细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理
Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（https://www.sodocs.net/doc/158396736.html,idlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素。
抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。
在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，
应该怀疑支原体污染。支原体污染难以观察特殊的外观变化，培养液也不浑浊。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药。对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等，氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。必要时更换所有培养用物。通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。
由于一些微生物，如支原体，病毒等能通过滤膜，所以过滤药品仍潜在被外源微生物污染的危险，近年来，60Co辐射灭菌技术在医药、食品等领域广泛应用，由于辐射灭菌能够彻底杀灭所有微生物。有试验证实以2Mrad辐射处理的各培养基样品达到了无菌要求，经多批培养试验，辐射灭菌安全可靠；辐射灭菌的培养基营养性能不低于过滤组，证明辐射灭菌对培养基性能无不良影响；对血清的辐射灭菌试验效果也表明60COγ射线不影响培养效果。把干粉培养基经无菌操做定量分装于灭菌容器内，辐射后以干粉原型贮藏，不但培养基的纯净性得到保障，而且营养性能较过滤后以水溶液形式保存更稳定，对谷氨酰胺等这类水溶液不稳定者特别合适。
目前，有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片检测。市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin（InvivoGen公司），能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒（市场上有售，如美国ICN公司的产品），可以帮助尽快发现支原体的污染。
细胞培养中支原体污染的特点及检验
https://www.sodocs.net/doc/158396736.html, 2005-6-3 19:47:34 来源：生命经纬
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过
滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构．其中央有电干
密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细
胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群
或中央束。
支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持
点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般
抗生素不敏感。
支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也
可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。
为确定有无支原体污染可做如下检酗：
①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察．支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。
②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。
③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速．也可以利用透射电镜。
④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高．但方法较为复杂
支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（https://www.sodocs.net/doc/158396736.html,idlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin 能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。
对于支原体污染的细胞，可以采取补救措施：
1 抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24-48小时，再换入常规培养液，有时可能有效。推荐用量：庆大霉素 200ug/ml ,四环素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。对于支原体污染抗生素应用，预防性应用比污染后使用好。
2 加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时可以杀灭支原体。但由于41度对培养细胞本身也有较大的影响，故处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。
细胞支原体污染一般情况及预防措施
信息来源：本站原创更新时间：2004-10-19 2:28:00
细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：
国家受支原体污染(%) 报告年度
USA－FDA 15 1993(past 30 years)
USA－ATCC 15-20 1992
Japan－(IFO，RIKEN，JCR) 80~30~22 1981 1987-
Germany－DSM 36 1990-1994
Argentina 65 1987
Israel 32 1986-1993
China 95 1990
造成支原体高污染率的原因为：
1.支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
5.研究或操作人员忽略污染问题
而支原体污染了来源:
1. 已受污染的细胞
2. 操作人员的疏失
3. 已受污染的培养基、血清
4. 操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染：
1. 抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
3. Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意：
G 设备方面：
1. 使用已作支原体测试ok之细胞株
2. 于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3. 使用不添加抗生素的培养基培养细胞
G 检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
G 实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
有关支原体污染之问题与回答：
o 应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
o 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。
o 支原体 (mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。o 支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
o 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
支原体之检测：
***********直接培养法 *************
·原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
·特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
·缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
·材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
·培养基制备：基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
·液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
·固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml 解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
步骤：
·取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
·另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
·另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
结果判读：
·支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。·典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
·若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
DNA萤光染色法
·原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。·测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。
·待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。
·特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。
·缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。
材料︰
·Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc )或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm 盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。
· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or
3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制试剂:
·无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。
· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以
1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。
·固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。
步骤：
·培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。
·在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以
1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。
·接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
·将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观察。·以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM
+10%FBS)。
DNA萤光染色检测︰
·取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。
·于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。
·吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。
·以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。
结果判读︰
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。
图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。
支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染。支原体污染难以观察特殊的外观变化，培养液也不浑浊。由于支原体能够透过滤膜，因此在使用一些通过过滤灭菌的试剂上，如果试剂本身带有支原体污染，则很容易造成支原体污染的传播。其中细胞培养接触水源是支原体最容易传播和交叉污染的地方，也是实验室消毒最难处理的地方，这里包括细胞培养箱产生的气雾、培养箱内专用水源以及水浴锅等设备，AppliChem独创了专业针对水池抗支原体污染的系列产品。用于容器表面的消毒, 以及二氧化碳培养箱蓄水槽, 各种水箱, 及清洗用水池的消毒。
细胞培养中支原体污染的预防——培养箱及水源支原体喷雾试剂Incubator-Clean (目录号：A5230)产品转为细胞恒温培养箱及其他仪器表面支原体消毒，能有效预防真菌（及孢子）、细菌（及杆菌孢子）、支原体以及病毒污染（包括 HIV和乙肝病毒）。该试剂活性成分为四苄基胺化合物，试剂不含汞、甲醛、苯酚和乙醇等细胞毒物质，更重要的是，该消毒试剂对细胞无毒副作用，并且是生物可降解的，试验结果发现，该支原体消毒剂也可用于容器表面，作为喷雾剂使用。可以每两周喷洒一次细胞培养箱，对于常用的器材可以每周一次，建议实验人员使用前喷洒。
[table=95%][tr=#a6a3ea][td][b]产品名称（货号）[/b][/td][td][b]产品说明
[/b][/td][/tr][tr][td]Incubator-Clean(A5230)[/td][td]用于容器表面的消毒, 每天喷洒工作台, 门窗等, 每两周喷洒细胞培养箱, 预防真菌, 细菌, 支原体, 病毒(如HIV, HBV) 等污染, 活性成分为四苯甲基化合物, 不含汞, 甲醛, 苯酚, 醇类, 无毒, 可生物降解。喷一喷，彻底预防支原体、细菌及病毒等的感染。[/td][/tr][tr][td]Incuwater-Clean(A5219)[/td][td]用于CO2培养箱内保持空气湿度的水源消毒，细胞培养箱是细胞实验室支原体污染中最容易进行交叉污染的地方,AppliChem独创了专业针对CO2培养箱水源抗支原体污染的产品.100X 即用型溶液供您直接稀释使用。[/td][/tr][tr][td]Incubator-Clean(A5225)[/td][td]细胞实验室细胞培养过程中使用的各种水箱, 及清洗用水池等地是支原体污染中最难处理的地
方,AppliChem独创了专业针对水池抗支原体污染的系列产品. 用于水浴消毒，有效防止各类污染[/td][/tr][/table]
Incuwater-Clean (目录号：A5219)则用于细胞培养箱内的水源消毒，该支原体预防试剂为100X浓缩液，直接稀释进水源使用，能有效杀灭并预防水源内的支原体污染，该试剂高效无毒，无挥发性，并且不会腐蚀金属表面。使用时用无菌水稀释100倍，每2-4周更换新液。
Aquabator-Clean (目录号：A5225)产品用于水浴锅等水浴装置，专门对装置内水源进行消毒，每1升水中加2毫升试剂，按此比率，每周向水源中添加2毫升Aquabator-Clean，4-6周换更换新液。该试剂高效无毒，安全可降解（注，Aquabator-Clean不能用于恒温培养箱内水源）
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细胞支原体污染相关知识简介
细胞支原体污染相关知识简介 （2016年10月16日） （1）支原体简介： 支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.1 - 0.6微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。其中，有近20种曾经在各种细胞培养体系中检测到，但超过98%以上的支原体污染是由6-8种引起的（注：具体的支原体种类，上海易色的《一步法恒温支原体检测试剂盒》说明书中有详细介绍）。而且同一种细胞经常被多种支原体污染。 （2）支原体污染细胞的途径： 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。 细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等。 （3）细胞支原体污染的隐蔽性： 由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达107-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。 而且，轻度到中度的支原体污染并不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。 以上两个原因就导致体外培养的细胞即使被支原体污染了，一般的科研工作者也不会觉察到。也就是说：如果不进行支原体的常规检测，你甚至不知道你培
表1，细胞支原体污染统计结果，数据来自参考文献 [4]
3. Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC?). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma? Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18 4. John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. p. 24.
细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理 Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（https://www.sodocs.net/doc/158396736.html,idlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养
细胞支原体污染一般情况及预防措施
细胞支原体污染一般情况及预防措施 细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。 各国细胞库支原体污染的统计表，如下： 国家受支原体污染(%) 报告年度 USA－FDA 15 1993(past 30 years) USA－ATCC 15-20 1992 Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998 Germany－DSM 36 1990-1994 Argentina 65 1987 Israel 32 1986-1993 China 95 1990 造成支原体高污染率的原因为： 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 5、研究或操作人员忽略污染问题 支原体污染了来源： 1、已受污染的细胞 2、操作人员的疏失 3、已受污染的培养基、血清 4、操作环境不良、实验器具不洁等 由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。 去除支原体污染： 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（B ayer），Enrofloxacin（Bayer） 2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 3、Anti-sera 预防与控制方面可从以下各点加强注意： 设备方面： 1、使用已作支原体测试ok之细胞株
细胞培养中常见的污染的处理
细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液 一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养 液是否存在浑浊的现象！ 可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的 消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期 清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就 要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体 感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用 8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办
细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办 （2016年10月16日） 一、细胞支原体污染的图片 我们首先来认识一下，细胞支原体污染与非污染的图片有什么区别。 如上图所示，左侧为未经支原体清除试剂处理的人Hela细胞,经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA，说明细胞支原体污染非常严重。 而右侧为经过本公司的支原体清除试剂2处理7天的Hela细胞，经DAPI 染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质没有任何絮状核酸物质被染成蓝色，说明支原体已经被清除。（版权声明：上图来自上海易色医疗科技有限公司网站。） 二、细胞支原体污染的危害和表现 细胞支原体污染的危害（1） 培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献1）。Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。 总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！ 细胞支原体污染的危害（2） 1. 细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的 严重错误！ ●结果：由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗 肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.） ●参考文献：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8. 2. 免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前 国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。 ●结果：（1）The capacity of these cell lines to induce DC maturation was due to their contamination by mycoplasma. Our results reveal that DC are able to sense mycoplasma infection and mature as they do in response to most viruses and bacteria.（2）Further investigation demonstrated that the changes in DC phenotype and functions were due to the presence of mycoplasmas in these two cell lines; eradication of mycoplasmas completely abolished the observed effects, and importantly, pure mycoplasmas in the absence of tumor cell supernatants were able to produce the same effects. ●参考文献：（1）Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur. J. Immunol. 2000.30: 705–708。（2）Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells. J Biomed Sci. 2005;12(1):31-46.
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍 （2016年10月16日） 哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。 目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有： 一、培养法 ●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转 接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体 培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。 ●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可 的方法之一。 ●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支 原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最 常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无 法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有细胞 支原体污染的20-50%。 ●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中 收录的培养法支原体检测方法进行操作。 二、荧光染色法 ●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培 养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色， 如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料 染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。 ●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。 ●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污 染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细
细胞培养中支原体污染的问题
细胞培养中支原体污染的问题 原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构．其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群 或中央束。 支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。 为确定有无支原体污染可做如下检酗： ①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察．支原体呈暗色微小颗粒
位于细胞表面和细胞之间。 ②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。 ③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速．也可以利用透射电镜。 ④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高．但方法较为复杂 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后芨谋湎赴 腄NA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其
细胞培养中常见污染
最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与
如何解决细胞培养中的支原体污染
如何解决细胞培养中的支原体污染？ 一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染往往容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染。据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂渐渐蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。 狡猾的支原体 支原体是唯一一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。由于它的直径小（约为0.15-2 μm），而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。支原体的种类非常多，超过了100种。当然，大部分支原体检测都不可能检测到所有的种类。不过，在实验室中捣乱的支原体也通常就是那一小撮。 支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞。然而，它们能以许多不同方式改变细胞的新陈代谢。细胞除了长得不好之外，几乎所有的实验表现如蛋白表达也都会受到影响。传统的抗生素对支原体并不奏效，因为它们大多破坏细胞壁的完整性，而支原体恰恰没有细胞壁。这也就是支原体感染率高企的主要原因。曾有一位细胞培养专家戏称：“我可是支原体方面的专家，并不是因为我喜欢他们，而是25-60%的细胞系都感染了支原体。”支原体总在偷偷地改变细胞，篡改我们的实验数据。怎么办？ 检测、检测、再检测 对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心（NCCC），它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明无支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。 检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析、ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该算是检测支原体的理想方法，它综合了几个优势：灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可直接用来检测，非常方便。Sigma-Aldrich公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，扩增的就是支原体基因组上16S核糖体RNA基因。此区域高度保守，因此可检测多达19种支原体。当然，为了避免假阳性和假阴性，实验中必须设立多种对照：阳性对照、阴性对照和内对照。如果电泳图上出现259bp的清晰条带，对不起，你中招了。以色列Biological Industries（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit也能提供支原体的快速检测，引物与Sigma类似，也是扩增16S rRNA。这个试剂盒的灵敏度颇高，M. capricolum的检测极限为5.5 CFU/ml，M. hyorhinis则为10.5 CFU/ml。
细胞培养中支原体污染的特点及检验的笔记
细胞培养中支原体污染的特点及检验的笔记 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群 或中央束。 支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6-8．0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。 为确定有无支原体污染可做如下检测： ①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。 ②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA 着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min，向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。 ③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。 ④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法较为复杂。 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.oral e）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（https://www.sodocs.net/doc/158396736.html,idlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
细胞出现小黑点是什么,支原体污染怎么办
细胞出现小黑点是什么，支原体污染怎么办 炎炎夏日，细胞污染严重，它们正在被这越来越热的天气“折磨”。 你会慢慢发现细胞出现了一些不知何物的小黑点 那些讨厌的小黑点到底是什么呢？ 今天我们就来说道说道吧~ 1.细胞碎片 细胞生长状态不好，吹打过多或者多次吹打导致碎片，加大血清浓度，降低离心速度养两代试试。碎片一般会离心出去。这就是细胞碎片 2.黑胶虫 黑胶虫污染，黑胶虫一般小而且密。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡。 3.支原体污染 支原体污染不易发现，很多细胞即使支原体污染，在没有出现猛烈爆发时细胞形态也不会有明显的变化，因此支原体污染经常被人们所忽视。但是支原体污染对细胞的伤害比人们想象的要大得多，会直接对您的实验结果产生影响，包括以下几个方面： ①严重降低细胞的基因转导效率:无论是病毒载体还是脂质体介导的基因转导，细胞都会 因为支原体的污染而导致效率低下。 ②严重影响细胞的功能表型:支原体严重影响细胞的分化方向，扰乱细胞的增殖、活力与 代谢水平，造成实验中极其不稳定的细胞表型结果。
那么出现这些情况之后细胞怎么“自救”呢 对于细胞支原体污染，向已经污染支原体的细胞中加入汉恒自主研发特效抗支原体试剂SaveIt? 后，再用PCR检测培养细胞的支原体，电泳图如下。结果显示，加入汉恒生物抗支原体试剂后，污染的支原体被有效清除。 虽然有试剂可以帮我们清除支原体，但是既然存在支原体污染那就说明别的地方是存在污染可能性的，例如生物安全柜，工作台，培养箱等等，对于这些情况，我们又可以怎么去解决呢？ “喷一喷”
生物制品中支原体污染及清除方法的研究进展
生物制品中支原体污染及清除方法的研究进展 杜金玲，王丹娜，石磊，吕超超，王吉玮，孟姗姗，刘长辉，卢会英，赵亚荣 （北京大北农动物医学研究中心，北京100097） ［收稿日期］2011－09－23［文献标识码］A ［文章编号］ 1002－1280（2012）02－0057－04［中图分类号］S852．6［摘 要］支原体是生物制品污染中较常见的一种微生物，它可以污染细胞、病毒批、血清等制品，给科研及生物制品产业带来危害。文章简要介绍了支原体污染生物制品后带来的危害，并对清除 支原体方法的研究进展进行了综述。［关键词］支原体污染；危害；清除 作者简介：杜金玲，硕士，从事动物传染病疫苗研究。E －mail ：dujinling@163．com Research Progress on Mycoplasma Contamination of Bioproducts and the Elimination Methods DU Jin －ling ，WANG Dan －na ，SHI Lei ，LV Chao －chao ，WANG Ji －wei ，MENG Shan －shan ，LIU Chang －hui ，LU Hui －ying ，ZHAO Ya －rong （Veterinary Medicine Research Center of Beijing Da Bei Nong ，Beijing 100097，China ） Abstract ：Mycoplasmas always contaminate cell lines ，viruses ，serum and other materials for basic research and for manufacturing of bioproducts．It generally considered to be frequent commensals．The article briefly summarized the harm of Mycoplasma contamination in bioproducts ，and reviewed the elimination methods of Mycoplasma contamination． Key words ：Mycoplasma contamination ；harm ；elimination 支原体（Mycoplasma ）属于柔膜体纲，是介于细菌和病毒间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，也是目前所知能在无生命培养基中生长繁殖的最小微生物，大小一般在0．3 0．5μm 之间，呈高度多形性。在医学和兽医学上，支原体是一类重要的病原微生物，对人类、猪、牛、禽和实验动物等有广泛的致病性，也是生物制品污染物中比较常见的一种。细胞、病毒种子批、血清等的支原体污染均给科研、疫苗生产及生物制品产业带来很多麻烦，甚至造成事故。我国药典三部和欧洲药典都明确提出要对生物制品生产用细胞基质、病毒种子批、病毒收获液和细胞建库所用胰酶进行支原体检测［1－6］ 。由于支原体高度多形性和可塑性，可通过除菌滤膜，因此支原体污染一般难于清除。广大科 研工作者在支原体清除方面进行了大量的探索和 研究，试图寻求一种简单，有效的清除支原体方法，本文就支原体污染及清除方面的研究进展进行了综述，以为借鉴。1 支原体污染的危害 细胞、病毒种子批、血清、鸡胚、组织、原材料等 被支原体污染给科研和生产造成严重的危害 ［7－8］ 。尤其是细胞被支原体污染更是世界性难题，在细胞 培养中支原体感染发生率可达30% 50%，若不及时处理，还会产生交叉污染，造成极大的半成品和成品报废 ［9－10］ 。 目前能污染细胞的支原体多达20种以上，细胞污染支原体后，部分敏感细胞可见生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落，但多数细胞污染后无明显
细胞支原体污染的PCR检测
细胞支原体污染的PCR检测 支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原 体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。 ＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。 下面有更详细的： 污染测试--支原体 : PCR方法 原理： 利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA 大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。 特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。 缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。 材料与设备： ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions. 提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture
支原体污染的预防及处理办法
细胞培养-支原体污染的预防及处理办法 Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（https://www.sodocs.net/doc/158396736.html,idlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素。 抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。 在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染。支原体污染难以观察特殊的外观变化，培养液也不浑浊。 支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药。对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等，氨基糖苷类、氯霉素对支原体
细胞培养中的支原体污染的预防及处理
细胞培养中的支原体污染的预防及处理ztwpierr… Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（https://www.sodocs.net/doc/158396736.html,idlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素。 抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。 在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染。支原体污染难以观察特殊的外观变化，培养液也不浑浊。 支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生