与磷脂混合使用,可制备稳定的脂质体,其作用是调节双分子层流动性,减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺,磷脂酸等,这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。 脂质体可分为三类:小单室(层脂质体,粒径在 20~50nm,凡经超声波处理的脂质体混悬液, 绝大部分为小单室脂质体; 多室(层脂质休, 粒径约在 400~1000nm; 大单室脂质, 粒径约为 200~1000nm,用乙醚注入法制备的脂质体多属这—类。 脂质体包封率的测定包封率的定义可用下式表示: 包封率% =(W总 - W游离 / W总 x 100

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

冻干工艺基础及经验汇总教学内容

冻干工艺基础及经验 汇总

冻干工艺 一、技术简介： 真空冷冻干燥是先将制品冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气。再用真空系统的冷凝器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品的技术。 技术优点：（1）它是在低温下干燥，不使蛋白质、微生物之类产生变性或失去生物活力。这对于那些热敏性物质，如疫苗、菌类、毒种、血液制品等的干燥保存特别适用。 （2）由于是低温干燥，使物质中的挥发性成分和受热变性的营养成分损失很小，是化学制品、药品和食品的优质干燥方法。 （3）在低温干燥过程中，微生物的生长和酶的作用几乎无法进行，能最好地保持物质原来的性状。 （4）干燥后体积、形状基本不变，物质呈海棉状，无干缩；复水时，与水的接触面大，能迅速还原成原来的性状。 （5）因系真空下干燥，氧气极少，使易氧化的物质得到了保护。 （6）能除去物质中95～99%的水分，制品的保存期长 二、冻干流程 样品预冻、升华干燥（第一干燥阶段）、解析干燥（第二干燥阶段）以及干燥后保存： 2.1样品预冻阶段： 2.1.1 预冻过程变化

溶液在冷冻过程中溶质和溶剂存在一个相互分离的过程，大多数冻干药品是以水为溶剂，所以以水为例来说明溶液的凝结过程。随着温度的下降到某一温度时，水开始结晶，这时的温度是制品的过冷温度。由于结晶放热，制品温度开始升高后再下降，随着水结晶的增加，溶液的浓度会增加（为了有利于干燥，一般冻干产品溶液配制成含固体物质4%-15%的稀有溶液）。此外，根据产品的性质不同，这时会有两种情况： 一种是溶质可以结晶的产品，随着制品温度的下降，稀溶液变为浓溶液，并逐步成为饱和溶液，温度继续降低时，由于溶解度降低，将会有溶质析出，最后成为冰晶体和溶质晶体的共晶混合物，晶体的大小和冷冻速率有关，这时的温度就是产品的共晶点温度。这个过程也是一个放热过程，在冷冻曲线上也出现过冷和平台。 另一种是溶质不结晶的产品，随着制品温度的下降，稀溶液变为浓溶液，温度继续降低时，溶液以玻璃态形式冻结，这时的温度就是产品的冻结温度。在冰晶的间隙中就形成了微观的玻璃态结构。 预冻会对细胞和生命产生一定的破坏作用，其机理是非常复杂的，一般认为，预冻过程中水结冰所产生的机械效应和溶质效应是引起生化药品在冻干过程中失活或变性的重要因素。机械效应是指水结冰时体积增大，致使活性物质活性部位中一些弱分子力键受到破坏，从而使活性损失；溶质效应是指水结冰以后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在各种温度条件下溶解度变化不一致引起pH值的变化，导致活性物质所处的环境发生变化而造成失活或变性。2.1.2 常见预冻方法及控制 冷冻方式要根据产品的特性，采用慢冻、快冻、预冻退火：

脂质体的制备概要

实验十五 脂质体的制备

一实验目的 1.了解脂质体（liposome）在细胞 工程技术中的应用及其制备方法。 2.掌握采用超声波法、冰冻干燥法 和冻融法三种不同的方法制备脂 质体的方法并了解该技术在细胞 工程中的应用。

二实验原理 脂质体（liposome）的制备技术，一般采用超声波法、振荡法、乙醚蒸发法、去污剂透析法、冰 冻干燥法和冻融法等。制备方法 不同，所得脂质体结构、大小不 同，性质和用途也就不同（表15-1）。

种类制备方法大小(m) 特性 多层大脂质体(MLV) 乙醚蒸发法、醇醚水 法、振荡法、液相快 速混合振荡法 0.1~50 易制备，包被物释放 速度慢 单层小脂质体(SUV) 直接超声波法、溶剂 超声波法、乙醚注射 法 0.02~0.05 体积小，适合包被离 子、小分子药物等 单层大脂质体(LUV) 递相蒸发法、去污剂 （胆酸纳等）透析法、 冰冻干燥法 0.05~0.5 适合包被蛋白质、 RNA、DNA片段、 大分子药物及细胞融 合 单层巨大脂质体(GUV) 冻融法5~30 适合包被蛋白质、 RNA、DNA片段， 除菌处理较难

本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥 法三种不同类型的方法，超声波法的原理是：在超声波作用下，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成的小脂质体基础上，通过冷冻和融解过程使其破裂，重组为大体积脂质体，在通过透析时膜内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致，只在处理条件上有所不同。

三实验用品 1.器材 超声波清洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光 分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱层析装置、冰冻干燥机。 2.试剂 １）磷脂液：100mg经丙酮-乙醚法纯化的卵磷 脂，57.2mg胆固醇，溶于1ml氯仿。 ２）荧光液：钙黄绿素（calcein）47mg溶于 100ml Tris缓冲液。 ３）Tris 缓冲液：称取Tris 0.12g，EDTA 0.288mg，溶于80ml去离子水中，用0.1 mol/L 盐酸调Ph7.2，再加水至100ml。

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书 产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。

脂质体转染实验原理与操作步骤总

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：

脂质体的制备方法及其研究进展

脂质体的制备方法及其研究进展 作者：穆筱梅，梁世强 【摘要】介绍了目前常用脂质体的两大类制备方法：被动载药法和主动载药法，并对其优缺点进行比较。被动载药法适于脂溶性强的药物，包封率高且不易泄露；而主动载药法适于两亲性药物。 【关键词】脂质体；被动载药；主动载药 脂质体作为药物载体具有提高药物疗效、减轻药物不良反应及靶向作用的特点。三十多年来，人们就其制备方法进行了大量的研究。脂质体是由磷脂分子在水相中通过疏水作用形成的，因此制备脂质体所强调的不是膜组装，而是如何形成适当大小、包封率高和稳定性高的囊泡。制备的方法不同，脂质体的粒径可从几十纳米到几微米，并且结构也不尽相同。目前，制备脂质体的方法较多，常用的有薄膜法、反相蒸发法、溶剂注入法和复乳法等，这些方法一般称为被动载药法，而pH梯度法，硫酸铵梯度法一般被称为主动载药法。 1 被动载药法 脂质体常用制备方法主要有薄膜分散法、反相蒸发法、注入法、超声波分散等。在制备含药脂质体时，首先将药物溶于水相或有机相中，然后按适宜的方法制备含药脂质体，该法适于脂溶性强的药物，所得脂质体具有较高包封率。 1.1 薄膜分散法 此法最初由Bangham 等报道，是最原始但又是迄今为止最基本和应用最广泛的脂质体的制备方法。将磷脂和胆固醇等类脂及脂溶性药物溶于有机溶剂，然后将此溶液置于一大的圆底烧瓶中，再旋转减压蒸干，磷脂在烧瓶内壁上会形成一层很薄的膜，然后加入一定量的缓冲溶液，充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落，即可得到脂质体。这种方法对水溶性药物可获得较高的包封率，但是脂质体粒径在0.2～5 μm 之间，可通过超声波仪处理或者通过挤压使脂质体通过固定粒径的聚碳酸酯膜，在一定程度上降低脂质体的粒径。 1.2 超声分散法 将磷脂、胆固醇和待包封药物一起溶解于有机溶剂中，混合均匀后旋转蒸发去除有机溶剂，将剩下的溶液再经超声波处理，分离即得脂质体。超声波法可分为两种“水浴超声波法和探针超声波法”，本法是制备小脂质体的常用方法，但是超声波易引起药物的降解问题。 1.3 冷冻干燥法 脂质体混悬液在贮存期间易发生聚集、融合及药物渗漏，且磷脂易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求。1978 年Vanleberghe 等首次报道采用冷冻干燥法提高脂质体的贮存稳定性。目前，该法已成为较有前途的改善脂质体制剂长期稳定性的方法之一。 脂质体冷冻干燥包括预冻、初步干燥及二次干燥 3 个过程。冻干脂质体可直接作为固体剂型，如喷雾剂使用，也可用水或其它溶剂化重建成脂质体混悬液使用，但预冻、干燥和复水等过程均不利于脂质体结构和功能的稳定。如在冻干前加入适宜的冻干保护剂，采用适当的工艺，则可大大减轻甚至消除冻干过程对脂质体的破坏，复水后脂质体的形态、粒径及包封率等均无显著变化。单糖、二糖、寡聚糖、多糖、多元醇及其他水溶性高分子物质都可以用做脂质体冻干保护剂，其中二糖是研究最多也是最有效的，常用的有海藻糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖。本法适于热敏型药物前体脂质体的制备，但成本较高。陈建明等［1］以大豆磷脂为膜材，以甘露醇为冻干保护剂，采用冻干法制备了维生素A前体脂质体，复水化后平均粒径为0.615 1 μm ，包封率98.5%。林中方等［2］采用冻干法制备了鬼臼毒素体脂质体，复水化后平均粒径为 1.451 μm ，包封率72.3%，但是这种方法仍然存在着不足之处，例如脂质体复水化后粒径分布不够均匀。 1.4 冻融法 此法首先制备包封有药物的脂质体，然后冷冻。在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的脂质体膜破裂，冰晶的片层与破碎的膜同时存在，此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂质体。何文等［3］分别用反相蒸发法、乳化法和冻融法制备了甲氧沙林脂质体。通过研究发现，冻融法制备的脂质体的包封率最高，但是粒径最大。反复冻融可以提高脂质体的包封率，王健松［4］

脂质体转染

二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。 (4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 (5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]： (1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。 (2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo 质粒DNA或供体DNA。②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。 (3) (3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。 (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时， (5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。 (6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 (7) 3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS 的DMEM，37℃培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法 细菌粘附侵入实验 1、将细胞按1.0×10? cells/ml的量接种于24孔板中，每孔1ml，置于37°的培养箱中培养3天直至细胞均勾铺满孔底，长满单层的细胞显微镜下可见细胞之间接触紧密，形成该细胞所特有的紧密连接。 2、实验前一天取E.coli菌株接种于含有相应抗生素的BHI培养基中，于37°培养箱中静置培养过夜。 3、取长满单层的HBMEC细胞，用预热的WXM培养基轻柔地将细胞洗3遍，以去除培养基中的双抗。 4、然后每孔中加入400μL培养基，于37°温箱中 5、静置期间取过夜培养的细菌，3000r/min离心5min收集菌体。弃去培养基，将菌体沉淀重悬于1mlXM培养基中。并用培养基调整菌液的OD???至0.2约为1.0×10? CFU/ml。 6、分别向24孔板中每孔细胞加入100μL细菌悬液（10?CFU,MOI约为100，使总体积达到500μL。轻轻晃动24孔板使细菌均勾分散。（若为侵入实验，则将24孔板于水平离心机中,1000r/min离心5min促使细菌与细胞的接触；若为粘附实验，则该步离心省略。