蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进)

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami(DE3）、Bl21 codon（DE3)等。

7、蛋白的诱导表达。

1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM

到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体

蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10％甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60％,使用时自己计算用量。

4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度，低转速（140—180rpm)，

诱导过夜作为包涵体检测样品.

注意:1。如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.

保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。方案见附件2

9、如有上清表达，则扩大摇菌。

1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD〉=1.5，约5h左右,视菌种

的活性而异,也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右（约

2.5h~3h）,然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注:菌液浓度要适当

的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢.

拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是,将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。

3)过夜摇菌，使用包涵体检测的温度(18°左右)，转速140rpm左右。

4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体.加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓

冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml 的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用,用完后洗净保存。

10、超声波裂解.

1)用6mm变幅杆,35％功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。

注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3。要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。

4.正常声音为:孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头

松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成(后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5。超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关）.

注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）,PMSF 工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解

60分钟,60分钟足够裂解。

11、取得上清

1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm,15min,4°离心。沉淀为包涵

体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀.（此时可以测量一下pH值,pH值最好在7.5左右.平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在7.5左右.）

12、纯化上清-——摸洗脱条件。

1)镍柱处理.将1ml镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。(若是流

速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。)取20μl过柱后的样品，以备跑胶.

3）分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别

的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP 管中，以备跑胶。

注意:理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度,直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱.实际上测不到零,怎么都会有一点的,上面说的量已经做够洗脱了。

4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml(将前面的0.5ml单独接入EP

管，再将后面的4ml接入另外两个EP管)，留跑胶样品。

5)加MES将NI柱重生.MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O.流完后保存于2

倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。(尿素可能对NI柱有损伤。）注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大.镍柱所用溶液MES的ph=5。0，其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7。

2.

13、跑胶验证。

1）跑2块0。75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相

同两块胶才会比较一致。

2）跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、

W7、W8、W9、E1、E2、MES

3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右.（也可以300V,30min，只是

图没有160V好看。）

4）考马斯亮蓝染色.一般染色2h即可。

5）脱色.先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。

14、纯化上清—--收集目的蛋白

1)将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml)。

2)重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

15、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V）,保存好.

16、透析。

1)配制2L透析液(配方见附件1）,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2)透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗净。

3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其

中，置入提前预冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl）中.冰浴下轻微磁力搅拌20min 后置入4°冰箱1。5h后换液。透析3次即可。

注意:用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。

17、浓缩.

1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋.

2)30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。

3)每隔10min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩.

4)透析袋用完后，洗净，保存于20％乙醇中4°存放。

注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高,不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到,可根据自己估计的蛋白量留1-2ml 体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分装后—20度保存。

18、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。

1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2)配平。

3)7400g,30min,4°离心,结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择

不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数.可以几次的Elution液一起浓缩.

4）加入需要的蛋白储存液至4ml,离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl

溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1％-5%即可)助溶。5）收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分,蛋白名称,蛋白

浓度（测量后）,制备日期.

注：超滤管的使用方法见附件4

19、蛋白浓度测定.见附件3

20、蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。

21、抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

22、注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

23、收集免疫血清。提取抗体。

24、抗体效价评定.

附件1

所需溶液配方:

1）20 mM PBS：20 mM sodium phosphate，300 mM NaCl pH 7.4

试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4—12H2O NaCl

用量(g）1L 0。5928 5。802192 17.532

2）Equilibration Buffer（平衡缓冲液）: PBS with 10 mM 咪唑pH 7。4

3)Wash Buffer(清洗缓冲液): PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH 7.4

4）Elution Buffer(洗脱缓冲液）：PBS with 250 mM 咪唑pH 7.4

5）MES（再生缓冲液): 20 mM 2—(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0。1 M sodium

chloride；pH 5.0。即0.3904g MES+0.5844g NaCl.

6)透析袋处理液：2%（w/v)碳酸氢钠和1 mmol/L （pH8.0）EDTA

7）透析液:20mM PBS+50 mM NaCl(2.92g)

试剂名称NaH2PO4—2H2O Na2HPO4—12H2O NaCl

用量(g)1L 0。5928 5.802192 2.92g

TIPS:1-4的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑.再配1L的PBS，用500ml水将

试剂溶解,取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer,再向其分别加入适当体积的8M咪唑.最后,定容.Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml，Equilibration Buffer配了300ml。PBS配了500ml。

附件2

包涵体检测

1。摇10ml菌，加0。5%葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0。5后离心加入新的培养基和相

应浓度的IPTG低温(16—25度)诱导过夜（也可不离心，在原来LB中直接加IPTG）.在离心前取500μl菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解,直接煮沸10min跑胶。

2。诱导完成后,用2ml EP管6000rpm,2min，4度,收集10ml菌液。1。5ml PBS (50m M PBS,300m M NaCl )重悬细菌。

3.裂解细胞.用超声波破碎细胞直到悬液变清亮,一般15到30min。裂解3s，停止6s,

裂解时冰上放置。

4.分离上清。5000rpm,4min,4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm，

10min，4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中,加5微5*SDS loading buffer混匀,煮沸10min.

5。重悬包涵体。用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微

5*SDSloading buffer,煮沸10min。

6.正负对照的收集。离心收集正负对照菌体,0。5ml上清留下40μl，加入10μl5*SDSloading buffer,煮沸10min裂解.

7。跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是: —,+，上清，包涵体。附件3

蛋白浓度定量测试方案

1。将染色剂稀释。

稀释5倍,取4ml染色剂于50ml离心管中,加16ml miliq H2O。充分溶解后用0。44μm 的滤膜过滤于另50ml离心管中。(此剂量可测4个样品。）

2.牛血清白蛋白(BSA）标准品的制备

1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400—500μl/支（可以室温放置60天,—20度长期保存）.

2）将1mg/ml的BSA分别稀释成0。2、0.4、0.6、0。8mg/ml,各180μl,另外加一管水为3.染色。

1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品)1.5mlEP管中。4个

梯度各做一个重复,共8支，另外加1个样品(或1+n个样品)和1个blank,共10支EP管(或10+n支），分别对应标记。

2)将30μl样品和30μl标准BSA及30μl H2O分别加入上述EP管中。涡旋混匀.

3）室温孵育5min到60min。5min后即开始测量，在60min内测完,越快越好,因为Absorbance wil increase over time。

4。吸光度的测量.600nm处测量,并记录吸光度.注意:1. blank是染色液加30微升的水.

2.从低浓度测量到高浓度.根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample 的测量顺序。

5。比色皿的洗涤.用100%乙醇浸泡洗涤.

6。标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。

附件4。

4ml millipore超滤离心管使用注意事项

1。用前用miliq 水润湿。

2。4度预冷。

3。离心力不能超过7500g.加速度设定为8.

4。离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一致。

5。使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml 0。1N NaOH泡24h，后加入1ml20%乙醇保存. 如果要短期保存几天,也可加水浸泡。

附件5

聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法

附件6。

包涵体蛋白的提纯

与提上清中所用试剂不同之处：在Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer 中各加了6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后,离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片,再10000rpm15min离心,沉淀就是包涵体。用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体.后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中都含有6M尿素或盐酸胍.另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶。这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶.

如果要做包涵体,建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大,必须除去,除去后蛋白可能就析出了。尿素毒性相对较小，可以不用除去。这样可以省去很多麻烦。尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解,可以用超声波破碎仪帮助溶解：6mm变幅杆,15%功率, 3s/6s，10min 左右即可。也可以加上1％———5％的甘油助溶。甘油是加在Equilibration Buffer 中的。

另外,做包涵体可以直接37度快速摇菌,无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0。6左右。

乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE

1、1。5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl 100％乙醇,乙醇要-20度预冷，涡旋.

2、—20度放置10min。4度,15000rpm,10min,小心弃去上清，尽量去干净。此时管底可

见蛋白沉淀。

3、向管中加30μl 1。5*SDS-loading buffer。（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍)。

4、上样，跑胶。

如有错误，敬请批评指正。

血清的提取

动物血采集后，室温自然凝固后立即4500g，10min离心,分离出血清。

抗血清保存有三种方法：

第一种是4℃保存,通常可保存3个月～半年,效价高时可保存一年左右；第二种是—20℃～—40℃低温保存,可保存5年左右，但需防止反复冻融;

第三种是真空冰冻干燥保存，可保存5～10年。

注：耳缘静脉采血，为防止溶血请勿吸取流到外面的血，直接从静脉吸取的血液不会溶血。

蛋白纯化步骤

蛋白纯化步骤 引言： 蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。 一、细胞裂解和收集 蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。 二、沉淀和上清液分离 细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。 三、蛋白质分子量筛选 蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。

四、亲和纯化 亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。 五、离子交换层析 离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。 六、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。 七、逆流层析 逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、 Bl21 codon（DE3）等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。 4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤 引言: 蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。 一、样品制备 在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。 二、离心 将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。 三、初步分离 将离心后的上清液取出，进行初步分离。可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。 四、亲和层析

亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。 五、凝胶电泳 凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。 六、柱层析 柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。 七、透析 透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。 八、浓缩 浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因 c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至 OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25 μM到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上 即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。 注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的 粗大的条带。

动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000 转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5. 超声波破碎仪工作30分min要休息5min （即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降 解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂 （PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不 能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解 60分钟，60分钟足够裂解。 8、取得上清 1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。 10000rpm，15min，4°离心。沉淀为 包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻 轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。 （此时可以测量一下pH值，pH值最 好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8 左右，裂解后上清就会在7.5左右。）9、纯化上清---摸洗脱条件。 1）镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，

蛋白质的表达、分离、纯化实验流程

蛋白质的表达、分离、纯化实验流程 蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。 实验步骤 一：材料准备 1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠 2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒 二：实验操作 1.试剂准备： 2. 2. 获得目的基因 ①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。 ②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。 3. 构建重组表达载体 ①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。 ②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。 4. 获得含重组表达质粒的表达菌种 ①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 ②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 ③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。 5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 ①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。 ②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。 ③对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG 至终浓度0.5 mmol/l，37 ℃继续培养1～3 h。 ④12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20 ℃或-70 ℃冰箱中。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami(DE3）、Bl21 codon（DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10％甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60％,使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度，低转速（140—180rpm)， 诱导过夜作为包涵体检测样品. 注意:1。如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD〉=1.5，约5h左右,视菌种

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程 丁香园chrispp作品。 一、证明目的蛋白有表达 1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。 2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB 中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。 3、取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养4h。 4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。 结果如下：图1 1: pET-32aA3未诱导，2: pET-32aA3未诱导，3: pET-32aA3诱导后，4: pET-32aA3诱导后 二、表达的情况，是可溶还是沉淀 1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl 溶液洗菌。 2、将重悬于0.9% NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9% NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。 3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下 功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加dna 酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开） 4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。 结果如下：图2

蛋白表达纯化的实验原理

蛋白表达纯化的实验原理 蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术，可以用来研究和生产各种蛋白质。本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。 第一步：蛋白表达系统的选择 蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。 第二步：构建表达载体 表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中，以实现蛋白表达的工具。通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割，然后与适当的载体连接。 第三步：细胞转染或感染 将构建好的表达载体转染到细胞中，使目标蛋白基因在细胞内进行表达。对于真核细胞（如哺乳动物细胞）可以通过转染的方式传递质粒DNA，而对于原核细胞（如大肠杆菌）可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。 第四步：培养表达细胞 转染或感染后，需要将细胞培养到合适的条件下，以促进目标蛋白表达。

培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。此外，可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂，以调控蛋白表达的级别。对于细菌目标蛋白表达，通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。 第五步：蛋白表达检测 为了确定目标蛋白是否在细胞中表达，可以使用多种方法进行检测。常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。同时，可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。 第六步：蛋白纯化 蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。此外，还可以使用亲和标签（如His标签、GST标签等）来辅助蛋白质的纯化。 第七步：蛋白质的鉴定和定量 通过蛋白纯化后，需要对目标蛋白进行鉴定和定量。可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。同时，可以使用比色法、荧光法或质谱法等方法进行蛋白质的定量。 第八步：蛋白质的功能分析

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进） 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA. 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA。 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami（DE3)、Bl21 codon（DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围. 甘油是用0。22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%—60%,使用时自己计算用量. 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度,低转速（140-180rpm）, 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1。如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1％的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测.方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右,视菌种 的活性而异，也可过夜摇菌. 2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1。0左右(约 2.5h～3h)，然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度.）注:菌液浓度要适当 的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度(18°左右)，转速140rpm左右。 4)将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓 冲液重悬.每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml 的离心管同时离心,但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存. 10、超声波裂解. 1）用6mm变幅杆,35%功率，3。5s工作,7s休息，50min即可. 注意:1。要冰浴.2。要随时观察裂解情况以防意外.3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4。正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因,要及时调整.溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成(后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好)。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关)。 注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）,PMSF 工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解 60分钟,60分钟足够裂解.

蛋白表达纯化实验步骤

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蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、 Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤 (待改进 ) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD!扩增获取目的基因 c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET2832等表达载体。 5、转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株 ,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、 Rosetta gami(DE3)、 BI21 codo n(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1) 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至 OD=0.6左右，加入IPTG浓度梯度从25卩M 到1m M。 37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2) SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的 50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3) 将有表达的菌株10%甘油保种保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22卩m过滤除菌的，储存浓度一般是 30%-60%,使用时自己计算用量。 4) 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导 10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加 IPTG 之前的培养基中加入 1%的葡萄糖用来 抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。 2. 保种可以取一部分分成 50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件 2

9、如有上清表达，则扩大摇菌。 的活性而异 ,也可过夜摇菌。 2）将上一步中的 8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h~3h）,然后加IPTG浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注:菌液浓度要适当 的浓一些 ,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动 ,看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是 ,将手指放在瓶底晃动 ,看不清 手指为宜 ,不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌 ,使用包涵体检测的温度（18°左右）,转速 140rpm 左右。 4）将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。加入 20mM PBS,洗一遍后用平衡缓 冲液重悬。每 250ml 菌液用 30 ml 到 50ml 平衡缓冲液 ,视菌液的浓度而定。可用 4 支 50ml 的离心管同时离心 ,但是 ,离心管要重复使用 ,用完后洗净保存。 10 、超声波裂解。 1）用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。 注意:1.要冰浴。 2.要随时观察裂解情况以防意外。 3.要将探头探入到溶液中下部 ,尽量不要打 出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4 .正常声音为 :孜孜声 ,尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因,要及时调整。溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000 转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5•超声波破碎仪工作 30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。 注意 : 1 .如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）,PMSF 工作浓度为 1%。 2.如不能判断是否裂解完全 ,就按上述条件裂解 60 分钟 ,60 分钟足够裂解。 11、取得上清 1）将破碎好的溶液收集到50ml 离心管中。 10000rpm,15min,4 °离心。沉淀为包涵 体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值,pH 值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在 7.5左右。）