核酸体外扩增技术
核酸体外扩增技术
陈庆山
* 刘春燕 刘迎雪 刘海燕 陈立君 付 尧 单继勋 郭 强 张丽娜
(东北农业大学大豆研究所 哈尔滨 150030)
摘要 核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。根据其特点可分为两类:一类是靶核酸的直接扩增,如聚合酶链式反应、链替代扩增、连接酶链式反应、核酸依赖的扩增、Q 复制、转录介导的扩增和滚环扩增等;另一类是信号放大扩增,如支链DNA、侵染探针等。就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。
关键词 核酸体外扩增 靶核酸直接扩增 信号放大扩增
核酸分子体外扩增技术是开展分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,建立一套灵敏、快速的核酸扩增技术一直是研究工作者探讨的问题。在聚合酶链式反应(PCR)以其灵敏性、特异性和快速性而广泛应用的基础上,新的核酸扩增模式也不断涌现。现有核酸扩增技术根据其特点可分为两类:第一类是靶核酸的直接扩增;包括聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和核酸依赖的扩增(NASB A)、Q 复制、转录介导的扩增(TMA)和滚环扩增(RC A)。另一类是信号放大扩增;包括支链DNA(bDNA)、侵染探针(Invader)和滚环扩增(RCA)等[1]。其中滚环扩增是一种既能直接扩增靶核酸,又能实现信号放大扩增的方法。根据是否需要温度循环也可分为两类:一类是非等温扩增体系,如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)等。另一类是等温扩增体系,如链替代扩增(SDA)、核酸依赖的扩增(NASBA)、支链DNA(bDNA)、滚环扩增(RCA)、Q 复制酶系统。本文根据扩增特点将各种核酸扩增技术进行总结,见表1。
收稿日期:2004 01 12 修回日期:2004 03 01 *电子信箱:qs hchen@s https://www.sodocs.net/doc/f818381739.html, 表1 核酸扩增技术的特点
核酸扩增分类
特点
DNA扩增RNA扩增D NA信号放大R NA信号放大蛋白质信号放大体内扩增微阵列上扩增非等温PCR++---+-
扩增LCR+------
靶核酸SD A++----+
直接NASBA++-----
扩增
等温扩增
TMA++-----
Q 复制-+-----
R CA+++++++
信号放大扩增
bDNA--++---等温扩增Invader--++---R CA+++++++
1 靶核酸直接扩增
1 1 聚合酶链式反应(PC R)
自1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应,使体外无限扩增核酸片段得以实现[2]。PCR现已广泛用于DNA的扩增。随着技术手段的进步,PC R技术家族也不断涌现出新成员,其中有简并PCR、复合PC R、反向PCR、锚定PCR等百余种。
聚合酶链式反应是应用一对寡核苷酸引物结合到正负链上的靶序列两侧,从而酶促合成多个拷
第24卷第5期中 国 生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTEC HNOLOGY2004年5月
贝的靶序列DNA片段。PC R的每一循环都包括DNA变性,引物复性和由DNA聚合酶催化的延伸反应。每次循环新合成的DNA片段又可成为下次循环的模板,这就导致靶序列DNA的指数扩增。经20~30次循环可使靶序列放大百万倍左右。
随着PCR种类的增加,PCR技术也被应用到生物技术的各个方面。例如利用PCR技术在靶序列中引起突变,这是由于PCR反应可以耐受引物和靶序列间某种程度的错配。现已用PC R产生替代、缺失或插入突变,也可以在靶基因中引入一新的限制性酶切位点。利用反向PCR扩增已知序列以外的未知序列,现已用该技术扩增已知目的启动子区序列。利用不对称PCR产生大量的单链DNA,用于核酸的序列测定。利用多重PCR同时扩增出多个核酸片段,以检测多种病原微生物等等。
1 2 连接酶链式反应(Ligase Chain Reaction,
LCR)
连接酶反应是Backman于1987年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明的。Barany于1991年报道了耐热连接酶 Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用,为LC R的实用化奠定了基础[3]。LC R识别点突变的特异性高于PCR,这是由耐热连接酶的特异性决定的[4]。若靶序列有点突变,引物不能与靶序列精确结合,缺口附近的核苷酸空间结构发生变化,连接反应不能进行,也就不能产生扩增产物。
LC R技术是利用DNA连接酶连接预先形成的DNA片段,经变性、退火和连接三个步骤的反应温度循环,从而使目标DNA大量扩增。LCR首先利用两对分别互补的寡核苷酸引物与变性的靶序列结合,然后DNA连接酶补平缺口,完成一个反应循环,连接产生的两个模板,都在下次循环中再作为连接模板,这样,经20~30次循环的反应就可产生百万拷贝的目的序列。
目前该方法主要用于点突变的研究与检测,微生物病原体的检测及定向诱导等,还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断,微生物的种型鉴定和癌基因的点突变研究等。
1 3 链替代扩增(Strand displacement
amplification,SDA)
链替代扩增是恒温扩增DNA的一种新型方法,主要是依赖于限制性内切酶和DNA聚合酶两种酶的共同协作来完成[5]。由于链替代扩增所需的靶分子为单链DNA,同时靶分子还要与引物结合形成两端均为5悬端的结构,所以在进行SDA反应前应先对靶分子进行处理。链替代扩增的原理是首先用含有HincII识别位点的SDA引物与单链靶分子结合,在5-3外切酶活性的DNA聚合酶的作用下,以dC TP、dGTP、dTTP、dATP[ S]( 磷酸硫酸化三磷酸腺苷)为底物聚合形成具有半磷酸硫酸化位点的DNA双链。用HincII切割未保护的引物链,而被修饰的靶片段则保持不动。这时再由DNA聚合酶在切口处启动延伸并取代下游部分,这种聚合过程又重新产生了一条新的可以被HincII打开切口的DNA单链,而靶DNA分子仍保持不动。这种打切口、聚合、取代的步骤不断循环反复,产生大量靶分子的互补链。
SDA的优点是灵敏性高,可快速扩增获得单链DNA分子,但SDA由于其靶序列准备的复杂性限制了其应用范围。最早采用SDA方法检测结核杆菌IS6110基因,首先将全染色体或含有该基因的重组质粒进行一次RsaI酶切,得到的片段可用作SDA反应的靶分子。现已有研究工作者改进了靶分子准备程序,使其更有效。目前该方法已应用于细菌的检测、建立体外进化模型、核酸定量及芯片杂交等多个方面。
1 4 核酸依赖的扩增(Nucleic acid sequence based
amplification,NASBA)
1990年首次提出的由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。反应在42!进行,扩增速度与PCR一样快,在3小时内可扩增1000万倍[6]。
NASBA反应是由AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶3种酶共同协作完成的,标准的NASBA反应体系除以上3种酶外,还应有脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、核糖核苷三磷酸(NTP)、2个特殊的引物和适宜的缓冲液。其中引物I3端与靶序列互补,5端具有被T7RNA聚合酶识别的启动子序列,引物II的5端序列与靶RNA序列相同[7]。NASB A整个反应分为两相:非循环相和循环相。如开始用RNA靶序列,反应将如此进行:首先,5端含有RNA聚合酶启动子序列的引物I与靶序列复性,并由反转录酶催化产生一cDNA链,以RNase H降解新生成的双链螺旋中的RNA,这样
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第5期陈庆山等:核酸体外扩增技术
生成了带有启动子序列的cDNA,以上称为非循环相。然后,引物II与裸露的c DNA复性,进行第二链的合成,启动子序列变为双链。这时,RNA聚合酶可以合成一反义原靶序列的多个拷贝启动子序列。反过来,它们又可作为反应循环相中c DNA合成模板,继续合成反义原靶序列RNA。
NASB A的特点是操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环,整个反应过程由3种酶控制,循环次数少,忠实性高。由于反应不需高温变性步骤,所以NASB A不会受到双链DNA的污染。同时由于外来双链DNA无T7启动子序列,不可能被扩增,这就大大提高了NASB A反应的特异性。NASB A均一地等温扩增特性扩大了它的应用范围,技术适于检测和定量特异RNA,并且用NASBA也可以应用于扩增双链DNA。
1 5 Q 复制
Q 复制是依赖于Q 复制酶(Q beta replicase)可以指数式放大重组DNA分子。Kacian等于1972年首次报道了Q 复制酶催化RNA模板的自我复制功能[8]。它能在常温30min,将其天然模板MDV 1RNA扩增至109。Q 复制酶是噬菌体Q 中RNA 指导的tRNA聚合酶,MDV 1RNA是Q 复制酶的天然模板。该酶是异源多聚体,由自身编码的亚基及3个宿主蛋白构成,这3个宿主蛋白为核糖体蛋白S1和延长因子Tu(EF Tu)和Ts[9,10]。
Q 复制酶有以下4个特点:(1)不需寡核苷酸引物的引导就可启动RNA的合成[11]。(2)能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的RNA折叠结构。(3)在大量寄主RNA存在的情况下,仍特异地复制病毒RNA。(4)在Q 复制酶天然模板MDV 1RNA的非折叠结构区插入一段短的核酸序列不影响该酶的复制,因而,如在此区插入待测序列,则其序列同样可被Q 复制酶扩增。
有的研究通过构建含有MDV 1RNA序列的重组体,在其特定位置插入待测序列,这样重组体的RNA分子被用作探针与互补的cDNA杂交,或作为RNA合成的模板得到大量扩增。该技术已应用在增加探针检测敏感性上。
1 6 转录介导的扩增(Transcription mediated
amplification,TMA)
转录介导的扩增是利用RNA聚合酶和反转录酶在等温条件下扩增目的DNA或RNA的扩增方法。转录介导的扩增是Kohne于1986年研究报道的[12]。
TMA系统由样本的制备、扩增和检测3部分组成。TMA扩增需要2个引物和2种酶:RNA聚合酶和反转录酶。一个引物带有RNA聚合酶的启动子序列。首先,5端有启动子的引物与目标片段结合,反转录酶催化合成cDNA链,形成RNA:DNA杂交体。由于反转录酶同时具有Rnase H的功用,水解掉杂交体中的RNA。另一引物与DNA单链杂交合成具有启动子序列的双链DNA模板,RNA聚合酶以此双链DNA为模板转录出与待检RNA互补的RNA链,这些RNA又进入下轮循环。
TMA操作简便,因不需要温度循环,只需在恒温器或水浴锅中进行就可以。TMA的主要特点是扩增效率高,在1小时内可将目的基因扩增百万倍以上。另一个特点是特异性高。最近研究表明,该方法用于HIV的定量检测,灵敏度高于RT PCR和bDNA方法[13]。TMA主要用于RNA扩增。
1 7 滚环复制(Rolling circle amplification,RC A)
滚环复制是一种新的扩增方法,既可以进行靶基因的扩增又可以用于信号放大扩增[14]。RCA分线性和指数扩增两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后,在DNA聚合酶的作用下被延伸,产物是具有大量与环状DNA互补的重复序列的DNA单链。线性RCA只适用于环状核酸的扩增。例如环状病毒、质粒和环状染色体。线性RC A 是产生与原始引物相连的单链扩增产物的唯一方法。
指数RC A与线性RC A相似,它采用了第二种引物。该引物序列与环状DNA序列完全一致。在RC A循环中,此引物与第一次线性RC A产物结合并在聚合酶的作用下延伸,其产物又作为第一种探针的模板,这样一来产物呈指数递增。指数RC A 也可用于非环状DNA的扩增。设计一个引物,其两端可结合到一段连续的序列上,并形成缺口,在连接酶的作用下,引物被连接成环状,此环状引物作为RCA的模板进行指数扩增。Thomas等[15]实验证实其灵敏度可达到10拷贝,在1h内可扩增107倍。该方法可直接应用于突变检测和SNP的检测。
2 信号放大扩增
随着生物学研究领域的不断拓展,常常会遇到对待检分子不能直接扩增,但又由于其浓度较低而
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无法检测的情况,因此信号放大扩增对检测前不能进行直接扩增的低浓度分子的检测显得尤为重要。例如对蛋白质、脂类和糖类物质的检测。通过比较,信号放大扩增产生假阳性的频率要低于目标片段直接扩增。这就使信号放大扩增应用到更多的研究领域。
2 1 支链DNA信号放大系统(Branched D NA,
bDNA)
支链DNA信号放大系统的信号扩增是依据许多带有碱性磷酸酶标记的探针杂交结合到树枝状的DNA枝状体上实现的。bDNA技术首先采用带有特定寡核苷酸片段的固体平台,待测分子与这些寡核苷酸片段结合,然后再加入与待测片段杂交的探针。该探针结合有60~300分枝不等的寡核酸枝状体,最后碱性磷酸酶标记的探针杂交结合到这些树枝状核酸枝状体上,在碱性磷酸酶的发光底物1,2 二恶二酮的诱导下使其化学发光,通过对发光强度的检测对待测分子进行定量检测。
支链DNA信号放大系统的主要优点是高灵敏度、检测范围大和准确定量三方面[16]。如果体系构建正确,甚至可以对单分子进行有效检测。支链DNA信号放大系统已广泛应用于HIV、HCV和HB V 等人类疾病的检测。
2 2 侵染探针技术(Invader)
Invader分析是美国三波技术公司开发出来的,该技术使用一个耐热的、结构特异的内切核酸酶,它根据结构而不是序列在特殊位点上切割核酸分子。是一种等温非?PCR#的DNA和RNA定性和定量检测方法[17]。可简单、快速、准确检测基因突变和单核苷酸多态性(SNPs)。
Invader体系包括两个特定的寡核苷酸片段作为探针,侵染探针和信号探针[18]。信号探针3端序列与目标片段完全结合杂交,其5端带有荧光标记并因不能与目标片段结合呈翼状突出。侵染探针和信号探针与目标DNA杂交重叠的部分(重叠至少一个碱基)产生特定结构。这种特定结构将被内切核酸酶识别并将信号探针突出的5端翼剪切,剪切后的信号探针与目标DNA解离。并有新的信号探针重新与目标DNA杂交结合,随后也被剪切解离。而在含荧光共振能量传递的通用报告系统(FRE T)的寡核苷酸探针上发生的第二次侵入裂解反应中,释放的5翼又充当了另一个侵入寡核苷酸,再次形成侵入结构。第二个侵入切割反应进一步放大靶特异性产物。FRET探针的5端标有染料Q着色的淬灭基因F。切割下来的5 荧光素标记产物用荧光板读取器检测,其荧光强度与靶分子量成正比。
Invader体系可以直接从基因组DNA中检测目的基因,而无需进行PCR扩增。Invader方法方便快捷同时具有很高的灵敏度,经常用于实时监测。此外,该体系适用于大范围检测基因组单核苷酸多态性,因为碱基错配可抑制内切核酸酶的识别与剪切,用于基因突变的研究报道结果与等位基因特异性PCR一致[19]。
2 3 滚环复制(Rolling circle amplification,RC A)
线性滚环复制可以用于信号放大。当线性RC A被用于信号放大扩增时,可以做到固体状态下直接扩增,并可给产物准确定位[15]。Schweitzer 等[1]建立了免疫RC A,引物的5端标记有抗体,抗原抗体反应后,加入RC A反应组分与环状DNA模板进行RCA,然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交,最后对荧光信号进行检测。该方法的灵敏度可达0 1pg ml。最近研究表明,线性RC A信号放大扩增已在微阵列方面得以应用。对于2D或3D的DNA阵列,RCA可将杂交信号或荧光标记探针信号放大104倍。实验证明,采用RC A的蛋白芯片对血清中I gE进行检测要优于传统的免疫阵列。
3 结 语
核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段。随着科学的发展和研究目的的不同,出现了越来越多的核酸分子体外扩增技术。但目前看来,聚合酶链式反应(PC R)还是主导技术,在各类实验中起着重要的作用,大多数生物技术分析和研究还都将使用PCR技术。在病毒检测和遗传病点突变检测方面,连接酶链式反应(LCR)、支链DNA信号放大系统(bDNA)和侵染探针技术(Invader)有独到之处,可以弥补PCR技术的缺陷。核酸依赖的扩增(NASB A)和转录介导的扩增(TMA)可以用于快速准确检测和定量分析RNA,Q 复制可以用于检测目的DNA片段。总之,这些技术各有所长,可以满足不同研究的要求。因而在研究中要根据实验目的和现有条件,选择适当的扩增技术。
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Progress of Nucleic Acid Amplification Technologies
C HE N Qing shan LI U Chun yan LIU Ying xue LIU Hai yan C HE N Li jun
FU Rao SHAN Ji xun GUO Qiang ZHANG Li na
(Institute of s oybean research,Northeast Agricultural Universi ty,Harbin 150030,China)
Abstract Nucleic acid amplification is the base of the study of molecular biology.With the development of biotec hnology,more and more technology of nucleic acid amplification has been emerged.There are two kinds of nucleic acid a mplification based on the amplification characteristic of these technologies.One is the target a mplification,including Polymerase Chain Reaction(PC R),Strand displacement amplification(SDA),Ligase Chain Reaction(LCR),Nucleic acid sequence based a mplification(NASBA),Q replicase,Transcription mediated a mplification(TMA)and Rolling circle a mplification(RCA);the other is the signal amplification,including Branched DNA(bDNA)and Invader et al.The theories,characteristics and applications of these amplification technologies were introduced.
Key words Nucleic Acid Amplification Target Amplification Signal Amplification
14中 国 生 物 工 程 杂 志第24卷
恒温扩增技术综述
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。 关键词：恒温扩增；PCR 引言： 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增 1. 1 滚环核酸扩增的原理 滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA 原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针 的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。指数RCA 可用于非
北京市第二类体外诊断试剂临床试验指导原则(2016年版)
北京市第二类体外诊断试剂临床试验指导原则（2016年版） （征求意见稿） 本原则适用于指导北京市第二类体外诊断试剂检测方法等效性临床研究，对临床试验机构和参比系统的选择、样本要求、临床实验方案、临床试验数据分析等提出了一般性要求。申请人应在完成产品分析性能评估、拟定产品标准后，方可申请该产品的临床评价。临床评价开始前，申请人应根据产品特点及使用目的，确定临床评价的项目和方法，制定合理可靠的临床评价方案。 申请人应根据国家相关法律法规、标准及技术指导原则的要求合理评价产品的安全性和有效性。 一、临床试验机构的选择 临床评价开始前，申请人应根据申报产品特点选择临床试验机构。临床试验机构应当具有与申报产品相适应的条件及能力。试验机构的选择应符合以下要求： （一）应选择至少两家获得国家食品药品监督管理总局资质认可的医疗机构。医疗机构的临床实验室（简称实验室）应符合《医疗机构临床实验室管理办法》（卫医发〔2006〕73号）的要求，并优先考虑经中国合格评定国家认可委员会（CNAS）依据《医学实验室质量和能力认可准则》（CNAS-CL02等同ISO15189）或《检测和校准实验室能力认可准则》（CNAS-CL01等同ISO17025）认可的实验室。 （二）实验室应有完善的室内质控程序，并应优先选择连续两年以上室间质量评价相关专业结果合格的实验室。整个实验过程都应处于有效的质量控制下，并有措施保证试验数据的准确性及可重复性。 （三）实验室的检测人员应具有相应资质（项目负责人至少具有相关专业中级或以上技术职称）。 （四）实验室应有能力提供临床评价所需的各类样本。
（五）临床试验必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。 二、参比检测系统的选择 以下将申报产品的检测系统称为考核系统，所选择的对照检测系统称为参比系统。 （一）实验室应保证所用检测系统的完整性和有效性。考核系统和对照系统的主要分析性能指标（如准确性、精密度、线性范围等）应满足临床要求。 （二）参比系统的试剂、仪器、校准品均应已取得医疗器械注册证；考核系统的仪器、校准品应已取得医疗器械注册证或与考核试剂同步注册，且进度基本一致。 （三）参比系统应选择与考核产品方法学原理相同（如同为酶联免疫反应、同为化学发光免疫反应等）或相似的，其方法学分析性能应优于或近似于考核产品。 （四）对于定量产品，参比试剂的性能技术指标（如线性范围、精密度等）应与考核试剂近似或更优，两者的参考区间不宜差别过大；对于定性产品，两者检出限/临界值应基本一致；对于半定量产品，两者的分段区间应基本一致。 （五）定性产品可选性能更优的半定量或定量产品作为参比试剂（统计数据时应先将定量/半定量测试结果按照其自身说明书中确定的参考区间/临界值分别划归阴性、阳性结果后，再进行两个试剂测试结果间的等效性分析）。同理，半定量产品可选择定量产品作为参比试剂。 三、试验样本的选择 （一）应明确临床样本要求，考核系统与参比系统所用样本及其要求应一致。应注明样本采集、预处理、保存、输送的要求及条件（如明确采血管种类、抗凝剂要求等）。 注：推荐使用新鲜样本，如果使用贮存样本时，应注明贮存条件及时间，在数据分析时应考虑其影响并说明。
体外生物测定及其在新药开发中的应用(精)
体外生物测定及其在新药开发中的应用 沈嘉 摘要：简介用体外模型以离体细胞或纯化酶测定试验样品，对受体及酶的拮抗或抑制作用的体外生物测定法在国外新药及标准提取物和日本汉方制剂研究开发过程中的应用。 关键词：受体；酶；标准提取物；日本汉方药；拮抗剂；抑制剂 IN VITRO BIOASSAY AND ITS APPLICATIONS IN NEW DRUG DEVELOPMENT Shen Jia (Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110015) ABSTRACT：The applications of in vitro bioassay which util izes in vitro model,isolated cells or purified enzyme to measure the antagonisti c or inhibitive effects on receptor or enzyme,in development of new drug,standard ext ract and Japanese-Chinese traditional herbal medicine were briefly introduced. KEY WORDS：Receptor; Enzyme; Standardized extract; Japanese-C hinese traditional herbal medicine; Antagonist; Inhibitor▲ 无论以传统方法还是以最新的组合化学技术开发药用活性成分都需要筛选大量的化合物，这需要高效、快速、准确的生物学活性测定方法作为筛选手段，而体外生物测定法正是适用于较大规模的各种成分的活性筛选方法之一。体外生物活性研究有多种形式如：细胞培养、模拟体内条件以离体细胞或纯化酶测定试验样品对受体及酶的拮抗或抑制作用等等。现在着重从以下4个方面简介后一种形式及其在新药开发中的应用。 1在传统植物药研究开发中体外生物测定的应用 对从北美金缕梅、锐刺山楂及欧洲七叶树中分得的8个化合物外加一个合成化合物进行体
体外诊断试剂临床研究的基本思路
体外诊断试剂临床研究的基本思路 诊断试验（diagnostic test）是指应用实验、仪器设备等手段对疾病进行诊断的一切检测方法，包括各种实验室检查（生物化学、免疫学、微生物学、病理学等）、影像诊断（超声波、CT、X线、核磁共振等）、仪器检查（心电图、脑电图、核素扫描、内窥镜等），还包括病史询问、体格检查等。诊断试验的目的是把病人与可疑有病、但实际无病的人区别开来，以便对确诊的病人给予相应的治疗。医学上正确的诊断是采取有效防治措施的基础，各种诊断试验是构成正确诊断的必备条件，随着医学科学的发展，对疾病认识的不断深化，大量新实验、新设备的应用，新的诊断试验必然会出现以代替旧的诊断试验。由于不同的诊断试验有不同的特性和要求，有不同的应用价值和应用范围，而且都不可能尽善尽美，所以每个诊断试验进行科学的临床研究与评价是非常必要的。如上所述，实验室检查，包括生物化学、免疫学、微生物学、病理学等是诊断试验的重要组成部分，而实验室检查是通过体外诊断试剂实施的，既体外诊断试剂是实验室检查的物质基础。诊断试剂的质量是实验室检查质量的基本保障。体外诊断试剂的临床研究，实际是对采用该诊断试剂进行的诊断试验的研究。本文仅针对体外诊断试剂而言，浅谈在产品注册前进行临床研究的基本思路。 一、临床研究的目的：临床研究的目的是通过对临床样本的检测考核诊断试剂的“有效性”。诊断试剂的“有效性”一方面是指该检验项目的临床性能，另一方面是指该产品检测患者标本中靶分析物的确切程度。临床性能分为诊断准确性和效率，即数据的实际应用价值，或者对临床目的的有用性。它的确切定义是区分两种或更多临床状态的能力。按产品的创新程度，可以将诊断试剂分类为“新的检验项目”和“仿制”的产品。检测敏感度指标不在已注册产品范围内，且具有新的临床诊断意义的产品也应属于“新的检验项目”产品。“新的检验项目”和“仿制”的产品，在临床研究思路、方法等方面不尽完全相同。 二、临床研究的基本思路（一）关于“新的检验项目”产品要研究和评价某项新的诊断试验对某种疾病的诊断价值、临床意义和准确性，最基本的方法是选择适当的研究对象，用该项新的诊断试验与诊断该疾病的金标准（gold standard）进行盲法和同步比较。临床研究设计主要包括以下内容。1、确定金标准金标准是指目前公认的最可靠、最准确、最好的诊断方法，也称标准诊断方法，用以衡量新的诊断试验是否符合真实情况。临床上常用的金标准有组织病理学检查（活检、尸检）、手术发现、影像诊断（CT、核磁共振、彩色B超）、细菌培养以及长期随访所得的结论。金标准一般是特异诊断，可以正确区分“有病”和“无病”。如果没有特异诊断方法，就不能正确区分研究对象是否有病，将会影响对诊断试验的正确评价。2、选择研究对象研究对象应包括两组：一组是用金标准确定为有某病的病例组，另一组是用金标准证实无该病的患者或人群，作为对照组。病例组应包括各种病例，如症状典型和非典型的，病程早、中、晚期的，病情轻、中、重型的，年龄不同层次的等，以便能反映该病的全部特征。对照组应包括确定无本病的患者，且易与本病相混淆疾病的病例。3、同步盲法测试经金标准确定的病例与对照组中的受试者样本同步接受新诊断试验方法的测定，将测定结果与金标准判定的结果进行比较，计算新诊断试验与金标准符合和差异程度的统计学指标，再根据这些指标对新诊断试验进行评价。在试验操作的全过程和判定试验结果时，采用盲法（尽可能用双盲法）是保证诊断试验结果真实可靠的关键。 （二）关于“仿制”的诊断产品1、研究方法与已批准上市产品针对临床样本进行对比试验，以证明本品与已上市产品“等效”（equivalent）。2、对比试剂的选择2.1 在采用已批准产品作为对比试剂的前提下，建议选择目前临床使用的主流产品。2.2 充分了解所选择的产品。以定量测定产品为例，应该了解对比试剂的方法学，临床使用目的和范围，主要质量
新的《生物制剂新技术的应用和发展趋势》
目录 题目 (1) 关键词 (1) 摘要 (1) 引言 (1) 一生物制剂的介绍 (1) （一）概念 (1) （二）优点 (1) 二生物制剂的应用 (2) （一）克隆技术 (2) （二）血管发生 (2) （三）艾滋病疫苗 (3) （四）药物基因组学 (3) （五）人类基因组计划 (3) （六）基因治疗（GENE-BASEDTREATMENT） (4) 三生物制剂的现状 (4) （一）生物制剂的出现 (4) （二）第一代与第二代生物制品 (5) （三）生产中的药物 (6) （四）基因表达的新形式 (7) 四生物制剂的未来发展 (8) 【参考文献】 (10) 本文共10页6886字
生物制剂新技术在药学的应用和发展趋势 摘要：生物制剂在药学领域有着不可估量的作用，本文主要介绍了生物制剂的概念，它在国内外的现状，分析了它的应用，特别是在基因工程中的应用，以及未来的发展趋势。 关键词：生物制剂；应用；现状；未来发展 引言：21世纪的人们更加重视天然、原生态、生物，涌起了一股股回归自然的浪潮。因此，生物制剂受到人们的欢迎，在生物制剂现在的技术上，扩大它的应用领域，更快的发展，是我们迫不及待的任务。 一生物制剂的介绍 （一）概念 生物制剂就是选择性地以参与免疫反应或炎症过程的分子或受体为靶目标的单克隆抗体或天然抑制分子的重组产物。生物制剂不仅仅是原料与一般药品不同，生产工艺也不同。[1]简单的来说它就是利用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，也成为生物制剂。 （二）优点 生物制剂的优点是治疗直接，什么紊乱就补什么，缺多少补多少，比化学药品直接，也比化学药物更加个体化。常用的生物制剂有干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等。其主要特点为： 1、生物活性功能多，均具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节活性。 2、作用范围广，在体外这些生物制剂几乎对所有肿瘤细胞都有抑制效应。 3、对机体的免疫功能有调节增强作用。 生物制品是用病原微生物（细菌、病毒、立充次体）、病原微生物的代谢产物（毒素）以及动物和人血浆等制成的制品，可用于预防、治疗和诊断疾病。用于防治传染病的生物制品可分为
细菌感染性疾病的直接核酸诊断试验
细菌感染性疾病的直接核酸诊断试验 Florence Paillard, PhD, and Craig S. Hill, PhD 准确和快速的诊断是及时采取治疗措施和防止感染性疾病扩散的关键。理想的感染性疾病的诊断试剂应该能够给临床医生提供快速、灵敏度高和特异性强的实验结果。检测试剂如果灵敏度不高则可能导致疾病的漏检，使患者不能得到及时的治疗，还可造成疾病的扩散；同样，试剂如果特异性较差则可能出现假阳性结果，假阳性的出现不仅会导致不必要的治疗，还可能给人们带来心理上的阴影。不论对个人还是公共卫生部门，因检测方法的不可靠所导致的错误诊断都有可能造成严重的后果。令人欣慰的是，近年来分子诊断技术的发展已使得人们可以研制出比传统方法更为灵敏、特异和快速的用于感染性疾病的诊断试剂。 一、细菌感染性疾病诊断方法述评 数十年来，检测细菌的的标准方法是培养（液体和/或固体培养基）和染色，如用于结核分枝杆菌的抗酸染色和淋病奈瑟菌的革兰染色。其它一些方法还包括采用抗体技术检测细菌抗原的酶免疫测定（EIA）和直接荧光抗体技术（DFA）等。 采用分子生物学技术检测微生物核酸成分的核酸检测（NATs）技术的发展为临床诊断方法带来了革命性的变化。目前用于微生物鉴定的NA Ts主要有两种类型：培养确认检测试剂和直接检测试剂。培养确认的NA Ts试剂主要用来对培养基上生长的微生物进行确认；直接NA Ts试剂可以直接检测标本中的微生物，无需培养。与培养确认探针试剂相比，由于直接NATs试剂完全不需要培养这一步骤，所以可以更快地给出检测结果；直接NATs试剂一般来说其准确性也高于直接免疫检测方法。美国FDA批准的第一个非放射性直接NA Ts试剂是Gen-Probe PACE试剂，用来检测衣原体和淋球菌感染。 对直接NATs试剂而言，一个至关重要的改进在于加入了目标扩增步骤，即探针检测前将目标序列进行扩增。第一个用于沙眼衣原体检测的核酸扩增试剂（NAA Ts）于1993年获得了FDA的批准。此后，随着核酸扩增技术的不断改进，出现了可以将样品成分的抑制作用降为最小的第二代NAA Ts，它的操作流程也得到了相应改进。 本文将就已经商品化并得到FDA批准的用于检测五种细菌感染的直接NATs试剂进行述评。这五种感染为：链球菌性咽炎、肺结核（TB）、阴道炎、衣原体（CT）和淋球菌（GC）感染。 二、直接NAT方法学 非扩增直接NATs（表1）：大多数商品化的直接NA Ts试剂都采用特异性针对出现在被测生物体内的一段独有的核酸序列（目标序列）的核酸探针。这种探针通常采用荧光或化学发光标记。所测样品需进行处理以使其能够释放出核酸。检测时，标记的DNA探针可以和靶序列特异性结合，形成一个稳定的探针-目标序列杂交体。该杂交体被从非杂交探针中分离或区别开后，标记物散发出信号。 在直接检测临床标本中的微生物时，NATs可以采用不同的方式来提高试剂的灵敏度。Gen-Probe采用的一项专利技术是将rRNA作为检测目标，rRNA在大多数微生物体内是以数以千计的拷贝量存在的。例如，沙眼衣原体中的rRNA可达2000拷贝，而DNA中有用的靶序列在每个细菌体内的量仅有一个或数个拷贝。因此以rRNA为检测目标可以大大提高试剂的灵敏度。除此之外，Gen-Probe由于在杂交检测中还采用了杂交保护检测（HPA）方法，使其试剂的灵敏度得以进一步提高。检测rRNA和HPA技术的结合使得第一个DNA探针检测试剂被临床实验室广泛用于培养的确定和直接检测。 第二个用于提高DNA探针检测灵敏度的方法是对信号分子进行放大，如杂交捕获试剂（Hybrid Capture assay）。它采用针对RNA:DNA杂交体的抗体来检测杂交形成，每个抗体都带有酶标记物。每个酶分子都会产生多种着色分子用于与之结合的每个杂交分子。这种从
核酸体外扩增技术综述
核酸体外扩增技术研究进展 摘要体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。 关键词核酸体外扩增聚合酶链式反应（PCR）等温扩增 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不断涌现[1]。 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面[2]。 聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)
体外诊断试剂临床研究相关要求
体外诊断试剂临床研究相关技术要求 记录内容以群中播报顺序为序，由于时间紧迫，没整理序号，反正是按序排列的，大家理解吧。 本次主讲，针对通用的临床要求。但企业不要完全套用，今后审评三处将陆续推出诊断试剂的指导原则 一、临床评审主要依据 二、医疗器械临床试验规定，5号令 三、体外诊断试剂注册管理办法（试行）（国食药监械[2007]229号） 四、体外诊断试剂注册申报资料形式与基本要求的公告（国食药监械[2007]609 号） 体外诊断试剂临床研究技术指导原则（国食药监械[2007]240号） 其他发布的指导原则 本次课上主要讲解临床研究指导原则：包括临床研究基本原则、设计原则、报告撰写三个部分 临床研究基本原则介绍——临床研究，设计和管理是关键 虽然该部分讲解缺少方案的撰写部分，但具体内容都体现在报告中了（报告和方案是对应的关系） 设计和管理是临床试验的关键 设计、管理、质量控制、过程监察、数据管理等等都是比较关键的（主讲总结） 临床方案设计过程中，应以评审人员及产品未来上市角度对产品的评价需求及方法进行体现 （乐爸总结） （资料中要体现出全面的内容） （一）基本要求 1.伦理考虑：虑临床研究用样本对受试者的风险性的程度是否需要知情同意书 剩余血液样本，对受试者无风险，并无法获得受试者知情同意，可以开伦理事宜的说明——一般来说应该是伦理委员会提出，可以由牵头临床单位提出 新鲜样本或必须有患者的直接取得的样本，必须通过伦理委员会的认可 临床方案中，应对牵头单位及参与单位进行说明 伦理事宜的说明——盖伦理委员会的章 伦理委员会对临床方案提供的意见，以及方案的修改情况应在注册申报资料中提出 对研究对象信息保密，如：姓名、疾病情况等等 临床前的研究结果支持进行临床研究 研究单位及人员——省级医疗卫生机构：许多药物临床基地不一定是省级医疗卫生机构 省级：具有省级卫生医疗部门颁发的卫生医疗资质证明 其它特殊情况：市级以上的疾控、专科医院、检验检疫所、戒毒中心 特殊产品：必须是特殊非常见或突发疾病或戒毒之类的产品，企业在选择时应确认该临床的特殊性 人员要求：必须有相应的专业人员，并具有与研究相适应的仪器 临床工作正式开始前：培训、预实验，熟悉方法、仪器及技术性能——最大限度控制实验误差 综合考虑地区，人种，流行病源背景，病原微生物的特性等因素，临床研究全过程，应吸收流行病学、统计学、临床医学、检验医学等方面的专业人员（或知识）以保证研究方法科学合理 临床前的预实验，可以保证正式临床工作的顺利推进和进行，以及结果的分析及统计（乐爸总结） （二）临床研究设计原则——本次主要内容 1、研究方法 临床被考核试剂的批号应当与临床试验前申请人按照拟定产品标准做检测时所用样品批号一致，临床前的检测可以是自检报告，也可以是申请人的委托检测机构出具的检测报告 不同包装规格时，可只采用一个包装规格进行临床——仅限包装体积差异，其它完全无差异的情况。若成分差异则不作为不同包装规格，最好分开注册。即便如果要合并注册，临床也要分开
(完整版)体外诊断试剂行业分析
体外诊断试剂行业分析 招商三科 2010年8月20日
报告目录 一、体外诊断试剂定义与类别 二、体外诊断试剂相关政策 三、国外体外诊断试剂市场情况 四、国内体外诊断试剂市场情况 五、体外诊断试剂主要厂商 六、招商方向
一、体外诊断试剂定义与类别 1.1体外诊断试剂相关概念 ?生物制品是以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织等为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活化制剂。 ?诊断试剂从一般用途来分，可分为体内诊断试剂和体外诊断试剂两大类。除用于体内诊断的如旧结核菌素、布氏菌素、锡克氏毒素等皮内用的诊断试剂等外，大部分为体外诊断试剂。 ?体外诊断试剂是指对从人体内提取的样本（包括捐献的血液和组织）在体外进行检查的试剂、组合试剂、校准物品、对照材料等。体外诊断试剂可单独或与试验工具、仪器、器具、设备或系统组合使用。 1.2体外诊断试剂原理与分类 ?作用原理：体外诊断试剂是化学检测方法中最重要的部分，通过诊断试剂和体内物质在体外的化学反应来判断体内物质的性质和数量，通过和标准品的比较来判断人体的生理状态，主要应用在疾病的诊断上。
1.3体外诊断试剂发展简介 ?体外诊断试剂的发展是和生物化学发展息息相关的。诊断试剂最早是通过简单的化学反应（生化诊断技术），如酸碱滴定等方法来进行检测，灵敏度极低。 ?后来随着抗原-抗体技术（免疫诊断技术）的发展，通过包埋胶体金、荧光物质或者放射性物质在特定抗体上，抗体和抗原的特异性结合来检测抗原物质的存在和数量。 ?在上世纪60 年代，随着酶联免疫方法的出现，诊断试剂进入了一个全新的发展时期。1989年,科华生物在国内率先研制出酶联免疫法乙型肝炎二对半试剂盒，标志着中国酶联免疫诊断试剂盒进入大规模商品化生产。 ?上世纪80 年代以后，随着分子生物学（核酸诊断技术）的发展，对人体的认识已经进入了基因和分子水平，相应的对基因的检测方法也应运而生，成为判断人体状态的最新工具。我国90年代中期后开始推广应用PCR技术。 ?目前，诊断试剂正在向着高灵敏度、快速、小型化和家庭化发展。 二、体外诊断试剂相关政策 2.1行业规范政策
恒温扩增技术综述
恒温扩增技术综述 标准化文件发布号：（9312-EUATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。 关键词：恒温扩增；PCR 引言： 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增 1. 1 滚环核酸扩增的原理 滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA 原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针
体外诊断试剂临床试验指导原则
体外诊断试剂临床试验指导原则 （征求意见稿）
目录 一、适用范围 (2) 二、基本原则 (2) （一）伦理原则 (2) （二）科学原则 (3) （三）依法原则 (3) 三、临床试验设计 (5) （一）临床试验方法 (6) （二）偏倚的控制 (9) （三）受试者选择 (10) （四）临床试验机构数量和要求 (13) （五）临床评价指标的选择 (14) （六）临床试验的统计学分析 (14) （七）样本量要求 (18) 四、临床试验质量管理 (21) （一）临床试验前管理 (21) （二）受试者权益保障 (22) （三）临床试验方案 (22) （四）各方职责 (23) （五）记录与报告 (23) （六）临床试验所需试剂和设备管理 (25) （七）文件管理 (26) 五、其他 (26)
一、适用范围 体外诊断试剂临床试验是指在相应的临床环境中，对体外诊断试剂的临床性能进行的系统性研究。临床试验的目标在于通过考察产品的临床性能是否满足使用要求或预期用途，确认产品的风险/受益比是否可接受，并确定产品的适用人群及适应症。 本指导原则适用于按照医疗器械管理的体外诊断试剂在中国境内进行的、用于中国境内注册申请的临床试验。 本指导原则旨在明确临床试验的基本原则，对临床试验设计提出原则性建议，明确临床试验中需要考虑的关键因素，并对临床试验管理提出基本要求，用于指导申办者的临床试验工作，也为技术审评部门对临床试验资料的审评提供参考。 由于体外诊断试剂产品具有发展快、专业跨度大、临床预期用途各异的特点，不同产品的临床试验方法及内容不尽相同。申办者应根据产品具体情况，制定合理的临床试验方案，本指导原则内容也将根据体外诊断试剂发展的需要，适时修订。 二、基本原则 （一）伦理原则 临床试验必须遵循《世界医学大会赫尔辛基宣言》确定的伦理准则，应当经临床试验机构伦理委员会审查并同意，临床试验机构不具备伦理审查条件的，应由区域伦理委员会
体外诊断行业研究分析
体外诊断行业分析(上) 体外诊断行业分析（上）主要是针对分析国内诊断行业的现状和发展的空间进行分析；（下）主要是针对国内的上市公司的竞争力状况和发展方向进行分析。 1、诊断行业 诊断试剂一般可分为体内诊断试剂和体外诊断试剂两大类。除用于体内诊断的如旧结核菌素、布氏菌素、锡克氏毒素等皮内用的诊断试剂等外，大部分为体外诊断试剂。 体外诊断（IVD）包括从人体采集、制备及检测样本（如血液、尿液、体液及组织等）时使用的试剂、仪器及系统，以查明及诊断疾病和其他情况。体外诊断试剂按检测原理或检测方法分，主要有生化诊断试剂、免疫诊断试剂、分子诊断试剂、微生物诊断试剂、尿液诊断试剂、凝血类诊断试剂、血液学和流式细胞诊断试剂等，其中生化、免疫、分子诊断试剂为我国诊断试剂主要的三大类品种。国际诊断行业巨头均同时生产诊断试剂和诊断仪器，在我国，由于产业发展时间较短以及技术水平的限制，从事体外诊断产业的企业主要为试剂厂商，诊断仪器的生产厂商相对较少。
1.1 我国诊断行业状况 外企垄断高端市场、国内企业集中在二级及基层医院。20 世纪八九十年代外资厂商进入中国市场，推动了国内临床检验自动化水平的不断提高，以及检验方法的逐步标准化，明显提高了检验结果准确性、可靠性，大大缩短了临床诊断时间。 我国体外诊断试剂产品用户主要包括2.27万家医院、3.72 万个乡镇卫生院、约450 家血站，还有正在兴起的体检中心和独立医学实验室。目前，约90%的市场集中在医院客户。 国内体外诊断市场大体可分为两个层次，一是三甲医院等高端市场，由于临床检验样本多，寻求更快更准确的诊断，对检验系统的集成和自动化水平要求高，
2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
核酸扩增检测用试剂
YY/T 1182-2010 核酸扩增检测用试剂（盒） 1范围 本标准规定了核酸扩增检测试剂（盒）【以下简称“试剂（盒）”】的术语和定义、命名和分类、技术要求、试验方法、标识、标签和说明书、包装、运输和贮存等。 本标准适用于核酸扩增检测试剂（盒）的质量控制。核酸扩增检测试剂（盒）应包括核酸提取、核酸扩增及产物分析试剂组份，如核酸扩增检测试剂（盒）内不含有核酸提取组份，应由生产企业说明或指定提取试剂（盒）。 本标准不适用于基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突变检测用试剂（盒）及血源筛查的试剂（盒）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 21415-2008 体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性 3术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链反应polymerase chain reaction,PCR 聚合酶链反应或多聚酶链反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。 3.2 PCR杂交（膜上、板上）PCR hybridization 具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）可以通过氢键的方式，按碱基互补配对原则相结合，探针结合于特定核酸序列或PCR产物的杂交过程可以在液相中进行，也可以将其中一个固定在固相载体上进行。 3.3 PCR 电泳 PCR electrophoresis 根据PCR产物分子质量和所带电荷的不同在电场中进行分离的技术。 3.4实时荧光PCR real-time polymerase chain reaction,PCR 在PCR过程中利用荧光染料释放的荧光定量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过对荧光的采集和分析以达到对原始模板量进行分析的PCR。
体外诊断试剂行业一定要知道的几个概念
一、关于试剂盒的两个必须搞清楚的概念 关于体外诊断试剂盒我认为最重要的就是下面这两个概念，如果你深刻的理解了这两个概念，对于今后的产品研发、实验室检测都会有很大的帮助。 1、体外诊断试剂：是指按医疗器械管理的体外诊断试剂，包括在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品。可以单独使用，也可以与仪器、器具、设备或者系统组合使用。 2、体外诊断试剂盒：顾名思义就是具有上述体外诊断功能，可以方便实验人员使用的将各检测组分组成起来配有进行分析或测定所必需的全部试剂的成套用品。 二、关于产品必须搞清楚的概念 体外诊断试剂盒是经过原材料采购、生产过程转化之后的一个产品，无论这个生产过程多么的简单，多么的手工化，作为经历过一个生产过程的产品，我们必须清楚的知道： 1、产品：在百度百科中对产品是这样解释的：人们向市场提供的能满足消费者或用户某种需求的任何有形物品和无形服务。而狭义的产品是指被生产出的物品。针对体外诊断试剂盒来说，应该是符合产品的狭义的概念的。
2、产品标准：既然产品是经生产出来的物品，那么原材料经过这样一个生产过程之后，是否符合产品的预期要求呢？该如何评估一个特定的产品的内在质量呢？于是，就建立了产品标准这样的概念。 对产品结构、规格、质量和检验方法所做的技术规定，称为产品标准。产品标准按其适用范围，分别由国家、部门和企业制定；它是一定时期和一定范围内具有约束力的产品技术准则，是产品生产、质量检验、选购验收、使用维护和洽谈贸易的技术依据。 3、产品标准和企业标准的区别 产品标准就是针对产品而制定的技术规范，在我国针对产品而制定的技术规范有国家标准、行业标准、地方标准和企业标准四种。 企业标准就是企业是对企业范围内需要协调、统一的技术要求、管理要求和工作要求所制定的标准，它是企业组织生产、经营活动的依据。企业标准一般分为产品标准、方法标准、管理标准和工作标准。 产品标准和企业标准是相互联系、相互包含的关系，即产品标准有企业标准，企业标准中有产品标准。但是，产品标准和企业标准的根本区别是从不同角度来定义的，即产品标准是从制定标准的客体(对象)——产品而定义的，企业标准是从制定标准的主体——企业而定义的。 在我们日常生活中，所常见的企业标准大多是产品标准，实际上准确的说法应该是企业产品标准，也就是企业对所生产的产品而制定的技术规范。 三、关于产品标准中几个相关概念 1、准确度 准确度是指在一定实验条件下多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。它用来表示系统误差的大小。在实际工作中，通常用标准物质或标准方法进行对照试验，在无标准物质或标准方法时，常用加入被测定组分的纯物质进行回收试验来估计和确定准确度。 在一个特定的产品中，其有可能会被符合率（定性产品）和回收率（定量产品）这样的指标代替。 2、精密度 化学分析中，精密度是指使用特定的分析程序，在受控条件下重复分析测定均一样品所获得测定值之间的一致性程度。精密度决定于偶然误差（过失除外），表
恒温扩增技术综述
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后成长起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在植物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。 令狐采学 关键词：恒温扩增；PCR 引言： 近年来，随着分子生物学技术的迅速成长，基于核酸检测的诊断办法已年夜量建立并广泛应用于植物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此布景下呈现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经呈现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测办法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在植物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在植物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增 1. 1 滚环核酸扩增的原理 滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方法而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产品是具有年夜量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA原理与线性RCA 相同，采取与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产品结合并酶促延伸，其产品又作为第一种探针 的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产品呈指数递增。指数
2018年体外诊断试剂行业分析报告
2018年体外诊断试剂行业分析报告 2018年4月
目录 一、行业发展概况 (4) 1、第一阶段：产品引进 (4) 2、第二阶段：自主生产、规范发展 (4) 3、第三阶段：快速增长 (5) 二、行业主管部门、监管体制和主要政策法规 (5) 1、行业主管部门 (5) （1）食品药品监督管理部门 (5) （2）卫生部临床检验中心 (5) （3）行业协会 (5) 2、行业主要政策及法规 (6) （1）主要法规 (6) （2）鼓励行业发展主要相关政策 (6) 三、行业产业链情况 (9) 四、影响行业发展的因素 (9) 1、有利因素 (9) （1）体外诊断市场需求增长 (9) （2）国家政策扶持 (10) （3）疾病患病率提高 (10) 2、不利因素 (10) （1）高端市场被外企占据 (10) （2）产品同质化严重，行业竞争激烈 (11) 五、行业市场规模 (11) 六、行业风险特征 (12)
1、市场风险 (12) 2、政策风险 (13) 3、经销管理风险 (13) 4、人才流失风险 (14) 七、行业主要企业简况 (14) 1、湖南永和阳关科技股份有限公司 (14) 2、安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 (14) 3、三诺生物传感股份有限公司 (15) 4、天津九安医疗电子股份有限公司 (15)
一、行业发展概况 体外诊断指的是在人体之外，通过对人体样本（血液、体液、组织液等）进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。体外诊断产品包括诊断仪器、诊断试剂以及相关校准质控耗材。体外诊断产品属于医疗器械。体外诊断按检测原理或检测方法分类，主要分为生化诊断、免疫诊断、分子诊断、微生物诊断、尿液诊断、凝血类诊断、血液和流式细胞诊断等防范，其中生化、免疫、分子诊断是目前我国体外诊断的主要方法。 我国体外诊断产业起步相对较晚，主要精力了三个发展阶段。 1、第一阶段：产品引进 我国检验医学的发展长期落后，这阻碍了临床诊断产品的产业化发展。到20实际70年代，中国医学检验节仍沿用20世纪50年代的防范，由检验科人员自行配置试剂。 2、第二阶段：自主生产、规范发展 20世纪80年代，随着国家改革开放，体外诊断产品逐渐进入了产业化进程。在此期间，大量国外先进技术进入中国，涌现了一大批生产体外诊断产品的厂家，到20世纪90年代初期，生产临床生化试剂和免疫试剂的厂家众多，市场竞争激烈，推动了体外诊断产品临床应用水平。