海马神经元钙离子通道的进展

原代海马神经元细胞培养

原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。

钙通道阻滞剂的作用机制

钙通道阻滞剂的作用机制 Final approval draft on November 22, 2020

钙通道阻滞剂的作用机制 钙通道阻滞剂（Calcium Channel Blockers）能与膜上的钙通道蛋白结合，阻止钙离子内流进入细胞，降低胞质内钙离子浓度，抑制钙离子所调解的细胞功能，故也叫钙拮抗剂（Calcium Antagonists ）。 钙通道按类型分为电压依懒性钙通道，受体调控性钙通道。其中电压依懒性钙通道又分为不同的亚型，包括L、T、N、P、Q、R等不同的类型。在心血管系统主要有L型和T型，临床常用钙拮抗剂主要作用于L型。CCB 种类很多，主要选择性地作用于 L-型钙离子通道（L-type calciumchannels, LTCC），结合部位在α1c亚单位，并根据其具体结合点，又分为三个亚类：二氢吡啶类、地尔硫卓类和苯烷胺类。 钙通道的分子结构：以L-型钙通道为例，它由α 1、α 2 、β、γ、δ五个 亚单位组成，其中α 1亚单位为功能亚单位，它能单独发挥钙通道的作用。α 1 亚单位上有四个重复的结构域（domain），每域含6个跨膜片段，分别称S1、S2、S3、S4、S5、S6，都是疏水性的，S4含5～6个带正电荷的精氨酸，对膜电位的变化极为敏感，是钙通道的电压敏感区。S 5～Ｓ６之间有一较长的小袢陷入膜内形成小孔供Ｃａ２＋通透，其邻近部位常是钙拮抗药的结合位点。 对钙通道的作用方式： (一)作用于钙通道的状态 钙通道有三种状态：静息态、开放态、失活态。钙拮抗药分别作用于不同的功能状态而发挥作用，如维拉帕米作用于开放态，地尔硫卓作用于失活态，硝苯地平则主要作用于静息态。 (二)频率依赖性 通道开放的频率与药物的阻滞强度呈正相关，即开放的频率越快，药物作用越强。但药物对频率的依赖性有不同，维拉帕米和地尔硫卓明显，而硝苯地平则无。 (三)受体间的相互影响 二氢吡啶类或地尔硫卓类受体被药物占领后均会提高对方受体对药物的亲和力；而维拉帕米受体被占领后则减弱另二类受体对药物的亲和力。反之亦然。

钙拮抗剂横向比较

钙拮抗剂横向比较 分类：与动脉血管及心脏的亲和力和作用： 1.二氢吡啶类(DHPs), 如氨氯地平、硝苯地平主要作用于血管平滑肌上的L型钙通道, 起到舒张血管和降低血压的作用; 2.非DHPs, 如维拉帕米、地尔硫卓, 对心肌和血管上的L型钙通道作用程度与DHPs相同, 但是对窦房结和房室结处的钙通道有选择性。维拉帕米和地尔硫卓在扩张血管方面较DHPs差, 但是其对心脏的负性变时、负性传导和负性变力作用是DHPs所不具备的。 根据受体结合特性、组织选择性和药代动力学特点： (1)第一代为短效钙离子拮抗剂, 包括硝苯地平、尼卡地平、地尔硫卓等,由于生物利用度低且波动大，药物血浆浓度波动大，用药后快速导致血管扩张和交感神经系统激活，引起反射性心动过速、心悸和头痛；由于此类药物半衰期短、清除率高、作用持续时间短，使其对血压控制时间短，很难实现24小时的有效覆盖，容易引起反射性交感神经激活, 增加心率, 基本不用于高血压的治疗; (2)第二代钙离子拮抗剂的药物，通过改革剂型为缓释或控释剂型使药代动力学特性有了明显改善，也有部分具有新的化学结构，代谢动力学特性有所改善,血管选择性有所提高, 性质稳定、疗效确切, 如硝苯地平缓释片、尼莫地平、尼群地平等, 但其生物利用度仍很低, 峰谷血浆浓度波动较大; (3)第三代为长效钙离子拮抗剂, 以氨氯地平、拉西地平、乐卡地平等为代表, 半衰期长, 可1次/d服用, 因其起效缓慢，作用平稳，持续时间久，抗高血压的谷峰比值高，血压波动小、不良反应小、服用方便且能24h覆盖等特点, 已成为用于高血压治疗的重要钙离子拮抗剂类药物。 拉西地平： (1)肝功能不全者需减量或慎用, 因其生物利用度可能增加, 而加强降血压作用。 (2)本品不经肾脏排泄, 肾病患者无需调整剂量。 (3)虽然本品不影响传导系统和心肌收缩, 但理论上钙离子拮抗剂影响窦房结活动及心肌储备, 应予以注意。窦房结活动不正常者尤应关注, 有心脏储备较弱者亦应谨慎。

钙通道阻滞剂

1.络活喜(苯磺酸氨氯地平片)说明书 通用名：苯磺酸氨氯地平片 商品名：络活喜 英文名：Amlodipine Besylate Tablets 汉语拼音：Benhuangsuan Anlüdiping Pian 络活喜化学名称为：3-乙基-5-甲基-2-（2-氨乙氧甲基）-4-（2-氯苯基）-1，4-二氢-6-甲基-3，5-吡啶二羧酸酯苯磺酸盐。【络活喜性状】络活喜为白色片。 【络活喜药理毒理】 药理作用苯磺酸氨氯地平是二氢吡啶类钙拮抗剂(钙离子拮抗剂或慢通道阻滞剂)。心肌和平滑肌的收缩依赖于细胞外钙离子通过特异性离子通道进入细胞。络活喜选择性抑制钙离子跨膜进入平滑肌细胞和心肌细胞，对平滑肌的作用大于心肌。其与钙通道的相互作用决定于它和受体位点结合和解离的渐进性速率，因此药理作用逐渐产生。络活喜是外周动脉扩张剂，直接作用于血管平滑肌，降低外周血管阻力，从而降低血压。治疗剂量下，体外实验可观察到负性肌力作用，但在整体动物实验中未见。络活喜不影响血浆钙浓度。15项随机双盲、安慰剂对照的临床试验证实了络活喜的抗高血压作用。轻中度高血压患者每日服药一次，可以24小时降低卧位和立位血压，长期使用不引起心率或血浆儿茶酚胺显著改变。降压效果平稳。降压效果和剂量相关，降压幅度与治疗前血压相关，中度高血压者（舒张压105-114mmHg）的疗效比轻度高血压者（舒张压90-104mmHg）高，血压正常者服药后没有明显作用。络活喜降低舒张压的作用在老年人和年轻人中相似，降低收缩压的作用对老年人更强。络活喜缓解心绞痛的准确机制尚不明确，但可能在运动时，络活喜通过降低外周阻力（后负荷）减少心脏做功和心率血压乘积，减少心肌氧需，治疗劳力型心绞痛；通过抑制钙离子、肾上腺素、5-羟色胺和血栓素A2引起的冠状动脉和小动脉收缩，恢复缺血区血供治疗自发性心绞痛。8项临床试验中5项显示，络活喜显著延长运动诱发劳力型心绞痛的时间；部分研究显示络活喜延长ST段下降1mm的时间，并减少心绞痛发作频率。该作用具有持续性，并且不显著影响血压和心率。在一项50例自发性心绞痛患者中进行临床试验显示，络活喜每周可以减少4次心绞痛发作（安慰剂每周减少1次）。心功能正常的患者服用络活喜后测定静息和运动状态下血流动力学，心脏射血分数有所增加，但对dP/dt或左室舒张末压/容积无显著影响。治疗剂量下，络活喜单独使用或与?-阻滞剂合用，均不引起负性肌力作用。一项安慰剂对照研究中，697例心功能II/III级（NYHA）的心衰患者用药8-12周后，运动耐量检查、NYHA分级、症状和左室射血分数均未显示心衰有加重的迹象。（另一项安慰剂对照的长期生存试验，1153名心功能III/IV级心衰病人，在常规治疗基础上随机加用络活喜或安慰剂，结果显示各种原因的死亡率和心源性发病率，氨氯地平组为39%，安慰剂组为42%。）络活喜不影响窦房结功能和房室传导。高血压或心绞痛患者合用络活喜和?-阻滞剂，未发现心电图异常。络活喜不改变心绞痛患者的心电图，不加重房室传导阻滞。肾功能正常的高血压患者用药后，肾血管阻力降低、肾小球滤过率和肾血流增加，但滤过分数或尿蛋白不变。毒理作用致癌、致突变和致畸以每日0.5、1.25和2.5mg/kg的剂量，大鼠和小鼠连续喂食氨氯地平两年，未证实有致癌性。最高剂量已达到了小鼠的最大耐受量，但大鼠尚未达到（以临床最大推荐剂量10mg为基础计算mg/m2）。基因和染色体水平均未揭示有药物相关的致突变性。雄性大鼠在交配前64天、雌性大鼠在交配前14天开始给予氨氯地平，每日10mg/kg（8倍于人类最大推荐剂量），不影响生殖能力。妊娠大鼠和兔子在主要器官形成期给予氨氯地平10mg/kg（8倍和23倍于人类最大推荐剂量），未发现有致畸性和其它胚胎毒性。但是大鼠交配前14天开始，直至整个交配期和妊娠期给予10mg/kg的氨氯地平，导致幼仔的体型明显减小（约50%），宫内死亡数量明显增加（约5倍），同时延长妊娠时间和分娩时程。毒性小鼠和大鼠分别单剂给予氨氯地平高达40mg/kg和100mg/kg，可以导致死亡。狗单剂服用4mg/kg或更高剂量将导致明显的外周血管扩张和低血压。 【络活喜药代动力学】 络活喜口服后吸收完全但缓慢，6-12小时达到峰浓度。单次口服5mg，血药峰值为3.0ng/ml；单次口服10mg，血药峰值为5.9ng/ml。绝对生物利用度为64%-90%，不受饮食影响。循环中的药物约95%以上与血浆蛋白结合，分布容积为21L/kg。持续用药后7-8天达到稳态血药浓度。络活喜以二室模型的方式从血浆中消除，在肝脏广泛代谢为无药理活性的代谢产物（90%）。终末半衰期（t1/2?）健康者约为35小时，高血压病人延长为50小时，老年人65小时，肝功受损者60小时，肾功能不全者不受影响。络活喜10%以原型、60%以代谢物的形式从尿中排出，20%-25%从胆汁或粪便排出。络活喜不被血液透析清除。肾功能不全对络活喜的药代动力学特点没有显著影响。老年患者和肝功能不全患者对络活喜的清除率降低，药时曲线下面积（AUC）约增加40%-60%。中重度心衰患者的AUC升高幅度相似。【络活喜适应症】 （1）高血压（单独或与其他药物合并使用）。（2）心绞痛：尤其自发性心绞痛（单独或与其他药物合并使用）。 【络活喜用法和用量】 通常口服起始剂量为5mg，每日一次，最大不超过10mg，每日一次。瘦小者、体质虚弱者、老年患者或肝功能受损者从2.5mg，每日一次开始用药；合用其它抗高血压药者也从此剂量开始用药。用药剂量根据个体需要进行调整，调

新生鼠海马、皮层神经元原代培养

新生鼠海马、皮层神经元原代培养 实验材料 1. 实验动物 新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。 2. 试剂 Hibernate A Neurobasal A B27 serum-free supplements Papin （木瓜蛋白酶） DNAase I OptiPrep Density Gradient Medium Poly-L-lysine （多聚赖氨酸） L-glutamine （L-谷氨酰胺） Penicillin （青霉素） Streptomycin （链霉素） D-Hank’s solution dd H2O 3. 溶液配制 1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。（可配成25×） 2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。 3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。可一次配好，-20°C保存，每次取用。 4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。现用现配，37°C保存备用。 5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。 5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。现用现配，37°C保存备用。 4．实验方法 1. 包被培养皿 使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。 2. 组织剥离 取出生12 h以内的Wistar大鼠，用75%乙醇擦拭全身消毒。无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤和颅骨，向两边分开，小心取出全脑，浸于冰浴的解剖液。首先切除小脑和脑干部分，然后沿正中切为左右两半球，海马位于半球的腹内侧。分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中，完整的海马（半侧）呈月牙形。用精细镊小心除去中脑、纹状体等非皮层结构，剥离出皮层。 3. 消化和分散 用精细剪将海马剪成1~2 mm3的组织块，在6 cm培养皿中用配好的木瓜蛋白酶在37 °C下消化30 min，4个半皮层或16个半海马/10mL消化液，并加入500 μL DNAase I。消化结束后小心吸去消化液，加入2~3mL HABG，200 μL DNAase I，

氟西汀对海马神经元生长的影响

氟西汀对海马神经元生长的影响 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1材料与方法 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，

D-Hank#39;s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。 大鼠海马神经元的鉴定 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染

钙通道阻滞剂的作用机制

钙通道阻滞剂的作用机 制 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]

钙通道阻滞剂的作用机制 钙通道阻滞剂（Calcium Channel Blockers）能与膜上的钙通道蛋白结合，阻止钙离子内流进入细胞，降低胞质内钙离子浓度，抑制钙离子所调解的细胞功能，故也叫钙拮抗剂（Calcium Antagonists ）。 钙通道按类型分为电压依懒性钙通道，受体调控性钙通道。其中电压依懒性钙通道又分为不同的亚型，包括L、T、N、P、Q、R等不同的类型。在心血管系统主要有L型和T型，临床常用钙拮抗剂主要作用于L型。CCB 种类很多，主要选择性地作用于 L-型钙离子通道（L-type calciumchannels, LTCC），结合部位在α1c亚单位，并根据其具体结合点，又分为三个亚类：二氢吡啶类、地尔硫卓类和苯烷胺类。 钙通道的分子结构：以L-型钙通道为例，它由α 1、α 2 、β、γ、δ五个 亚单位组成，其中α 1亚单位为功能亚单位，它能单独发挥钙通道的作用。α 1 亚单位上有四个重复的结构域（domain），每域含6个跨膜片段，分别称S1、S2、S3、S4、S5、S6，都是疏水性的，S4含5～6个带正电荷的精氨酸，对膜电位的变化极为敏感，是钙通道的电压敏感区。S 5～Ｓ６之间有一较长的小袢陷入膜内形成小孔供Ｃａ２＋通透，其邻近部位常是钙拮抗药的结合位点。 对钙通道的作用方式： (一)作用于钙通道的状态 钙通道有三种状态：静息态、开放态、失活态。钙拮抗药分别作用于不同的功能状态而发挥作用，如维拉帕米作用于开放态，地尔硫卓作用于失活态，硝苯地平则主要作用于静息态。 (二)频率依赖性 通道开放的频率与药物的阻滞强度呈正相关，即开放的频率越快，药物作用越强。但药物对频率的依赖性有不同，维拉帕米和地尔硫卓明显，而硝苯地平则无。 (三)受体间的相互影响 二氢吡啶类或地尔硫卓类受体被药物占领后均会提高对方受体对药物的亲和力；而维拉帕米受体被占领后则减弱另二类受体对药物的亲和力。反之亦然。

钙离子拮抗剂 信心小总结

1 钙离子拮抗剂的应用类型及作用机制 低血游离钙可能引起高血压，其机理与钙对膜的稳定效应有关。当血游离钙降低时，膜的稳定效应减弱，膜上相应的电压依赖性钙通道开启，细胞外游离钙流入细胞。并触发“钙流入激活钙释放机制”，使胞浆游离钙进一步增高，最终引起血管收缩，血压升高，称I型缺陷。此型特点为低肾素、低血清游离钙及高细胞游离钙水平。此时，钙离子阻滞剂或补充钙治疗有效；而高肾素一高血清游离钙型高血压，钙离子阻滞剂或补钙治疗效果不佳。 在高血压治疗中的作用及地位。CCB明确适应证为：(1)老年性高血压患者；(2)单纯收缩期高血压患者;(3)高血压有心绞痛患者；(4)外周血管病患者；(5)颈动脉粥样硬化；(6)高血压伴妊娠患者。 钙离子拮抗剂阻滞心肌钙依赖性的兴奋一收缩耦联并在离子通道水平选择性地阻断细胞膜上的钙离子通道 (慢钙通道)，使胞内肌浆网释放钙离子下降，同时减少钙离子与钙调蛋白相结合，使肌球蛋白氢键激酶 (MLCR) 活化, 肌球蛋白与肌动蛋白相互作用引起的收缩作用减弱, 使全身血管扩张，血压下降。除此之外, 钙离子拮抗剂还具有抑制心肌收缩力、降低心肌耗氧量、松弛血管平滑肌、引起血液动力学变化等心血管系统方面的作用, 而且还具有抑制血小板聚集、抑制神经及内分泌系统的兴奋分泌偶联以及减少交感神经末梢递质的释放等作用。． 2+Ca 2+通道Ca -2+Ca内流-2+Ca通道钙调蛋白阻滞剂2+Ca钙调蛋白复合物-

平滑肌收缩血压 钙离子拮抗剂的分2 : 根据其化学结构和药理作用可分为两大类型钙通道，起到舒张血 (DHP 二氢吡啶类s)，主要作用于血管平滑肌上的L(1) 管和降低血压的作用;型钙通道作用程度, 对心肌和血管上的 L(2) 非DHPs, 如维拉帕米、地尔硫卓但是对窦房结和房室结处的钙通道有选择性。维拉帕米和地相同, 与 DHPs差，但是其负性变时、降低交感神经活性的尔硫卓在扩张血管方面较DHP s所不具备的。作用是 DHPs组织选择性和药代动力学特点将钙离子拮抗剂划分为根据药物的受体结合特性、: 三代容易, 包括硝苯地平、尼卡地平、地尔硫卓等，(1) 第一代为短效钙离子拮抗剂;基本不用于高血压的治疗引起反射性交感神经激活, 增加心率 , , 血管选择性有所提高(2) 第二代钙离子拮抗剂的药物代谢动力学特性有所改善，但其生, 尼莫地平、 , 性质稳定、疗效确切如硝苯地平缓释片、尼群地平等; 物利用度仍很低，峰谷血浆浓度波动较大． (3) 第三代为长效钙离子拮抗剂, 以氨氯地平、拉西地平、乐卡地平等为代表, 半衰期长 , 可 1次 / d服用, 因其长效、不良反应小、服用方便且能 24h覆 盖等特点, 已成为用于高血压治疗的重要钙离子拮抗剂类药物。 根据此分类 第一代钙拮抗剂均为短效。特点是： ①量效关系难以预测。这是因为生物利用度低、波动大，造成个体内和个体间的药物血浆浓度波动大。 ②由于快速的血管扩张和交感神经系统激活引起反射性心动过速、心悸和头痛，尤其以硝苯地平最为明显，这是因为此药的达峰时间较短( 1h ) 。 ③作用持续时间短。半衰期短、清除率高，使高血压患者的血压和心绞痛患者的心肌缺血的控制很难实现2 4 h的有效覆盖，在清晨的血压和缺血高峰期患者不能得到保护。 ④血管选择性差，如维拉帕米和地尔硫卓具有明显心脏作用，包括负性变时、负性传导和负性变力作用。第一代钙拮抗剂对充血性心力衰竭都有不利影响，使预后恶化。 第二代钙拮抗剂的药代动力学特性有所改善或血管选择性有所提高。 Ⅱa类与第一代钙拮抗剂相比，血管扩张所致的副作用减少减轻，因为它们的血浓度达峰时间延长，起效较慢。它们的半衰期延长，作用持续的时间延长。 Ⅱb类的血管选择性提高，对心脏的负性变力性、负性变时性和负性传导作用减弱，药代动力学也有所改善，但生物利用度仍很低，峰谷血浆浓度波动较大。

胎鼠海马神经元培养及其鉴定

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大

小鼠海马神经元细胞使用说明

小鼠海马神经元细胞 小鼠海马神经元细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠海马神经元细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠海马神经元细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠海马神经元细胞产品简介： 产品名称：小鼠海马神经元细胞(Mouse hippocampal neuron cells)组织来源：小鼠海马组织区 产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶 小鼠海马神经元细胞简介： 海马椎体神经元是海马区的主要成分，主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节、是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一。海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用(细胞因子)的有效细胞模型,其在神经生物学,发育生物学体外实验研究中已被广泛应用。 本公司生产的小鼠海马神经元细胞采用胰酶消化制备而来，细胞总量约为 5×105 个/瓶，细胞纯度可达 80%以上，且不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

海马神经元细胞免疫荧光检验

海马神经元细胞免疫荧光检验 神经元鉴定： 一、烯醇化酶鉴定： 培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。 二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示： 培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

钙离子拮抗剂

钙离子拮抗剂 钙离子拮抗剂 钙拮抗剂在1962年即已被证实能有效地治疗急性高血压，70年代后期才被广泛地研究和应用于治疗高血压病。钙拮抗剂是80年代发展起来的一类心血管新药。它带来了心血管治疗的一场革命现以广泛应用于高血压、冠心病、心率失常、脑血管病的治疗。目前，钙拮抗剂在高血压病及其他心脑肾血管病变防治中仍具有中要地位。近年在美国，钙拮抗剂在老年人降压治疗中的应用有增无减，已成为常用药物（单用占23.9%，与利尿剂合用占5.4%）；在中国和日本，接受治疗的高血压和心绞痛病人中，分别有1/2和3/4使用钙拮抗剂。 但是，钙拮抗剂也是争论最大的一类药物。关于钙拮抗剂是否增加心血管事件的危险尤其是chd的死亡率，以及是否增加肿瘤出血的危险，分歧很大。美国fda也警告使用短效硝苯地平有危险。为此，who/ish专门成立了特别问题专家小组——（ad hoc sub-committ ee）对钙拮抗剂的安全性进行评估。评估得出的结论是：现有资料不能确定有关钙拮抗剂对chd、肿瘤及出血的危险性影响是有益或有害。硝苯地平是近20年来我国治疗高血压应用最广泛的降压药，多年来并未见发生严重不良反应的报道。而且据中国老年收缩期高血压临床试验，在我国高血压的主要并发症是卒中，而不是心肌梗死，故仍推荐钙拮抗剂为治疗老年高血压第一线药，尤其适用于患者，对合并chd者，则宜选用长效制剂。 5.1 分类 钙拮抗剂包括一大族化学结构、功能、对组织选择性及不同钙通道与结合位点选择性都各异的药物。降压治疗最好使用长效钙拮抗剂如：氨氯地平、拉西地平、非洛地平缓释片、硝苯地平控释片、维拉帕米缓释片等。而应避免使用短效钙拮抗剂。 根据国际药理学联合会的分类，选择性的作用于型钙通道的钙拮抗剂，多数结合部位在分子结构的α1亚单位。因此可根据α1单位上不同的结合位点分为三个亚类：iα类，二氢吡啶类，包括硝苯地平、尼群地平、尼莫地平、尼卡地平、尼伐地平、氨氯地平、拉西地平、非洛地平、依拉地平等地平类药物。二氢吡啶类用以治疗心血管病，主要是高血压、冠心病、心绞痛等。 ib类，硫苯罩类，ib类类以硫罩类为代表，其药理作用介于二氢吡啶类及维拉帕米之间，主要用于治疗心绞痛。

钙离子通道阻断剂及其不良反应

钙离子拮抗剂（Calcium Antagonists Ca-A ） 主要通过阻断心肌和血管平滑肌细胞膜上的钙离子通道，抑制细胞外钙离子内流，使细胞内钙离子水平降低而引起心血管等组织器官功能改变的药物，常用于用于高血压病、冠心病和心律失常的治疗。（讲到钙离子拮抗剂的作用机理，首先要谈高血压是如何产生的。血压是指血液在血管内流动时对血管壁产生的侧压力。绝大部分高血压患者（90%以上）没有特定的病因，多是随着年龄增加，血管壁弹性减弱，阻力增加而引起的。在心肌和血管壁平滑肌细胞膜上都有钙离子通道，它像一扇大门一样控制钙离子的出入，细胞内钙离子浓度的增加，可以引起细胞的收缩，使血管阻力增加，血压升高。钙离子拮抗剂就像忠实的门卫，它与钙离子通道结合后，就阻止了钙离子进入细胞，从而使血管松弛，阻力减小，血压降低。另外，有些钙离子拮抗剂如氨氯地平（络活喜），地尔硫卓还能直接舒张供给心脏血液的冠状动脉，用于治疗心绞痛。） 根据药效学和药动学L 型钙通道阻滞剂可分为三代，第一代有维拉帕米、硝苯地平及地尔硫等; 第二代有非洛地平、尼莫地平、尼群地平及尼卡地平等; 第三代有氨氯地平及拉西地平等。第一代钙通道阻滞剂为一线心血管药，其疗效稳定，不良反应少，但其选择性差，半衰期均较短。第二代具有高度的血管选择性，性质稳定，疗效确切第三代药物除了具有高度血管选择性外，还具有半衰期长、作用持久的特点。目前，临床上常用的钙通道阻滞剂虽然结构各异，但均作用于L 型钙通道，这些药有一定的局限性，大多经肝代谢，生物利用度低，具有负性肌力及频率作用，可出现潮红、水肿及肝功能异常，交感神经激活，神经体液反应，抑制房室结传导，因此有必要开发具有强选择性的、不良反应少的新型钙通道阻滞剂。 其分类如下： 1. 1, 4-二氢吡啶类（如硝苯地平） 2. 芳烷基胺类（如维拉帕米） 3. 苯并硫氮杂卓类（如地尔硫卓） 4. 二苯基哌嗪类 (如氟桂嗪 ) 前三类在临床上广泛应用。 1. 1, 4-二氢吡啶类 硝苯地平 Nifedipine N H CH 3 H 3C 12 3456O CH 3O O H 3C O NO 22'

小鼠海马神经元的培养

小鼠海马神经元的培养 一、实验材料： 1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。 2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水溶解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。 3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml10x平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS） HEPES 3.9g, NaHCO30.84g， 青霉素104U, 链霉素100mg， H2O800ml。 以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm 直径的滤菌器过滤，4℃保存。 4、DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM培

养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min灭活）1%的青/链霉素. 5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2% 的b27+1%抗生素 6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。 7、台盼蓝(typan blue)溶液终浓度为0.2%-0.4%。 8、阿糖胞苷终浓度为8-10μmol/L。 9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。 二、实验步骤： 1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。 2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。 3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。 4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖）,在孵箱中消化5-7min。 5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。

钙离子拮抗剂---信心小总结

低血游离钙可能引起高血压，其机理与钙对膜的稳定效应有关。当血游离钙降低时，膜的稳定效应减弱，膜上相应的电压依赖性钙通道开启，细胞外游离钙流入细胞。并触发“钙流入激活钙释放机制”，使胞浆游离钙进一步增高，最终引起血管收缩，血压升高，称I型缺陷。此型特点为低肾素、低血清游离钙及高细胞游离钙水平。此时，钙离子阻滞剂或补充钙治疗有效；而高肾素一高血清游离钙型高血压，钙离子阻滞剂或补钙治疗效果不佳。 在高血压治疗中的作用及地位。CCB明确适应证为：(1)老年性高血压患者； (2)单纯收缩期高血压患者;(3)高血压有心绞痛患者；(4)外周血管病患者；(5)颈动脉粥样硬化；(6)高血压伴妊娠患者。 钙离子拮抗剂阻滞心肌钙依赖性的兴奋一收缩耦联并在离子通道水平选择性地阻断细胞膜上的钙离子通道 (慢钙通道)，使胞肌浆网释放钙离子下降，同时减少钙离子与钙调蛋白相结合，使肌球蛋白氢键激酶 (MLCR) 活化, 肌球蛋白与肌动蛋白相互作用引起的收缩作用减弱, 使全身血管扩，血压下降。除此之外, 钙离子拮抗剂还具有抑制心肌收缩力、降低心肌耗氧量、松弛血管平滑肌、引起血液动力学变化等心血管系统方面的作用, 而且还具有抑制血小板聚集、抑制神经及分泌系统的兴奋分泌偶联以及减少交感神经末梢递质的释放等作用。

根据其化学结构和药理作用可分为两大类: (1) 二氢吡啶类 (DHP s)，主要作用于血管平滑肌上的L 型钙通道，起到舒血管 和降低血压的作用; (2) 非DHPs, 如维拉帕米、地尔硫卓, 对心肌和血管上的 L 型钙通道作用程度 与 DHPs 相同, 但是对窦房结和房室结处的钙通道有选择性。维拉帕米和地 尔硫卓在扩血管方面较DHP s 差，但是其负性变时、降低交感神经活性的作 用是 DHPs 所不具备的。 根据药物的受体结合特性、组织选择性和药代动力学特点将钙离子拮抗剂划分为 三代: (1) 第一代为短效钙离子拮抗剂, 包括硝苯地平、尼卡地平、地尔硫卓等，容易 引起反射性交感神经激活, 增加心率 , 基本不用于高血压的治疗; (2) 第二代钙离子拮抗剂的药物代动力学特性有所改善，血管选择性有所提高, 性质稳定、疗效确切 , 如硝苯地平缓释片、尼莫地平、尼群地平等, 但其生 物利用度仍很低，峰谷血浆浓度波动较大; (3) 第三代为长效钙离子拮抗剂, 以氨氯地平、拉平、乐卡地平等为代表, 半衰 Ca 2+ Ca 2+通道 Ca 2+内流 -