细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白

细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白

一、细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白

1.1细胞凋亡的概念及其途径

细胞凋亡是在生理或病理条件下的一种主动死亡方式，是受细胞内基因及细胞外一些因子调控的生物学过程，以DNA早期降解为特征，其细胞膜一般保持完整，不伴有细胞内容物的释放，细胞最终分解成凋亡小体后被巨噬细胞或组织吞噬，具体表现为：细胞皱缩，出现凋亡小体；死亡的细胞及凋亡小体迅速被巨噬细胞吞噬，无炎性反应；核浓缩，染色质沿核膜凝集，DNA裂解为180～200bp片段，其电泳图象呈梯状。其中包括以下几种凋亡途径：

1.1.1.死亡受体介导途径

胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体是一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子(TNF)受体基因家族成员，其胞外有一段富含半胱氨酸的区域,胞质区有一同源的氨基酸残基组成的结构,有蛋白水解功能,称为“死亡区域”。“死亡区域”使死亡信号得以进一步传递启动凋亡。目前发现至少有五种死亡受体在细胞凋亡信号传导中发挥作用。其中最典型的死亡受体有CD95(称Fas或Apo1)和TNFR1(称p55或CD120a)。CD95是一种广泛表达的糖基化的细胞表面分子,含有335个氨基酸残基。CD95的表达细胞因子如干扰素和TNF刺激，并可由淋巴细胞活化，它通过与其天然配基CD95L结合来诱导细胞凋亡。这个过程的发生是因为Fas是一个同源三聚体分子，可诱导Fas三聚体化，导致Fas分子胞质区的死亡结构域(death domain,DD)与一种具死亡域的Fas相关蛋白FADD(Fas-associat-ed protein with death domain)结合，FADD 通过自身的DD与Fas作用，而其死亡结构域DED(death effectordomain)则与caspase-8或caspase-10作用，由于Fas的寡聚化导致了DISC(death-inducing signaling com-plex)的形成及caspase-8、10的寡聚化。Caspase-8、10通过自身剪接作用被激活，从而又可使caspase-3和caspase-7被激活，接下去caspase-3又可激活caspase-6，如此启动caspase的级联反应，最终导致细胞凋亡。而在TNFR1介导的凋亡通路中，三聚化的TN-FR1可汇聚接头蛋白TRADD(TNFR-associated deathdomain)，TRADD通过自身的DD使FADD汇聚并导致caspase-8前体的寡聚化，最终导致caspase级联反应来诱导细胞凋亡。但被激活的的TNFR1还可通过接头蛋白RIP(receptor-interacting protein)形成复合体,经过一系列反应后激活核转录因子诱导LAP表达，而抑制细胞凋亡。这就造成了受体的激活既可以诱导细胞凋亡，又可以抑制细胞凋亡的双向调节作用。

由于Fas与TNFR1是死亡受体途径中的关键通路。研究表明Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bid能在其中发挥重要作用，在正常细胞中,Bid存在于胞液中,但在Fas或TNFR1诱导细胞凋亡时，细胞质溶质中的完整Bid被内源性caspase-8酶切后，将产生一个1.5万的C端肽段和1.3万的N端肽段。1.5万的tBid肽段在其N端被豆蔻酰基化(N-myristoylation)修饰后，便可移

位到线粒体膜上，引起细胞色素C的释放，进而引发细胞凋亡。

1.1.

2.内质网介导途径

内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网对细胞凋亡的作用表现在两个方面：一是内质网对Ca2+的调控，二是凋亡酶在内质网上的激活。Ca2+是真核细胞内重要的信号转导因子，它的动态平衡在细胞正常生理活动中起着举足轻重的作用。因此，作为细胞内重要的钙库，内质网对胞质中Ca2+浓度的精确调控可影响细胞凋亡的发生。大量试验表明，许多细胞在凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续的升高[1]，这种浓度升高来源于细胞外Ca2+的内流及胞内钙库(如内质网)的钙释放，相对高浓度的Ca2+可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶，又可以作用于线粒体，影响其通透性和膜电位的改变，从而促进凋亡。但是内质网上Bcl-2家族中抑凋亡蛋白则可以调节网腔中游离Ca2+浓度，使胞质中的Ca2+维持在合适的浓度水平，进而起到抗凋亡的作用[2]。

当Ca2+平衡态受到破坏或在内质网上积累过多的蛋白质时，能够激活凋亡酶引起细胞凋亡。凋亡酶(caspase)是一类天冬氨酸依赖性的半胱氨酸蛋白酶，它在凋亡中起到重要的调控作用，几乎所有的凋亡都有凋亡酶的参与。凋亡酶家族成员按功能可分为两类：一类为激活型凋亡酶(initiator caspase)，如caspase-8、-9，它们可激活下游凋亡酶；一类为效应型凋亡酶(effec-tor caspase)，如caspase-3、-6、-7,它们可直接降解胞内的功能蛋白，引起凋亡。这些凋亡酶均以无活性的前体形式存在，需要激活因子将其激活为活性形式后才发挥作用。研究发现caspase家族中的caspase-12定位于内质网，当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚时内质网可激活caspase-12，活化的caspase-12可进一步剪切caspase-3而参与内质网途径引起的细胞凋亡,但在线粒体信号途径和死亡受体途径中都没发现有caspase-12的激活和参与。这些都表明内质网途径在凋亡中有独特的作用。

1.1.3.线粒体介导途径

失去了赖以生存的生长因子或激素的支持、或者脱离了原来的生长环境、或者由于DNA 损伤等因素，可诱导线粒体介导凋亡途径。线粒体在凋亡中的作用包括：释放半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinylasparatespecific proteinase，caspase)激活因子如细胞色素C；丧失电子转移功能并减少能量的产生；线粒体跨膜电位的消失以及与Bcl-2家族蛋白促凋亡和抑制凋亡的功能等相关。有人提出：线粒体在凋亡中起着决定性的作用[3]。

随着细胞凋亡研究的深入，人们发现某些和凋亡有关的基因产物(蛋白质或酶)均可定位于细胞线粒体，并且各种刺激所诱导的细胞凋亡实验中发现线粒体膜的通透性增加，线粒体内的各种蛋白质被释放出来，这些蛋白质包括细胞色素C、Smac/Diabod、AIF(Apoptosisinducing factor)等，从而使线粒体与细胞凋亡之间相关细胞性的研究成为当今生命科学领域的前沿课题。其中AIF及细胞色素C在凋亡中发挥重要的作用。对于细胞色素C，当细胞接到凋亡信号后，线粒体释放出来的细胞色素C进入细胞浆后在ATP或dATP的协同作用下与凋亡蛋白酶活化因子I(Apoptotic protease-acti-vating factor-1,Apaf-1)结合以使其分子结构改变来激活caspase-9前体，并进一步激活其下游caspase-3等酶系列，启动caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。AIF是联系线粒体和核凋亡的另一条通路。

现已证明不同细胞的凋亡过程中都有细胞色素C的释放。关于细胞色素C的释放，它通过线粒体外膜的非特异性破裂和运输细胞色素C孔道的形成进行。细胞凋亡发生时，水和溶质进入基质，引起线粒体的膨胀，内膜的膨胀导致外膜的破裂，从而释放包括细胞色素C在内的各种蛋白。同时线粒体形成足够大的运输通道，现已发现Bcl-2、Bcl-xL、Bax等在平面脂双层中能形成孔道，在脂质体中Bax能发生寡聚化形成具有高传导性的通道并且激活细胞色素C的释放。此外，Bcl-2家族蛋白还可以和其它孔蛋白相互作用，在线粒体膜上形成一个高运输性无选择性的跨越线粒体外膜和内膜的通道PTP(permeability transition pore)，它由位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位子(Adenine nucleotidetranslocatar,ANT)和位于线粒体外膜的电压依赖性离子通道(V oltage-dependent anion channel,VDAC)所组成。PTP的形成，使大量Ca2+涌入到细胞质溶质中，细胞质和线粒体基质间的化学平衡被打破，造成线粒体内膜膨胀，进而引起更多PTP的开放，最终导致内膜的破裂，结果细胞色素C、凋亡诱导因子(apoptosis induc-ing factor,AIF)和胱冬肽酶原释放到胞液中。因为细胞色素C在线粒体途径介导的细胞凋亡中起到重要作用，所以对其释放的调控也很关键。许多研究结果表明，Bcl-2家族蛋白的主要作用位点就在线粒体膜上。其中Bcl-2和Bcl-xL是主要的抗凋亡因子，Bcl-2和Bcl-xL通过BH3结构域与Bcl-2家族的抗凋亡蛋白形成异二聚体，从而维持促凋亡蛋白在细胞内的定位分布，保护细胞不进入凋亡程序，且Bcl-2和Bcl-xL均能抑制细胞色素C的释放，使细胞色素C无法达到激活下游caspase的阀值，保护细胞不发生凋亡。而Bcl-2家族中的Bak、Bax、Bik、Bid是促调亡蛋白，它们可能在其它凋亡因子激活下，易位到线粒体膜上，破坏线粒体的结构和功能。其中Bid能与Bax连接并别构激活Bax，使Bax的N端暴露出来，进而发生同源寡聚化，易位到线粒体膜上，引起细胞色素C的释放，同时还发现被激活的tBid也可与线粒体上的Bak 连接别构激活Bak，引起Bak同源寡聚化并插入到线粒体外膜上，引起细胞色素C的释放，诱发细胞凋亡。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白形成孔道的内部性质不同，这造成它们对细胞色素C具有不同调控作用的原因。

凋亡诱导因子AIF是一种存在于线粒体中的万双功能黄素蛋白，具有促进凋亡的作用。在细胞凋亡过程中，AIF从线粒体中释放出来，直接进入细胞核并独立作用于染色质，进而在有关胱冬肽酶依赖性去核糖核酸酶的催化下，引起DNA的大规模断化和染色质浓缩，使细胞发生凋亡,并且胱冬肽酶抑制剂不能抑制AIF的促凋作用。此外，AIF还可通过自身放大回路来影响线粒体膜的通透性，使其释放更多的AIF，最终破坏细胞内线粒体的正常功能。研究表明，AIF介导了独立于caspase影响之外的另一条凋亡途径，其凋亡活性是由胚胎早期发育所必需的。在所有原生动物都发现有AIF的同源物，而植物、真菌或某些单细胞生物中在没有证据表明caspase存在的情况下都可进行程序性细胞凋亡。所以可以认为AIF以及AIF调节的凋亡，构成了多细胞生物形态发生所必需的一种原始而保守的程序性凋亡途径。但目前对胞浆中直接作用于AIF的上游蛋白及核内AIF的底物还不确定，特别是AIF介导凋亡的准确机制及AIF 与其它参与染色体凝集和降解因子的关系、信息交流的方式等需要深入研究。

此外，Smac/Diabo(the second mitochondrial-de-ived activator of caspase)在细胞凋亡时也被释放出来，它与细胞色素C一起释放到胞浆，通过与LAPs(in-ibitor-of-apoptosis proteins)、XIAP 结合发挥促凋亡作用从而成为线粒体途径的一部分。它本身不能诱发细胞凋亡,只是解除凋亡抑

制。研究发现Smac/Diabo比细胞色素C大，它在线粒体中的释放是否与细胞色素C同步还有待证明，并且只有成熟的Smac/Diabo才有生物活性,因此在其释放前必须有个加工过程。

总之，越来越多的证据表明作为能量供应站的线粒体在细胞调亡过程中发挥着关键性的作用。它不仅可以通过自身释放细胞色素C等物质介导凋亡，还可以与其它凋亡诱导因子共同作用而改变自身的活动状态以更好地调控细胞凋亡。线粒体作为细胞凋亡的中心环节，构成了凋亡的一个信号转导途径。

1.2 Bcl-2家族蛋白通过线粒体途径发生作用的机制

近几年，关于Bcl-2家族蛋白通过线粒体途径对细胞凋亡影响的研究，有了很大的进展。研究证明，线粒体外膜通透性的改变可引起细胞凋亡，而这种通透性的改变直接由Bcl-2家族蛋白控制[4]。具体作用机制，主要被认为有以下两种：一是Bcl-2家族蛋白成员精确地改变线粒体膜的通透性；二是Bcl-2家族蛋白能够诱导线粒体通透性转变孔道的开放。

Bcl-2家族蛋白能够独立改变线粒体膜的通透性。Bcl-2家族蛋白与白喉毒素孔形成区域相似，这些蛋白能插入生物膜中，形成离子转导通道[5]。Kuwana等[6]用原子显微镜观察到，由二维脂质双层中的Bax所形成的大孔道。Saito等[7]发现，重组Bax可以独自从完整的脂质体中释放出用荧光标记的细胞色素C；并且计算的结果显示，这个通道是由4个Bax分子组成，它的直径正好使细胞色素C分子通过。一些研究者认为，孔道的形成是由于在细胞凋亡时，Bax 和Bak寡聚到线粒体的外膜上。Bid经caspase-28修剪或重组后，到达线粒体外膜，并寡聚到Bax和Bak上，这种寡聚可能对膜通透性的改变具有重要的作用。

Bcl-2家族蛋白诱导线粒体通透性转变孔道的开放。一是通透性转变孔道开放，线粒体的外膜不受损伤，膜间隙中的细胞色素C、Smac/DIABLO、凋亡诱导因子和核酸内切酶G等被释放到细胞质中；二是通透性转变孔道的开放后，使线粒体基质和胞浆内的离子得以平衡流动，造成线粒体基质的高渗状态，线粒：体发生膨胀，外膜破裂，从而使膜间隙中的促凋亡蛋白被释放到细胞质中。这些促凋亡蛋白或激活caspase或独立地破坏核内染色质，引起细胞凋亡。通透性转变通道是由线粒体一些内膜外膜蛋白组成的，定位于内外膜接触点，并可以无选择性地允许Mr≤1.5×103的分子通过。通透性转变通道是线粒体的刺激感受器，被认为是细胞生死的开关[8]。细胞色素C是一种水溶性蛋白，位于线粒体内外膜之间，并与内膜松弛相连。在线粒体损伤后，细胞色素C从构建的孔隙中进入细胞液，与抗恶性贫血因子1和caspase-9组成了凋亡复合体。在caspase-9被激活后，再作用于其下游的caspase-3酶原，活化的caspase-3作为效应子，作用于不同的靶分子，经蛋白水解作用导致细胞凋亡。研究发现，Bcl-2家族蛋白对细胞色素C的释放具有最明显的调控效应[9]。Susin等[10]证实了线粒体释放的另一种凋亡诱导因子及其作用机制。凋亡诱导因子定位于线粒体膜间隙腔中，当凋亡发生时，其首先从线粒体间隙转移到胞质中，继而再转移到细胞核中。凋亡诱导因子可以引起纯化的胞核内染色质的异常凝集，核DNA的大规模片段化[11]。核酸内切酶G是线粒体释放的另一种凋亡因子，其功能与凋亡诱导因子相似：其从线粒体膜间隙中被释放后，导致细胞核内DNA的片段化反应[12]。Smac是近年来被发现的线粒体促凋亡蛋白，当细胞发生凋亡时，Smac被释放到细胞质中促进细胞凋亡。最近有报道称，Smac具有特异性氨基酸末端序列，能够激活caspase-3前体，导致细胞凋亡[13]。

1.3 Bad蛋白对细胞凋亡的调控作用

近年来，在细胞凋亡调控中起重要作用的B细胞淋巴瘤-白血病-2(B-cell leukemia-2，Bcl-2)家族蛋白的研究众多，Bcl-2被证实是最重要的有明显抑制细胞凋亡作用的基因。随着研究的深入，人们发现众多与Bcl-2有较高同源性的基因，它们构成庞大的Bcl-2家族，已发现并命名的Bcl-2家族成员有近20种之多。它们有的抑制凋亡，有的为凋亡的促进者。抗凋亡成员(又称抗凋亡蛋白，antiapoptotic proteins)有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Al、ced-9等，促凋亡成员(又称凋亡前体蛋白，Proapoptotic proteins)有Bad、Bax、Bak、Bid、Bik、Bim、Bcl-xs 等。促凋亡成员又分为两类；仅含BH3同源区域(BH3 only Proteins)的成员，包括Bik，Bid，Bad，Bim，Bmf等；含多个同源区域(Bcl-2 homology domain，BH)的成员，包括Bax、Bak、Bcl-xs、Mtd。其中Bad是主要的促凋亡基因之一，近年研究发现，Bad可通过细胞信号转导通路及与天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族成员作用而促进细胞凋亡。

1.3.1.Bad蛋白

Bad基因首先从鼠的cDNA文库中克隆鉴定出[14-15]，其后又克隆出人的同源基因，由Yang 等[16]于1995年发现，其编码一个含204个氨基酸，分子质量22.1×103的蛋白质。双杂交和序列分析发现，Bad可与Bcl-2和Bcl-xL结合形成异源二聚体，具有促进细胞凋亡作用，故名Bad(Bcl-xL/Bcl-2 associateddeath promoter)，它存在Bcl-2家族成员BH3同源结构域和序列。与Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xL相似，此结构域是Bad与Bcl-2家族蛋白结合所必需的。Bad的促凋亡作用依赖于与Bcl-2或Bcl-xL结合，胞外的Bad还能通过与一种细菌毒素的转运结构域结合进入细胞，诱导凋亡。Hong等[17]发现，Bad在某些病毒感染时还可与病毒受体结合，可能通过酪氨酸激酶途径激活细胞凋亡。

Bad蛋白的结构特点和生物学特征：

Bad蛋白是含有BH3结构域的凋亡前体蛋白，Bcl-2成员均由1~4个BH构成，BH1~BH4均具有α螺旋结构。目前发现的所有抗凋亡蛋白均具有BH1~BH4四个同源区域，而促凋亡蛋白除Bcl-xs外均缺乏第一个螺旋片段BH4区域[18]。BH3区域对于促凋亡蛋白来说似乎是最重要的功能区，因为已发现的促凋亡因子Bid、Bad和Bim等都只有BH3区，而且经证实所有仅含BH3区蛋白的成员都是促凋亡的，且都与某个凋亡抑制家族成员相互作用。目前认为仅含BH3区蛋白是程序性细胞死亡的必须启动子，它们参与识别不同类型的刺激，通过灭活Bcl-2家族中促生存成员的保护功能，并激活促凋亡的家族成员来发动凋亡。BH3结构域也是Bad与Bcl-2家族蛋白结合所必需的，其促凋亡作用依赖于与Bcl-2或Bcl-xL的结合。

生理状态下Bcl-2家族促凋亡成员和抗凋亡成员绝大部分都位于特定的亚细胞结构中[19]。抗凋亡成员为膜的内在蛋白，分别与内质网膜、线粒体膜和核膜相结合。Bad等促凋亡成员在没有凋亡信号时大部分位于胞质中，少量疏松黏附于细胞内膜结构。在凋亡刺激信号作用下，促凋亡成员发生构型改变，易位并插入线粒体外膜发挥促凋亡活性。线粒体通路正是Bcl-2家族基因调控凋亡的主要途径。

Bad蛋白的表达：

Bad在外周及中枢神经元、淋巴细胞、骨髓造血细胞、生殖细胞及许多上皮细胞中均有表达。近年来其在缺血损伤方面的研究受到重视，肿瘤方面的研究多见。脑缺血后Bcl-2基因家

族在脑内表达有明显的改变，此方面的研究是新的热点。

Dluzniewska等[20]建立鼠暂时性脑缺血模型，用免疫细胞化学方法在电镜下发现海马CA1区神经元Bad蛋白表达增加，并通过Western Blotting的方法和免疫双标法证实CA1区Bad蛋白由胞质易位至线粒体的过程。Tan等[21]认为Bad蛋白能通过其磷酸化和去磷酸化调控其在线粒体膜上与Bcl-2和Bcl-xL的异二聚体的作用。Uchino等[22]在暂时性全脑缺血大鼠海马区神经元细胞观察到与凋亡相关的由钙调磷酸酶诱导的Bad蛋白的去磷酸化和Bad蛋白表达增加。研究表明[23]，Bad/Bcl-xL通过Bad通路调控缺血再灌注脑神经元凋亡。Dennis等[24]建立暂时性视网膜缺血模型，观测到视网膜神经节细胞层和内核层细胞中的Bad蛋白表达上调，此外，这些细胞中大多都可见DNA断裂的损伤表现，而DNA断裂是凋亡细胞的一个典型特征。

Bcl-2在多种肿瘤组织中均有较高表达，可抑制多种因素诱发的细胞凋亡，促凋亡成员Bad在肿瘤中的表达具有重要意义。Ichinose等[25]发现，Bad蛋白磷酸化后失活，失活的Bad 加剧胶质母细胞瘤和前列腺癌的恶性转化；Kohler等[26]发现，Bax和Bad的高表达与急性白血病的预后不良相关，可作为一个预后指标，在Bcl-2和Bcl-xL过表达的情况下，Bad可直接诱导凋亡，具有治疗意义。

1.3.

2.Bad蛋白参与凋亡的可能机制

Bcl-2家族蛋白通过转录水平的调控及转录后调控来发挥作用，但转录调控不是其发挥作用的主流形式，各种转录后调控，如磷酸化-去磷酸化修饰，二聚体的形成，蛋白质剪切、解及Bcl-2成员在亚细胞水平的易位更为重要，这些过程能有效精确地调节内外源性凋亡信号通路。Bad蛋白的转录后调控专主要是磷酸化修饰和二聚体形成，另外其促凋亡作用与BH3区域密不可分。

Bad蛋白对凋亡的调控与其磷酸化-去磷酸化修饰有关：

生理状态下，磷酸化的Bad与14-3-3蛋白结合成复合物稳定存在于胞质中发挥抗凋亡效应；接受凋亡信号刺激后，调磷酸酶等诱导Bad去磷酸化，去磷酸化的游离Bad通过易位和一系列细胞活动促进凋亡的发生。

据报道[27，28]Bad蛋白有三个磷酸化部位，分别在Ser112、Ser136和Ser155:线粒体相关蛋白激酶(mitochondria-associatedprotein kinase，PKA)、Ras-丝裂原激活的蛋白激酶(Ras-mitogen-activated protein kinese，RSK)及p21激活的蛋白激酶(p21 acti-vated kinase1，PAK1)诱导Ser112磷酸化；PAK1或ATP依赖的酪氨酸激酶Akt诱导Ser136磷酸化；RSK或PKA诱导Ser155磷酸化。Ser170也是一个磷酸化部位，诱导此部位磷酸化的激酶还未确定，但此处磷酸化也产生对抗凋亡的效应。Datta等[28]报道在体外，至少有四种激酶(PKA、Akt/PKB、PKC、Raf1)能使Bad磷酸化。但这些激酶中只有PKA、Akt/PKB能使Bad中与14-3-3蛋白结合相关的Ser112或Ser136磷酸化。Akt是一个丝/苏氨酸激酶，位于磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)的下游，为许多促细胞生存信号蛋白所激活，包括胰岛素样生长因子1、白细胞介素3和神经生长因子。另外Akt也可被Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活。激活的Akt使Bad中的Ser136磷酸化，导致14-3-3蛋白与Bad的结合并抑制Bad所诱导的细胞凋亡。Bad中的Ser112也可被线粒体上的PKA磷酸化而抑制Bad的促凋亡作用。但此过程是否需要14-3-3蛋白的参与还须进一步考证。

Henshall[29]和Meller等[30]研究癫痫发作致神经元凋亡的调控机制并描述了Bad信号通路的激活过程：当Bad以磷酸化形式与14-3-3蛋白结合时无活性，稳定的存在于胞质。磷酸化的Akt对于保持这一构型的稳定性很重要，Akt的磷酸化又由PI3-K维系。癫痫发生以后，PI3-K 失活，Akt去磷酸化，Bad的磷酸键与14-3-3蛋白断开而分离，变为去磷酸化的Bad，游离的Bad构型改变，它从Bax-Bcl-xL二聚体中夺取Bcl-xL而释放出Bax，游离Bax形成二聚体并向线粒体膜易位并插入其中，其疏水核心形成一个孔道结构，使细胞色素C(Cyto C)释放至胞质，引起caspase酶系级联反应导致凋亡。他们还证实了癫痫发作后Bad与14-3-3的解离及Bad与Bcl-xL的结合。

Bad蛋白对凋亡的调控与二聚体的形成有关：

Bcl-2成员之间易于形成同源或异源二聚体，这种二聚体反应调节细胞死亡和存活信号的平衡状态，是决定细胞存亡的关键。Bad蛋白的促凋亡作用就依靠其与Bcl-xL和Bcl-2在线粒体外膜处的结合来完成。Bcl-xL与Bax形成异二聚体而阻断后者的促凋亡活性，去磷酸化的Bad与Bax竞争，从Bcl-xL/Bax二聚体上夺取Bcl-xL，释放游离的Bax启动凋亡通路。Bcl-2成员形成二聚体有选择性，且不同伴侣分子结合的强度也不同。因此，在一个特定的哺乳动物细胞，每个成员是否存在及其浓度决定了占优势的二聚体的类别，最终决定了细胞的命运。Bad可以说是Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bax异二聚体的负调控基因，依靠自身的强结合力，以浓度依赖性方式替换Bcl-2/Bax，Bcl-xL/Bax二聚体中的Bax，使Bax游离后成为二聚体而促进凋亡，当一细胞系所有细胞中的Bax同源二聚体含量>80%，再加上适当的信号诱导，细胞就出现凋亡，这表明Bad通过调节Bax同二聚体与异二聚体的比值介导凋亡，类似的，当一细胞系所有细胞中的Bcl-2/Bax，Bcl-xL/Bax异二聚体的含量≥50%时，则细胞耐凋亡。

Bad蛋白的促凋亡作用与其BH3区域密不可分：

BH3区是Bad蛋白重要的功能区，Bad与Bcl-2家族蛋白结合必需此结构域，在细胞凋亡刺激物存在时会出现BH3表达增多或翻译后修饰的现象，此时BH3蛋白结合Bcl-2和Bcl-xL，使其对抗Bax和Bak的作用减弱，促使凋亡发生。

研究发现[31]与Bad结构相似的促凋亡因子Bak与Bcl-xL形成二聚体。此时Bcl-xL的BH1，BH2和BH3区相互靠近，形成一个“疏水口袋”，将Bak的BH3区保护于其中，屏蔽了BH3区的促凋亡活性。凋亡时，二聚体结构解离，“疏水口袋”样保护性结构丢失，Bak暴露出BH3区域，暴露出的BH3区则易于攻击线粒体外膜。因此，可以推测Bad蛋白的BH3区也通过类似机制诱导凋亡发生。

1.3.3.从细胞接受刺激信号到产生凋亡的过程中，Bad处于什么位置，细胞中Bad参与的促凋亡反应具体是怎样的？

在凋亡诱导因素的刺激下，细胞的跨膜或者胞内信号通路被启动。其中Bad与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路联系的研究较多。MAPK通路是细胞外多种刺激传向细胞内信号的转导的交汇点，其级联反应中包括3个关键的激酶，细胞外信号调节激酶(Erk1/2)活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键。

研究发现[27]，Erk1/2通过磷酸化抗凋亡分子(如BadSer112)，同时激活转录因子(如CREB Ser133)以刺激表达存活相关基因而产生抗凋亡作用。此时对线粒体来说，Bad蛋白的磷酸化和

非磷酸化将成为一个检查点。非磷酸化Bad从线粒体膜表面的Bcl-xL/Bax异二聚体上夺取Bcl-xL，释放Bax，Bax发生蛋白质剪切，构型改变而二聚化，Bax二聚体向线粒体膜易位并插入其中，其疏水核心形成一个孔道结构，使Cyto C释放至胞质内从而形成线粒体Ca2+内流和Cyto C外流的交换通道，启动凋亡通路。这将导致膜电势降低、ATP形成不足及下游caspases活化；而磷酸化Bad则可能诱导Bax的单聚化而失去作为凋亡诱导信号的功能。相反，地塞米松刺激下，Erk1/2通路被显著抑制。结果是Bcl-2等抗凋亡活性蛋白失去Erk1/2的磷酸化激活，加速了凋亡的发生。且由于Bad蛋白不能被磷酸化，导致下游的线粒体膜电势的崩溃和ATP形成不足，内质网等Ca2+库不能维持正常功能，游离Ca2+流入胞浆诱发凋亡。Valks等[32]也阐述了心肌细胞中通过Erk1/2信号通路介导的Bad(Ser112，Ser155)的磷酸化及类似的后续过程。

综上所述，Bad是与Bcl-xL和Bcl-2相关的细胞死亡促进因子，是调控细胞凋亡的重要成员，主要通过线粒体途径参与细胞凋亡。在缺血性损伤，肿瘤发生和发展等多方面发挥调控细胞凋亡的作用，其促凋亡作用与其自身结构特点和与其他Bcl-2家族成员的相互作用有关。应用其调控凋亡的作用，在缺血损伤中若从避免其去磷酸化入手阻断Bad通路激活可达到抗凋亡目的或在肿瘤的治疗中，促进其磷酸化来抑制细胞恶性化。随着对凋亡及其调节因子的不断认识，提醒人们通过抑制或促进基因表达来达到基因治疗的目的，为临床工作提供更好的医治思路。

1.4 Erk在细胞凋亡中对Bcl-2家族的调节

有较多的研究资料显示，作为重要的细胞周期相关蛋白激酶途径，Ras-Raf-MEK-Erk信号通路的激活促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。这主要是因为Erk1/2激酶与Bcl-2家族蛋白有着密切的关系。调节蛋白Bcl-2的抗凋亡效应依赖于其BH3和BH4结构域间的丝氨酸残基磷酸化，而Raf-MEK-Erk信号途径参与并抑制Bcl-2的磷酸化，这为Erk激活和细胞存活之间提供了潜在的联系[33]。Erk1/2的激活不但可以上调Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达，而且可以诱导其活化[34-37]。另外，活化的Erk1/2可以使Bad的ser112位点磷酸化，磷酸化的Bad与Bcl-2或Bcl-xL发生解聚，并且与磷酸丝氨酸结合蛋白14-3-3结合，游离的Bcl-2或Bcl-xL则促进细胞的抗凋亡作用。因此，游离的Bcl-2和磷酸化的Bad是促进细胞生存的关键物质[38]。虽然多数研究表明Erk途径主要参与细胞增殖活动，但也有实验发现，Erk途径也可促进细胞凋亡。在人B细胞的研究中，Erk参与诱导细胞凋亡[33]；Boucher等[39]以胰腺癌细胞作为研究模型，分析Erk1/2在细胞生存中的调节作用以及相关机制，发现Erk1/2的抑制剂以引起细胞G1期的阻滞及抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL表达下调，加了caspases-3，6，8，9的活性，但对促凋亡蛋白Bax和Bak的表达无影响。

1.5 PI3K-Akt信号通路抗细胞凋亡的机理

近年来研究表明，PI3K-Akt能经多种途径抑制细胞凋亡，促进细胞存活。PI3K-Akt信号通路抗细胞凋亡的机制主要有：

1.5.1.直接调节作用

哺乳动物细胞的细胞凋亡是多级联反应的过程。Bad是Bcl-2家族成员之一，可与Bcl-2或Bcl-xl形成复合体而表现促凋亡活性。Bad的功能受它的Serl12和Ser136位点磷酸化所调

节。Bad一旦磷酸化，磷酸化的Bad能与伴侣蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白结合，从而阻断Bad 与Bcl-2/或Bcl-xl形成二聚体，使Bad不能发挥促细胞凋亡作用。Akt是强有力的Bad激酶，活化的Akt可以使Bad的Ser136位点磷酸化，有效阻断Bad诱导的细胞凋亡。当用特异的PI3K抑制剂wortmannin和LY294002处理后，Akt引起的Bad磷酸化受阻[40]。Akt也能磷酸化Bcl-2家族成员BAX的Ser184位点，负调控促凋亡功能[41]。促凋亡相关因子如半胱天冬酶caspase-9是细胞凋亡的启动者和效应者。活化的Akt可以使caspase-9 Ser196位点磷酸化而失活，抑制其促凋亡作用[40]。Par-4是一种促凋亡蛋白，Goswami等[42]研究表明，Akt能结合并磷酸化Par-4，从而灭活Par-4的促凋亡作用。通过PI3K抑制剂PTEN、LY294002或DN-Akt1等直接或间接抑制Akt的活性，能够解除Akt对Par-4促凋亡作用的抑制，增加肿瘤细胞的凋亡，而且研究还表明，这种凋亡是Par-4依赖性的。

1.5.

2.通过直接或间接影响转录因子家族(Forkhead、NF-κB、p53等)发挥细胞存活调控作用

叉头转录因子(Forkhead or FoxO)家族成员的4个亚型(FKHR/FoxO1、FoxO2、FKHRL1/FoxO3和AFX/FoxO4)均能被Akt直接磷酸化，磷酸化后的Forkhead蛋白能抑制促凋亡基因的转录功能，负调节凋亡促进信号，促进细胞存活。Forkhead蛋白的靶基因是包括胞外的配体FasL、TRAIL、TRADD和胞内的凋亡组分Bim、Bcl-6[43]。磷酸化的Forkhead家族转录因子能降低FasL的表达，从而减少细胞凋亡。在肿瘤细胞中，NF-κB的典型功能是抗凋亡，从而赋予肿瘤细胞存活的优势。NF-κB的活性依赖于IκB激酶(IKK)复合体的磷酸化和I κB的失调。Vandermoere等[44]研究证明Akt能够直接或间接调节IKK的活性，导致NF-κB 的核转位、活化和NF-κB依赖的促进存活基因的转录。Akt使NF-κB磷酸化后，激活它的转录功能，使促进细胞存活的Bc1-2家族成员Bcl-xl表达增强，从而促进细胞存活，当用特异的PI3K抑制剂wortmannin和LY294002处理后，NF-κB的活化受到抑制。另外，Akt同时还能使NF-κB的抑制酶IκBa磷酸化，使NF-κB进入核内，调节抗凋亡基因的转录[45]。P53是一个重要的介导DNA损伤引起的细胞凋亡的蛋白，其水平和功能能够被MDM2泛素连接酶抑制。MDM2是P53的一种负性调节蛋白，能够结合P53蛋白，使P53的转录调节功能失活。Akt能结合MDM2并磷酸化其Ser166和Ser186位点，诱导核输入或上调泛素连接酶的活性，进而促进P53的失活或降解，阻断P53介导的促凋亡转录反应[46，47]。YAP是转录辅激活因子，它能够与核磷蛋白P73相互作用，并增强由于DNA损伤介导的P73依赖型凋亡，用特异的SiRNA沉默YAP基因，能够延缓或减少P73介导的凋亡[48]。YAP是近年来才被证明的Akt的底物，Akt能够磷酸化YAP的Ser127位点，磷酸化的YAP是P73转录活性介导的凋亡抑制因子[49]。

1.5.3.通过调节细胞周期影响细胞增殖

哺乳类动物雷帕霉素(the mammaliantarget of rapamycin，mTOR)是Akt下游的一个重要作用靶点，能够被Akt磷酸化激活，通过调控核糖体激酶p70s6k(ribosomal S6-kinase，RSK)和4E-BP-1两条不同的下游通路，分别控制特定亚组分mRNA的翻译，进而调节蛋白质的合成，影响细胞的增殖。研究表明，mTOR的活性能够被PI3K的抑制剂wortmannin和L Y294002所抑制，抑制mTOR能够阻断其下游的p70s6k与4E-BP-1的信号通路，阻滞细胞周期在G1期，导致细胞生长停滞[50]。

1.6 Caspase在细胞凋亡中的作用

Caspase家族广泛存在于细胞中，主要以酶原的形式存在，各成员分布和表达有一定的组织特异性。Caspase家族是半胱氨酸依赖性细胞死亡蛋白酶，是一大类凋亡调节基因。可分解细胞骨架中的结构蛋白、调节细胞周期和DNA修复所需的功能蛋白，与线虫Caenorbditis elegans的死亡基因ced-3同源，是哺乳动物细胞凋亡的启动者和执行者。

所有Caspase都由一个前域(prodomian)和一个酶的区域组成，由于前域的结构、蛋白酶之间存在着多相性，根据酶原N端被切割肽段的长度，Caspase可分为长前域和短前域。长前域主要起激发和调节凋亡的活化作用，其中以Caspase-2、Caspase-8、Caspase-10为代表，它们都有两个约60个氨基酸的蛋白-蛋白作用基元(motif)，称为“死亡域”(death effector domain，DED)，调节与其它蛋白的结合及传递信号。短前域主要进行蛋白质酶解作用，主要有Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等代表，又称效应Caspase，其作用为在链的下游末端去剪切底物。

对Caspase诱导凋亡机制的认识很大程度上取决于对其作用底物的发掘，近年来已有40多种Caspase底物得到发现。根据蛋白酶对其底物酶切后产生作用的后果不同，将其底物分为四大类：第一类是被酶切后活化的底物，如Caspase本身切割可引起自身活化，PKC-δ、P21激活的激酶2(PAK2)、凝脂酶A2、类固醇调节元件结合蛋白(SREB)等；第二类为酶切后失活的底物，如DNA催化亚单位、视网膜母细胞瘤抑制蛋白等；第三类为酶切后改变其结构的蛋白，如A型和B型细胞核Lamin及Gas2；第四类为酶切后对凋亡作用尚不清楚的底物，如PARP[poly(Aop-ribose)polymerase]DNA-PAKs等。通过对底物的作用引起的变化包括：阻遏细胞周期循环；破坏细胞平衡状态及修复机制；使细胞从周围的组织结构中脱落；使维持细胞结构的物质解体；磷脂酰丝氨酸(PS)为其他细胞如巨噬细胞作包裹吞噬的标记。

在细胞凋亡过程中有多种Caspases共同参与，不同类型的细胞可能含有不同的Caspases 群体，不同的凋亡刺激信号也可能活化不同的Caspases，因而各种细胞的凋亡途径亦不尽相同。Caspase在正常情况下以无活性的前体形式合成与贮存，而凋亡信号可激活Caspase级联反应，其中Caspase-3，8，9是主要的Caspase分子，Caspase-3被称为“执行者”(executioner caspases)，Caspase-8，9被称为“发起者”(initiator caspases)。在Fas或TNF诱导的凋亡中“发起者”是Caspase-8，而在许多刺激诱导的凋亡中，“发起者”是Caspase-9。Caspase-3能直接水解底物，包括细胞质和细胞核内与DNA修复、复制，RNA剪切和细胞骨架等相关的蛋白质，并导致细胞凋亡。

Caspase-9处于Caspase“瀑布式”激活的顶端，Caspase-9酶原经蛋白酶水解成大小亚单位，在细胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和dATP的参与下形成有活性的二聚体，直接或间接激活下游的效应分子Caspase-3，6，7，而激活的Caspase-3，6，7去分解lamins，PARP(poly ADP-ribose polymeras)等，再激活核酸内切酶，导致DNA片断化。激活的Caspase-9切割Caspase-3酶原，使Caspase-3激活，引发caspase级联反应，裂解核蛋白、细胞骨架、内质网等，造成凋亡典型的形态学改变，如细胞核染色体固缩和裂解，染色质密度增高，核和胞体分离，形成多个凋亡小体[51-57]。

细胞凋亡信号转导途径图

The transduction pathway of cells apotosis

杨梅素诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡机制图

The mechanism of myricetin inducing the human hepatoma HepG-2 cells apotosis

二、杨梅素化学及药理作用的研究进展

2.1 杨梅素物理化学研究

杨梅素(myricetin. Myr)化学名称为3，5，7，3'，4'，5'-六羟基黄酮，又名杨梅树皮素、杨

梅黄酮、杨梅酮，属于黄酮类化合物。化学式C15H10O8，相对分子量318.24，黄色针状或颗粒状结晶，盐酸-镁粉反应呈玫瑰红色，与FeCl3乙醇液反应呈墨绿色，与AlCl3反应呈强黄绿色荧光，α-萘酚-浓H2SO4反应呈阴性，与NaOH反应呈黑绿色。熔点324-326℃，UV(MeOH)：375.0nm，255.0nm。溶于甲醇、乙醇、丙酮，不溶于氯仿、石油醚。存在于壳斗科（Fagaceae）、豆科（leguminosae）、报春花科（Primulaceae）、葡萄科（vitaceae）、菊科（compositae）等植物中[58]。

杨梅素化学结构式

Structure of myricetin

2.2 杨梅素药理活性研究进展

2.2.1.抗肿瘤作用

Ching-Huai Ko等[59]人研究表明杨梅素对结肠直肠癌中基质金属蛋白酶2(MMP)的表达和活性有抑制作用，通过影响蛋白激酶C-α（PKC-α）的易位，细胞外信号调节激酶（Erk）的磷酸化和c-Jun的表达诱导结肠直肠癌细胞凋亡。Zhang Q[60]发现杨梅素具有细胞毒作用，虽然毒力较弱，但同其他黄酮类成分一样，通过使细胞停滞在G2/M导致细胞凋亡。Wang IK[61]发现杨梅素可以通过促进细胞色素C释放和激活caspase-9和caspase-3诱导白血病HL-60凋亡。同时也发现其凋亡作用与羟基基团种类和数量有关。Ko CH[62]研究发现，杨梅素影响蛋白激酶C、细胞色素C和caspase级联反应，通过线粒体依赖和活性氧独立途径导致肿瘤细胞凋亡。研究发现C3'，C4'和C5'位羟基是杨梅素诱导凋亡的主要功能团，杨梅素可以改变线粒体膜电位，同时降低Bcl-2/Bax蛋白含量，而蛋白激酶C的相关抑制因子GF-109203X、H7等可以阻止这些作用。已发现杨梅素可以导致非白血性白血病细胞系、Jurkat细胞和人类初级多形核白细胞凋亡。Lu J等[63]提出杨梅素通过抑制硫氧蛋白还原酶活性，使肿瘤细胞停滞于G1晚期，进而引起细胞死亡。据报道，杨梅素不引起小鼠体内肿瘤形成，而且能降低每只小鼠二元环氧化物诱导的肺肿瘤数量，抑制小鼠上皮和肺细胞稠环芳烃代谢及后继的多环碳氢化合物–DNA 内转形成。杨梅素对2期皮肤癌的发生起保护作用，而且通过抑制硫氧还蛋白还原酶活性抑制肺癌细胞A549生长。Ki Won Lee等[64]发现杨梅素是赘生性细胞转化和MEK1的天然抑制剂，其影响MEK信号通路具有抗肿瘤的潜力。杨梅素和白藜芦醇复合物对12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)和上皮生长因子(EGF)诱导的细胞转化没有协同作用。杨梅素减弱肿瘤启动因子(EGF)-诱导的c-fos和活化蛋白-1（AP-1）的激活作用。而白藜芦醇没有这个作用。杨梅素抑制MEK1活性很强，同时抑制TPA和EGF诱导的细胞外信号调节激酶（Erk）和其下游区靶点p90核醣体S6激酶的磷酸化。此外，对比MEK抑制剂PD098059和白藜芦醇，杨梅素可以有效的抑制H-Ras诱导的细胞转化。杨梅素直接与谷胱甘肽S-转移酶MEK1结合，不与其竞

争ATP位点。总之，杨梅素有抗癌活性，靶向作用于MEK信号。另据报道，杨梅素对EGF 诱导的细胞转化有抑制作用，EGF可以激活PI3K/ATK和Erk信号通路[65]。对胰腺癌细胞信号传导途径PI3K/ATK有阻滞作用[66]。环氧化酶-2（COX-2）的异常表达和肿瘤发生有关，杨梅素（10-20microM）通过阻断小鼠表皮细胞中核因子kappaB活性抑制佛波醇酯诱导的COX-2和前列腺素E的表达。通过荧光分析，杨梅素抑制佛波醇酯诱导的JB6P+细胞中COX-2和NF-kappaB转活。电泳迁移率变动分析表明杨梅素阻断了NF-kappaB的DNA的活性[67]。以上资料证明杨梅素是一种有效的致癌作用化学防治剂。

2.2.2.降低神经毒性

神经功能紊乱可以导致多种疾病，如局部缺血和老年前期痴呆。杨梅素可以有效阻止神经损伤。Shimmyo Y等人[68]研究表明杨梅素通过多种不同途径抑制由谷氨酸引起的神经毒性来保护神经元。这种由谷氨酸引起的神经毒性是通过N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）、活性氧簇(ROS)增殖和caspase-3激活引起的胞内Ca2+过载导致的。首先，杨梅素调节NMDAR磷酸化，降低谷氨酸引起的胞内Ca2+过载。其次，杨梅素抑制谷氨酸引起的ROS的产生。最后，杨梅素阻止caspase-3激活。此外，杨梅素通过3氢键直接与caspase-3活性位点结合抑制其活性。总之，杨梅素可以通过不同的生化途径阻止由谷氨酸引起的神经毒性。同时，Ma ZG等[69]也证明了杨梅素降低6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的小鼠的多巴胺神经损伤。高效液相电化学检测经6-OHDA处理后纹状体中多巴胺含量减少，杨梅素可以改变这种情况。免疫组织化学和半定量RTPCR研究表明杨梅素可以阻止6-OHDA诱导的黑质-纹状体中酪氨酸羟化酶阳性神经元和酪氨酸羟化酶的mRNA表达降低。Perls'铁染色法进一步证明杨梅素处理组的铁染色细胞数较6-OHDA处理组显著减少。杨梅素鳌合铁的特性是杨梅素对DA能神经元的保护机制。由于杨梅素对大鼠下丘脑R-氨基丁酸系统的调制作用及对6-羟基多巴胺损伤大鼠黑质-纹状体系统的保护作用，所以杨梅素对睡眠调节有帮助。

2.2.

3.对淋巴细胞活化及增殖的影响

俞瑜等人[70]研究了杨梅素对小鼠T细胞活化及增殖的影响，无菌分离小鼠淋巴结细胞，加入不同浓度的杨梅素预先孵育1h，用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化，利用荧光标记的单克隆抗体双染技术，流式细胞仪检测杨梅素对小鼠CD3+T细胞CD69表达的影响；采用3H-TdR参入法检测杨梅素对淋巴细胞增殖的影响，采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测杨梅素对IL-2mRNA表达的影响。采用ELISPOT检测杨梅素对IFN-γ分泌的影响。结果表明杨梅素能抑制T细胞早期活化标志CD69的表达，并能抑制淋巴细胞增殖反应，同时对淋巴细胞活化后IL-2 mRNA的表达及IFN-γ的分泌也有抑制作用。杨梅素对淋巴细胞的活化增殖反应具有抑制作用。

2.2.4.血小板活化因子(PAF)的拮抗作用

陈文梅等[71]以比浊法测定家兔洗涤血小板(WRP)聚集，邻苯二甲醛(OPT)荧光法测定52HT 浓度，Fura22荧光探针测定血小板内游离钙离子浓度。观察杨梅素对血小板激活因子(PAF)诱导的兔洗涤血小板聚集、52HT释放及血小板内游离钙离子浓度升高的影响。结果表明杨梅素体外呈浓度依赖性地抑制PAF诱发的WRP聚集及52HT释放。杨梅素抑制WRP聚集的IC50为1715μmol/L；抑制52HT释放的IC50为6411μmol/L。同时杨梅素能明显抑制PAF引起的

血小板内游离钙增高。臧宝霞等在此基础上进一步研究了杨梅素对PAF的拮抗作用以及杨梅素抑制PAF与兔血小板受体特异性结合的作用，试图从细胞及分子水平阐明杨梅素抗PAF作用的机理。以放射配体结合试验观察[3H]PAF与家兔血小板受体特异性结合的作用；以分光光度法测定PAF诱发血小板黏附的强度；以Fura22荧光分光光度法测定兔多形核白细胞(PMNs)内钙离子浓度。结果表明了杨梅素具有抗PAF作用，为一新的PAF受体拮抗剂。因此杨梅素具抗血栓、抗心肌缺血、改善微循环等多方面的心血管药理作用，有望将其开发为活血化瘀类药物[72]。

2.2.5.降血糖作用

YoshikawaM等[73]，在研究抗糖尿病机理药物的机理时发现，杨梅素对高血糖小鼠有降血糖的作用。钟止贤[74]等采用四氧嘧啶所致糖尿病模型、肾上腺素和葡萄糖引起的高血糖小鼠模型，以及正常小鼠，在口服给药后，测定各模型小鼠的血糖水平。结果杨梅素对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠和肾上腺素、葡萄糖引起的高血糖小鼠均有明显的降血糖作用，治疗效果良好，但对正常小鼠血糖无明显影响。Liu IM等[75]研究连续6周用含有60%果糖的食物喂养小鼠后，给予杨梅素观察其胰岛素耐受性。连续静注杨梅素14天（每次1 mg/kg，一天3次），发现小鼠血浆中高糖和三酸甘油酯含量明显降低。而且小鼠的胰岛素耐受力也明显降低。通过口服葡萄糖耐量试验全身胰岛素敏感指数明显提高，证明杨梅素增加小鼠全身胰岛素敏感度。杨梅素改变IRS-1、p85和PI3K调节亚单位表达缺陷，增加小鼠比目鱼肌中IR、IRS-1和Akt基底的磷酸化，导致胰岛素活性降低。同时他们[76]也研究出杨梅素通过加强肥大小鼠IRS-1、PI3K和GLUT-4活性，增加后受体胰岛素信号来改善胰岛素敏感度。杨梅素对多种动物模型均具有较好的降血糖作用，可望开发出降血糖药物。

2.2.6.抗氧化作用

邹耀洪[77]通过从杨梅果核中提取分离到的杨梅素，采用Rancimat法测定其抗氧化性能，结果表明其对油脂是优良的抗氧化剂，作用明显强于合成抗氧化剂BHT(3，5-二叔丁基-4-羟基甲基苯)可作为天然抗氧剂应用于油脂较高的食品保藏上。Shimmyo Y[78]研究表明杨梅素是一种很强的抗氧化剂，氧化应激在各种神经疾病包括局部缺血和老年期痴呆中起关键作用，?-淀粉酶是老年痴呆患者脑中含有的老年斑中的一种成分。?-淀粉酶-42(1 microM)诱导的小鼠原皮质神经元培养48小时，出现明显的神经损伤。DAPI染色法表明构象变化的?-淀粉酶-42导致细胞凋亡，如核碎裂。杨梅素通过构象变化作用减少?-淀粉酶的产生和毒性，可用于统计老年痴呆的进展情况。

2.2.7.保肝护肝作用

钟正贤[79]等采用四氯化碳、D2半乳糖胺和异硫氰酸萘酯致小鼠急性肝损伤模型，观察杨梅树皮素对肝损伤的保护作用；采用小鼠单核巨噬细胞吞噬和免疫低下小鼠和溶血素试验，观察杨梅树皮素的免疫增强作用。结果证实了杨梅素能明显降低四氯化碳、D2半乳糖胺和异硫氰酸萘酯致小鼠急性肝损伤模型血清中ALT、AST活性和T2BIL含量，减轻肝组织的变性和坏死；并提高单核巨噬细胞吞噬功能和溶血素含量。说明了杨梅树皮素具有保肝降酶退黄，增强小鼠非特异免疫功能和免疫功能低下小鼠体液免疫功能，因而起到保肝作用，为杨梅素的临

床应用提供了参考。

2.3 杨梅素抗肿瘤作用研究进展

2.3.1通过抑制细胞周期阻滞细胞增殖

Ching-Huai Ko等人研究表明杨梅素对结肠直肠癌中基质金属蛋白酶2(MMP)的表达和活性有抑制作用，通过影响蛋白激酶C-α（PKC-α）的易位，细胞外信号调节激酶（Erk）的磷酸化和c-Jun 的表达诱导结肠直肠癌细胞凋亡。Zhang Q发现杨梅素具有细胞毒作用，虽然毒力较弱，但同其他黄酮类成分一样，通过使细胞停滞在G2/M导致细胞凋亡。Lu J等提出杨梅素通过抑制硫氧蛋白还原酶活性，使肿瘤细胞停滞于G1晚期，进而引起细胞死亡。

2.3.2抑制信号传导通路相关因子介导肿瘤细胞凋亡

Ki Won Lee等发现杨梅素是赘生性细胞转化和MEK1的天然抑制剂，其影响MEK信号通路具有抗肿瘤的潜力。杨梅素和白藜芦醇复合物对12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)和上皮生长因子(EGF)诱导的细胞转化没有协同作用。杨梅素减弱肿瘤启动因子(EGF)-诱导的c-fos和活化蛋白-1（AP-1）的激活作用。而白藜芦醇没有这个作用。杨梅素抑制MEK1活性很强，同时抑制TPA和EGF诱导的细胞外信号调节激酶（Erk）和其下游区靶点p90核醣体S6激酶的磷酸化。此外，对比MEK抑制剂PD098059和白藜芦醇，杨梅素可以有效的抑制H-Ras诱导的细胞转化。杨梅素直接与谷胱甘肽S-转移酶MEK1结合，不与其竞争ATP位点。总之，杨梅素有抗癌活性，靶向作用于MEK信号。另据报道，杨梅素对EGF诱导的细胞转化有抑制作用，EGF可以激活PI3K/ATK和Erk信号通路。对胰腺癌细胞信号传导途径PI3K/ATK有阻滞作用。信号传导在肿瘤细胞生长、增殖和转化中起到关键的作用，杨梅素作用于多种信号传导通路的相关因子，介导肿瘤细胞的凋亡。已有资料表明，杨梅素影响MAPK信号通路下游因子Erk的磷酸化和c-Jun的表达诱导结肠直肠癌细胞凋亡。对PI3K/Akt通路中的PI3K下游的P110也有抑制作用。同时，国外相关资料表明杨梅素可以影响细胞色素C、蛋白激酶、Bcl/Bax、caspase-9和caspase-3的正常表达。

2.3.3干扰线粒体通路导致肿瘤细胞凋亡

Wang IK发现杨梅素可以通过促进细胞色素C释放和激活caspase-9 和caspase-3诱导白血病HL-60凋亡。同时也发现其凋亡作用与羟基基团种类和数量有关。Ko CH研究发现，杨梅素影响蛋白激酶C、细胞色素C和caspase级联反应，通过线粒体依赖和活性氧独立途径导致肿瘤细胞凋亡。研究发现C3'，C4'和C5'位羟基是杨梅素诱导凋亡的主要功能团，杨梅素可以改变线粒体膜电位，同时降低Bcl-2/Bax蛋白含量，而蛋白激酶C的相关抑制因子GF-109203X、H7等可以阻止这些作用。已发现杨梅素可以导致非白血性白血病细胞系、Jurkat细胞和人类初级多形核白细胞凋亡。线粒体途径是肿瘤细胞凋亡的经典途径，以上研究表明杨梅素可以影响肿瘤细胞线粒体膜电位，抑制Na+、K+-ATP酶活性，影响蛋白激酶C、细胞色素C和caspase级联反应。已发现杨梅素可以导致非白血性白血病细胞系、Jurkat细胞和人类初级多形核白细胞凋亡。

线粒体与细胞凋亡

万方数据

万方数据

万方数据

线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)

细胞凋亡的信号通路

山东农业大学学报(自然科学版),2015,46(4):514-518VOL.46N0.42015 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2015.04.007 细胞凋亡的信号通路 谢昆,李兴权 红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661199 摘要:细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，与自噬和坏死有明显的区别。细胞凋亡的信号途径比较复杂，在凋亡诱导因子的刺激下经历不同的信号途径。本文就细胞凋亡的三条信号通路——线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径做一综述，以便为人们进一步了解细胞凋亡发生的机制，从而对癌症及其他一些相关疾病的治疗奠定基础。关键词:细胞凋亡;信号通路;线粒体途径;内质网途径;死亡受体途径 中图法分类号:R329.2+8文献标识码:A文章编号:1000-2324(2015)04-0514-05 The Signal Pathway of Apoptosis XIE Kun,LI Xing-quan Department of Life Science and Technology/Honghe University,Mengzi661199,China Abstract:Apoptosis is a process of programmed cell death which distinguishes from autophagy and necrosis.The signal pathways of apoptosis are complex and different under apoptosis induced factor stimulating.Three kinds of signal pathways of apoptosis including Mitochondrial pathway,Endoplasmic Reticulum pathway and Death Receptor pathway were summarized in this review in order to make people further comprehend the mechanism of apoptosis，so that it should make a basis for us all to treat cancer and other related diseases. Keywords:Apoptosis;signal pathway;Mitochondrial pathway;Endoplasmic Reticulum pathway;Death Receptor pathway 细胞凋亡是细胞程序性死亡（Program cell death，PCD）中特有的一种细胞死亡方式，是细胞在一系列内源性基因调控下发生的自然或生理性死亡过程。Kerr等1972年最早提出了凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）的概念[1]，随后Paweletz等对其进行了详细的描述[2,3]。在形态学上，凋亡表现为核浓缩、细胞质密度增高、染色质凝聚、核膜破裂、核内DNA断裂、细胞集聚成团、形成凋亡小体(Apoptosome)等特征，这些凋亡小体最终被巨噬细胞清除，但不会引起周围细胞的炎症反应，另外，凋亡发生在单个细胞之间[4,5]。坏死，通常是由相邻的多个细胞之间发生细胞肿胀，细胞核溶解，细胞膜破裂，细胞质流入到细胞间质中，并伴发一系列的炎症反应，从而与凋亡表现为本质性区别[6,7]。 目前认为，凋亡发生的途径分为三种。第一种是线粒体途径，也称为内源性途径，该途径包括两类，第一类需要通过激活Caspase通路促进凋亡，在一序列凋亡诱导因素刺激下，线粒体中的Cyt C（细胞色素C）释放至细胞质中，从而与Apaf-1(Apoptosis protease activating factor1，凋亡蛋白酶活化因子1)结合形成多聚体，形成的多聚体再进一步与凋亡起始分子Caspase-9结合形成凋亡小体，凋亡小体激活Caspase-9，从而激活下游的凋亡执行分子Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7等诱导细胞凋亡的级联反应；第二类是不依赖于Caspase途径的，通过线粒体释放AIF（Apoptosis induce factor，凋亡诱导因子）直接诱导凋亡的发生。但是在细胞内，直接检测AIF比较困难，而且AIF的变化不一定能代表凋亡发生的程度，因为引起凋亡发生的途径不一。第二种是死亡受体途径（也称为外源性途径），经由死亡受体（如TNF，Fas等）与FADD的结合而激活Caspase-8和caspase-10，进一步激活凋亡执行者caspase-3,6,7，从而促进凋亡的发生；第三条途径是内质网途径，内质网应激（蛋白质错误折叠或未折叠、内质网胁迫）会导致细胞内钙超载或钙离子稳态失衡一方面激活caspase-12，caspase-12进一步激活caspase-9而促进凋亡的发生，另一方面诱导Bcl-2(B细胞淋巴瘤蛋白)家族中促凋亡蛋白Bax和Bak的激活诱导凋亡[8]。 1凋亡的线粒体途径 在哺乳动物中，由于凋亡的激活需要线粒体中细胞色素C（CytC）的释放，因此CytC由线粒体膜间隙释放到细胞质中的多少可以作为判断凋亡发生强弱的指标之一。有研究认为，CytC的释放是通过Bcl-2家族调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），科学 收稿日期:2013-03-07修回日期:2014-09-11 基金项目:云南省科技厅应用基础研究面上项目(2010ZC151) 作者简介:谢昆(1975-),男,云南富民人,博士研究生,研究方向为动物生物化学与分子生物学.E-mail:xk_biology2@https://www.sodocs.net/doc/cd9459888.html, 数字优先出版:2015-06-03https://www.sodocs.net/doc/cd9459888.html,

(整理)凋亡相关的基因和蛋白

细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。 细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 一、凋亡相关的基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 1．Caspase家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶； ③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族（图15-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，

细胞凋亡信号转导途径及调控的研究进展

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究 进展 学科：基础兽医学 专业：药理毒理学 姓名：ma cai hui 学号：13203023

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究进展 摘要目的：为了研究抗肿瘤药物促使细胞凋亡的作用机理，探讨细胞凋亡的信号转导途径以及相关基因对其的调控。方法：查阅近年的国内外相关文献，归纳整理细胞凋亡的信号转导途径和相关的调控基因。结果：介绍了细胞凋亡存在三条主要通路：线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路，各通路间互相联系，共同调节细胞凋亡。以及调控凋亡的主要基因，Bcl-2、p53、c-myc、P16、Rb。结论：研究抗肿瘤药物的作用机理应从以上三条凋亡途径和相关调控基因出发。 关键词细胞凋亡；信号转导途径；基因调控；caspase Progress study on signal transmission pathways and regulation of cell apoptosis Wang Saiqi School of Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou, 450001 Key words : cell apoptosis; signal transmission pathways; gene regulation; caspase Abstract Aim : To check the mechanism of apoptosis induced by anticarcinogen and research the cell apoptosis signal transmission pathways and related genes on its regulation. Methods: Signal transmission pathways and related genes were concluded by referring to related papers at home and abroad in recent years. Results: Three main signal transmission pathways, death receptor-mediated pathways, mitochondrial pathway, endoplasmic reticulum pathway and several main regulator genes,Bcl-2,p53, c-myc,P16,Rb were introduced. Conclusions: Research on the mechanism of anticarcinogen should start from the said signal transmission pathways and genes. 1 细胞凋亡概述 细胞凋亡，又名细胞程序性死亡，是诱导性的细胞自杀过程，它使生物体可以有序地清除受损伤或无用的细胞。自从1927年John Kerr第一次提出凋亡这一概念后，人们发现它在多细胞生物的基本生命活动中起着十分重要的作用。它对于

(完整word版)细胞凋亡过程

细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。

细胞凋亡的途径

按照起始caspase的不同，可将哺乳细胞的凋亡分为三种基本的途径。 一种称为外在途径（extrinsic pathway），由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因 子受体家族（tumour necrosis factor receptor，TNF-R）引发; 另一种称为内在途径（intrinsic pathway）或线粒体途径（mitochondrial pathway），由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始（Nicholson, 1999；Denault和Salvesen，2003）; 第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化，从而导致凋亡。 细胞凋亡的途径 摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 关键词细胞凋亡线粒体内质网caspase家族NO 疾病 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。 1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。

细胞凋亡的信号传导调控机制

细胞凋亡的信号传导调控机制 胡传鹏 长春理工大学朝阳区卫星路7089号0205114# 吉林长春（130022） E-mail:huchuanpeng@https://www.sodocs.net/doc/cd9459888.html, 摘要：细胞凋亡（apoptosis），又称编程性细胞死亡（PCD），是多细胞有机体调节发育的一个重要特征，是指细胞在内、外因子的严格控制下一种有步骤有活性的生理性自行消亡的过程。细胞凋亡与细胞生长、分裂和增殖紧密联系，并且在许多疾病的发生过程中起着重要的作用。因此，在分子水平上对细胞凋亡研究，阐明凋亡信号分子的转道途径，对于揭示多细胞有机体的生长、分化、衰老以及重大疾病病因的机理和治疗等方面都有十分重要的意义。近年来，随着遗传学、分子生物学和细胞生物学研究方法的不断改进，使得对于细胞凋亡的分子调控机制的研究有了很大的进展。如Apafs的发现[1]，IAPs家族新成员Survivin蛋白[2]，Bcl-2家族的Bcl2-L-10等[3]。现已证实细胞内存在二条凋亡信号转导通路，即死亡受体信号通路和死亡受体非依赖的转导通路[4]，在两种信号通路中，线粒体起到了枢纽的作用，且两种信号通路在一定的状态下可发生“信号交谈” [5]。本文主要探讨了进几年来细胞凋亡的信号转导领域的进展,重点介绍了联系凋亡蛋白复合体的募集,胞质caspase蛋白家族及其抑制因子，线粒体内Bcl-2家族,细胞核内转录因子等凋亡蛋白因子所构成的细胞凋亡信号分子的网络调控机制。 关键词：细胞凋亡；信号转导；分子调控 细胞凋亡与细胞生长、分裂和增殖一样是维持生物体平衡的重要环节，并且在很多疾病包括癌症，获得性免疫综合症（AIDS），神经退行性病变，自身免疫失调，病毒感染，心肌跟梗塞等过程中都起着重要的作用[6,7]，并且贯穿于细胞凋亡过程的始终。因此，对于研究细胞凋亡的分子调控机制，尤其是阐明已知凋亡相关信号分子的具体信号通路和寻找新的基因调控途径近年来引起很多科学家的高度关注，细胞凋亡信号转导的分子调控机制也成为科学家研究的热点之一。 细胞凋亡是多细胞有机体调节发育的一个重要特征，是指细胞在内、外因子的严格控制下一种有步骤有活性的生理性自行消亡的过程。在过去的十几年中，其分子机制的研究揭示：细胞凋亡大致要经历启动、调控、执行和最后死亡四个阶段。其中，细胞核内各种转录因子，细胞器线粒体内Bcl-2家族蛋白，细胞膜上各种功能复合体的募集（如TRADD，FADD，CARD 等），细胞质内系列caspase蛋白家族的级联放大，第二信使，细胞周期蛋白，骨架蛋白，结构蛋白以及内质网和线粒体成分等均参与凋亡形成，而其他与细胞生长，分化，增殖等密切相关的信号转导通路，如涉及对细胞生存发挥重要作用的的蛋白磷酸化酶，c-Jun激酶，P18激酶和cdc-2激酶皆与凋亡的信号转导有联系[8]。现已证实细胞内存在二条凋亡信号转导通路，即死亡受体信号通路和死亡受体非依赖的转导通路[4]，在两种信号通路中，线粒体起到 - 1 -

细胞凋亡途径

细胞的凋亡 凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis , IAPs)是细胞内一类独特的抗凋亡蛋白家族,包括XIAP，c-IAP1，c-IAP2，神经元凋亡抑制蛋白(NIAP) ,ML-IAP, Apollon和survivin。IAPs通过在体外或体内抑制不同的caspases而抗细胞凋亡。与其他的可抑制上游 caspases的蛋白不同, IAPs是唯一的内源性 caspase 抑制物【1】。 Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白家族中的成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，于1997年由耶鲁大学Alfieri【2】等用效应细胞蛋白酶受体1(effector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人类基因库的杂交中分离出来，Survivin大量表达于胚胎及婴幼儿组织中，在正常的分化组织中几乎检测不到【3】，然而却在60余种肿瘤细胞株和大部分人体肿瘤组织过度表达。 1.Survivin的分子结构 IAP家族蛋白一般在N末端含有 2～3个串联的含有 Cys/ His的保守冠状病毒IAP重复序列结构域(Baculovirus IAP Repeat, BIR)，发挥着极为重要的凋亡抑制作用。IAPs家族发挥抗凋亡作用的机理是通过BIR功能区之间的连接序列直接与Caspases家族蛋白结合，抑制细胞凋亡的发生。多数IAPs的C末端还含有一个环指状结构域(RING-finger domain)能够与两个锌原子形成配位键。这一锌指结构对于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相关。只有包含BIR2功能区的IAPs蛋白分子才具有结合和抑制死亡蛋白酶的功能，单一BIR1， BIR3或环指结构以及它们的任意组合蛋白体均无此效应。 Ambrosini 等【4】测定并绘出了Survivin基因完整的基因图谱，全长14796 bp，位于距离端粒约3%的位置。Survivin 基因与EPR-1 基因的编码区序列高度互补，位于染色体17q25的同一基因族，含有3个内含子和4个外显子，编码产生1个由142个氨基酸组成的胞浆蛋白，分子量约为16. 5kD。Survivin只含有一个BIR区域，C末端有一个α卷曲螺旋结构，不含环指状结构域【5】。 Survivin是唯一具有剪接异构体的IAP基因，一个是序列中缺少外显子3的survivin-ΔEX3；另一个是把部分内含子2作为隐蔽的外显子的survivin-2B。两者序列的改变导致了相应蛋白质结构和功能发生了显著变化，survivin-ΔEX3仍保留抗凋亡特性，survivin-2B抗凋亡功能则显著下降[6]。2004年Badran A等[7]发现survivin的另一新剪接异构体survivin-3B，survivin-3B 含有5个外显子，比survivin多3B外显子， survivin-3B包含单一的BIR，这对于其抗调亡作用致关重要。最近，包含两个外显子，3'为197bp的内含子的survivin-2α发现【8】。其终止密码在第2内含子，编码产生74个氨基酸的蛋白质。survivin的剪接异构体的功能尚不清楚，初步认为survivin-ΔEX3与线粒体依赖性凋亡通路有关，另外，证实survivin-2α能减弱survivin的抗凋亡活性[7]。 Survivin的异构体如图1。

细胞凋亡蛋白的研究进展

【摘要】细胞凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一。细胞凋亡是个体发育过程中由一系列蛋白调控的细胞主动死亡过程，在保证多细胞生物健康生存的过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育具有重要作用。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要意义。其中bcl-2家族、caspase 家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，从而调控细胞凋亡．本文探讨了bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白对细胞凋亡的调控机制。 【关键词】细胞凋亡、 bcl一2家族、caspase家族、p53 蛋白、survivin 蛋白 引言 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡是多蛋白严格控制的过程，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了较为深入的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列蛋白的激活、表达以及调控等的作用。其中caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白和p53蛋白、survivin等在凋亡的信号转导中扮演着重要角色。 一、caspase家族蛋白 1.1 caspase家族蛋白介绍 caspase是半胱氨酸基天冬氨酸一特异性蛋白酶(cystei-nyl aspartate specific proteinase)即半胱氨酸天冬氨酸酶的缩写。Caspase半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族，也称为ICE/CED-3家族，是美丽线虫(Caenorhabditis elegans)死亡基因CED-3的同源物。这类蛋白酶与细胞凋亡形态学特征变化(如细胞膜空泡形成、核膜破裂、染色质聚集和边聚及DNA断裂等)以及一些生化改变关系密切。它们是一组存在于胞浆中的半胱氨酸蛋白酶，其共同特点是特异性断开天冬氨酸残基后的肽键。到目前为止，在小鼠和人类中，已经发现caspase家族至少有14个成员。细胞中合成的caspase以无活性的酶原状态存在，经活化后方能执行其功能。 1.2 Caspase分类 Caspase分为三大类：凋亡启动因子(apoptotic initiators)、凋亡执行因子(apoptotic executioners)和炎症介导因子(inflammatory mediators)，构成了级联放大效应。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,能在其它蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游的Caspase。如Caspase-8几乎能激活所有凋亡级联反应下游的Caspase而诱发凋亡。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。如Caspase-3，是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。炎症介导因子包括

凋亡途径

凋亡途径 三种凋亡途径：第一种称为外在途径(extrinsic pathway),由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因子受体家族(tumour necrosis factor receptor,TNF-R)引发;另一种称为内在途径(intrinsic pathway)或线粒体途径(mitochondrial pathway),由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始(Nicholson,1999;Denault和Salvesen,2003);第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化,从而导致凋亡 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族，前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner 或effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。 细胞中还具有caspase的抑制因子，称为IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）与caspase结合，抑制其活性，如XIAP。 Apaf-1被称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），在线虫中的同源物为ced-4，在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1含有3个不同的结构域：①CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9；②ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP；③C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c的结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c（Apaf-2）和caspase-9（Apaf-3）参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。 Bcl-2[5]为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白，其功能相当于线虫中的ced-9。现已发现至少19个同源物，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。 Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region ,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类（图15-7），一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。 虽然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，或者开启线粒体的PT孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase，导致细胞凋亡。 胞质中的促凋亡蛋白可通过不同的方式被激活，包括去磷酸化，如Bad；被caspase加工为活性分子，如Bid；从结合蛋白上释放出来，如Bim是与微管蛋白结合在一起的。 Fas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T 和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。 p53是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡，研究发现丧失p53功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导的调亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱导的调亡不敏感。 是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。 ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）是与DNA损伤检验有关的一个重要基因。最早发现于毛细血管扩张性共济失调

线粒体与细胞凋亡

线粒体与细胞凋亡 细胞凋亡是一种由基因控制的、细胞自主的、有序的死亡过程，与多种疾病的发生、发展均有直接或间接的关系。线粒体作为细胞内一类重要的细胞器，除了可以为生命的存在提供能量外，还参与了包括细胞凋亡在内的多种生理过程的发生。但是，对于线粒体和细胞凋亡之间的关系并不明确。因此，文章对两者之间可能存在的联系进行了总结和综述。 标签：线粒体；细胞凋亡；线粒体融合蛋白 细胞凋亡的紊乱与疾病的发生、发展有着直接或间接的关系：当细胞凋亡不足时，可能发生恶性肿瘤疾病或自身免疫性疾病等；而当凋亡过度时，则可能导致神经元退行性疾病、病毒感染等。总之，细胞凋亡的失调与疾病的发生密切相关。 1 细胞凋亡的基本概念及意义 生物体内的细胞是不可能永久性存在的，死亡是这些细胞的必然结局。然而，有些细胞的死亡是生理性的，有些则属于病理性死亡。目前，人类对细胞死亡的分类主要分为细胞凋亡与细胞坏死两种类型。近年来对细胞凋亡方面的研究越来越成为生理学、病理学等医学研究的热点。 细胞凋亡的过程大体上可以分为4个部分：凋亡信号的转导、凋亡基因的激活、凋亡的启动以及凋亡细胞的清除。如若这一系列过程中的任何一个环节出现了问题，就有可能导致疾病的发生。 2 细胞凋亡的重要相关因子 细胞凋亡的过程是多基因联合调控的过程，包括Bcl-2家族、Caspase家族、P53基因等联合发挥作用。随着医学的发展，人们对多种细胞的凋亡过程有了一定的认识：细胞的凋亡机制大致分为氧化损伤（即自由基的作用）、钙稳态失衡以及线粒体损伤三种。 许多生理性的死亡信号和病理性的细胞损伤都会产生程序性的细胞凋亡。细胞凋亡的途径主要有两条：一条是通过细胞外信号，激活细胞内的凋亡酶Caspase；另一条是通过线粒体途径释放凋亡酶激活因子从而激活Caspase。 细胞凋亡最典型的特征之一就是细胞内的特异性蛋白水解酶--胱天蛋白酶Caspase的激活。Caspase在细胞凋亡的执行中处于中心地位，其家族属于半胱天冬蛋白酶，相当于线虫中的ced-3。现有研究已经证实，细胞的凋亡过程本质上是Caspase蛋白水解酶不可逆的水解底物而进行的级联放大反应。 目前，尚未完全明确的是Caspase引起细胞凋亡的全部过程是如何发挥作用

与细胞凋亡相关的蛋白酶研究进展

摘要目前国内外许多学者都逐渐认识到细胞内蛋白酶与细胞凋亡密切相关，认为这些蛋白酶可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用。本文就这些蛋白酶的种类，底物及其抑制剂的作用作一综述。关键词：细胞凋亡；白介素1转换酶；蛋白酶 1 概述细胞凋亡是区别于细胞坏死的一种细胞死亡形式，它是在一定的生理和病理条件下，一种并不引起机体炎症反应的细胞程序性死亡（programmed cell Death, PCD）的过程。细胞凋亡这一概念最早由Kerr等提出的[1]，认为该种细胞死亡像秋天的树叶凋谢一样，故称谓“Apoptosis”，希腊文即凋亡之意。细胞凋亡在形态学和生化改变方面具有特征性。形态学改变包括细胞皱缩，染色质浓缩，核裂解成碎片，最终细胞膜及内质网膜将完整细胞器及碎片包裹成多个分散的凋亡小体。生化改变以往认为内源性核酸内切酶活性增加染色质核小体间DNA断裂是引起凋亡的一个启动因子，但有些具有细胞凋亡特征性改变的却没有染色质核小体间DNA断裂，有的甚至缺乏细胞核[1]，看来仅仅以此酶活性增加作为凋亡的启动因子，不能得到满意的解释。目前许多学者都着重于对细胞内蛋白酶的研究，认为这些蛋白酶可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用。研究依据为：（1）在细胞凋亡早期已发现特异的、可复制的细胞内蛋白的降解[2]。（2）某些蛋白酶抑制剂可抑制细胞凋亡的发生[3]。（3）部分病毒蛋白质作用类似蛋白酶抑制剂，可以抑制细胞凋亡[4]。（4）基因删除实验证明某些蛋白酶在细胞凋亡中起着主要作用[5]。 2 白介素1转换酶家族（ICE家族）在蛋白酶的研究中，研究得最早且最多的为白介素1转换酶（Interleukin 1 converting enzyme, ICE）是巯基蛋白酶的一种。ICE的作用是将无活性的31KD的前白介素1（在天冬氨酸羧基端降解为有活性的17.5KD的细胞因子。ICE由Black等和Kostura等[6]在1989年发现，此酶有高度的底物特异性。ICE高度表达导致细胞死亡，而ICE抑制剂如痘苗病毒CrmA可抑制由各种不同刺激因子诱导的细胞凋亡[7]。在线虫C.elegans的遗传学研究中发现1090个细胞中131个细胞出现了预定的细胞凋亡，调控该程序性死亡的基因已被确认。基因删除实验证明有2个基因ced-3和ced-4是引起细胞凋亡所必需的。尽管由ced-3编码的多肽其功能还不十分清楚，但这一分子显示与人类ICE有广泛的相同部分，ced-3蛋白与ICE有29%氨基酸残基同源性。ced-3蛋白最长的保护顺序QACRG含有ICE活性所必需的半胱氨酸。14C碘乙酰胺标记和晶体学研究[8]均发现ICE活性位于半胱氨酸残基，此基团在催化作用中起着关键作用。活性型ICE是一个四聚体，由两个20KD和两个10KD亚基因组成。它是由无活性型的45KD酶原在天冬氨酸-X连接处降解成20KD和10KD亚基。晶体学研究提示2个亚基均是酶活性所必需的[8]。由于ced-3蛋白和ICE间29%同源性促使对包括人类的哺乳类细胞凋亡过程中ICE作用的研究，已发现鼠成纤维细胞中ICE过度表达引起细胞凋亡。若涉及ICE催化活性半胱氨酸和甘氨酸基团突变，则导致催化活性和诱导转染细胞凋亡的功能的丧失。由ATP诱导的鼠腹膜巨噬细胞凋亡及亚胺环已酮及肿瘤坏死因子诱导的Hela细胞凋亡过程中均发现有成熟的白介素1释放[9]，提示ICE在细胞凋亡中被激活。目前对于与ICE活性有关的特异性底物还不十分清楚。随着研究的不断深入，ICE家族成员不断扩大，统称为ICE同类物（ICE homologues）。包括：1）Nedd-2，最初从鼠大脑细胞发育早期一组基因中发现的，后在人胎儿大脑细胞cDNA库中分离得到相同的基因，命名为Ich-1（即ICE和ced-3同类物-1），其编码蛋白顺序与ICE和ced-3相同[10]，Ich-1有两种不同的mRNA即长Ich-1和短Ich-1。长Ich-1过度表达诱导细胞凋亡。而短Ich-1过度表达抑制细胞凋亡。Ich和ICE相比不易被CrmA抑制[10]。2）CPP32与ced-3同源性为35%，与ICE同源性为30%，其在真核细胞内的表达能诱导细胞凋亡。CPP32又称为YAMA和apopain。CPP32的底物特异性不同于ICE。前者在P1-P4位点偏向性为四肽DEVD＞YVAD，而后者偏向于YVAD。前者易被DEVD-醛所抑制，后者易被YVAD-醛抑制。CPP32能降解多二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP），ICE及长Ich-1并不降解PARP。3）TX（亦称为ICErelⅡ或Ich-2），与ICE有50%同源性，与ced-3有30%等同性[12]。该酶亦为巯基蛋白酶，能催化降解30KD的ICE前体变为有活性的ICE[12]。TX