花粉生活力测定方法研究进展.
花粉生活力测定方法研究进展
摘要:总结了花粉活力测定的染色法、离体萌发法以及田间授粉法等的原理和应用并分析了各种方法的优缺点。
关键词:花粉花粉活力测定方法
花粉是高等植物的雄性配子体,在有性繁殖过程中起到传递雄性亲本的遗传信息。花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象,也是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉具有生长、萌发、或发育的能力。在农业生产及农业常规杂交育种的中,研究花粉的生活力和育性是不可缺少的基础性工作。农业生产和育种工作通常会遇到花期不一致带来的困难,为解决这一难题,保存花粉的活力成为重要手段,而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。因此,掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有较高的作用和意义。
综合前人的研究结果,花粉生活力的检测方法可以分为四大类:①染色法;②萌发测定法;③田间授粉检测法;④形态测定法、无机酸检测法。
1染色法
1.1TTC 染色法
TTC 即 2,3,5-氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料,水溶液无色。基本原理是 [1]:当 TTC 渗入细胞后, 遇到活细胞里的脱氢酶接受氢离子,由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物,由此来判断花粉的生活力。
具体操作步骤:①配制 PH 为 7.17的磷酸缓冲液。称取 0.832克磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾溶于 100ml 的蒸馏水中,调整 pH 为 7.17。② TTC 溶液配制。依据不同植物称取 0.02~1.0g 的 TTC 溶于 100ml 的磷酸缓冲液中, 于棕色瓶中黑暗处保存。③染色。取少量花粉置于载玻片上,加上一滴 TTC 溶液,用镊子搅拌均匀,
盖上盖玻片,然后放置于 35℃的恒温箱中染色 15~20min 。④镜检。于 10×10倍镜下观察,凡具有活力的花粉被染成红色,部分丧失活力的呈现粉红色,无色的是的或不育的花粉粒。凌春英 , 肖恩等的研究 [2]得出常温、黑暗条件下用 TTC 染色 12h 可达到较好的观察
效果,并认为 TTC 法是大花蕙兰和墨兰花粉活力测定便捷、有效的方法。程伟[3]在研究西南桦花粉时通过与离体培养法比较认为 TTC 法是快速检测西南桦花粉生活力的最适宜方法,并得出 TTC 的适宜 pH 值为 7.0。胡君艳,李云,孙宇涵 [4]认为 TTC 法测得银杏花粉的活力相对于 I-KI 法、过氧化物酶法, 最接近离体萌发法测得的花粉活力, 一种较为准确的测定银杏花粉生活力的染色法,且染色 5min 的效果最好。魏佳 [5]在研究百子莲属五个品种的花粉活力时得出 TTC 法不适合百莲子属花粉活力的检测。另外该法还应用于葫芦科 [6]、当归 [7]、番木瓜 [8]、连翘[9]、人心果 [10]、一串红 [11]、月季 [12]等花粉活力的检测。但是该法染色后的花粉颜色差别小,有活力的花粉边缘被染成红色,中间呈现黄褐色,而无活力的花粉整个呈现黄褐色,在显微镜下不易分辨 [13;14]。
1.2醋酸洋红染色法
醋酸洋红染色法的染色原理是靠花粉中的脱氢辅酶而染色, 有活力的花粉被染成红色,部分失去活力的呈现粉红色,而无活力或不育的花粉无色 [15;16]。邢虎成、揭雨成、周清明用醋酸洋红对 15种苎麻花粉生活力测定时, 发现只有一份的花粉活力为 58%, 其他的活力都在 85%以上,而用离体培养得出萌发率最高的为 50%,通过对比认为醋酸洋红发不适合苎麻花粉生活力的快速检测 [17]。许利彩、李海真、沈火林认为醋酸洋红法不适合西葫芦花粉活力的测定 [16];郭庆、王德斌等用醋酸洋红法测定海棠藤花粉活力,所得效果不理想,可能是与海棠藤特殊的花粉块结构有关 [15], 该法在鸢尾属花粉上效果不明显,结果不稳定 [18]。然而该法在澳洲坚果 [19]、胡萝卜 [20]、马铃薯 [21]等花粉生活力快速检测上得到广泛的应用。
2I-KI 染色法
I
2
-KI 染色法的基本原理是 :根据淀粉遇碘变蓝的特性 , 根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量 , 从而确定花粉粒活性的高低。但在无活力的花粉中也会存在淀粉, 这就使得该法测出来的值偏高,对淀粉含量低的花粉不适用,如菊属植物[22]。秦贺兰、
贾宗锴等研究 [23]温室内栽培的万寿菊花粉时,发现 I
2
-KI 染色法与 TTC 染色法所得结果
相似, 综合两种方法所用试剂的特点, 认为 I
2
-KI 染色法更适合万寿菊花粉活力的速测。经过研究得出,该法在防风 [14]、穿龙薯蓣 [13]、玉米 [24]、西南桦 [3]等植物花粉上的速测效果比不上其他的染色方式。另外该速测方法也在刚竹属 [25]、水稻 [26]、苜蓿 [27]、辣椒 [28]等的花粉速测上得到应用。
2.1过氧化物酶染色法
过氧化物酶染色法又称联苯胺染色法, 是根据花粉中过氧化物酶的活性来判断花粉的活力。由于有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶,所用试剂与过氧化物酶发生氧化反应而染色,有活力的花粉被染成红色,无活力的花粉则呈现黄色或无色透明。
胡君艳、李云、孙宇涵等在研究 [4]银杏花粉活力时,发现染色界限不明显,且染色液中的双氧水使溶液产生许多小气泡,不利于观察计数,测得结果偏低,不适合银杏花粉生活力的检测。王苗苗、唐灿明 [29]在研究高温逆境对棉花花粉的影响时,得出的结论是,过氧化物酶法适合在非逆境下花粉活力的检测,而不适合检测高温逆境
下的花粉活力,因为高温下花粉内的过氧化物酶活性降低。而在其他的研究中,则得出的结论是过氧化物酶法适合蒙古扁桃花粉 [30]、台湾恺木花粉 [31]、野生樱桃李花粉 [32]的检测,该染色法优于其他的染色法,与萌发法的结果最接近。
2.2MTT 染色法
MTT 染色法是根据花粉粒中脱氢酶的活性判断花粉生活力,适用试剂是四唑盐类染料, 染料的配制方法为 :1% 2,5-联苯四唑溴化物 (MTT或噻唑兰溶于 5%蔗糖[33]。镜检时, 花粉呈现蓝色表明花粉有活力。张妍 [13]等比较多种方法测定穿龙薯蓣花粉的活力,得出 MTT 法是适宜于穿龙薯蓣花粉活力的检测。蒲高忠 [34]等用该法测定桂林唇柱苣苔和百寿唇柱苣苔的花粉活力,得到明显的效果,刘黎明 [35]等应用该法检测新疆野杏花粉活力, 也得到同样的结果。而姜雪婷 [36]等应用多种方法测定梨的 43个品种, 经过比较认为 MTT 法不适合梨花粉活力的检测,测定值显著偏高。
2.3FCR 染色法
也叫荧光染料反应法,其基本原理是荧光染料本身不产生荧光,无极性,并能自由地透过完整的原生质膜。当此种染料进入原生质后,即被醋酶作用形成一种能产生荧光的极性物质—荧光素。由于荧光素不能自由地出人原生质膜,而只在细胞内积累,因此可以根据花粉产生荧光的情况来判断花粉的生活。
国内这一方面的研究较少, 左丹丹 [33]等在总结植物花粉生活力检测方法中, 得出 FCR 法不适合芜菁芸苔属花粉生活力、橡树花粉生活力及迷迭香花粉活力的测定。
2.4FDA 染色法
是荧光反应法的一种,使用的荧光素为二醋酸酯,原理 [1]与 FCR 法相同。
操作方式为:(1配制 FDA 母液 :将 2mgFD 人溶于 1ml 的丙酮中作为保存液,贮藏在冰箱中备用。
(2配制 FDA 使用液 :使用前将 FDA 母液用一定浓度的蔗糖液稀释至 O.01%,蔗糖浓度决定于供试花粉本身要求的渗透压浓度 , 可预先试验确定一个不使花粉爆裂的最低浓度 ,0.5M 的蔗糖浓度对许多花粉是合适的。
(3将鉴定的花粉泡浸在 FDA 液中, (可用凹玻璃片 ,在开始 1小时内,对生活的花粉,荧光强度随着时间直线增加。一般抱浸 15-20分钟。
(4染色至足够的时间后,用 FDA 液封片。
(5镜检 :在荧光显微镜下,以短蓝光合适〔激发光滤片用 B(IF-490、双分色镜用B ,阻挡光滤片用 0530是合适的〕。生活的花粉发出黄绿色的荧光,无生活力的花粉无荧光。生活力弱的花粉荧光弱。可用物理或化学的方法杀死的花粉作对照。许利彩 [16]等曾用无机酸测西葫芦的花粉活力,得出的结论是该法不适合西葫芦花粉的检测。赵元杰研究 [37]结果表明, FDA 染色法法用于芒花粉初始生活力测定的结果与花粉离体萌发法的测定结果是基本一致的,此方法的分析步骤简单,效率高,适合用于花粉初始生活力的大规模普查分析,但不宜作为跟踪测定芒花粉生活力变化的方法。
2.5其他方法
2.5.1P-苯二胺法 [38]
其基本原理是 , 通过检测一种新的过氧化物酶的存在与否来判断花粉生活力,有活力的花粉通常被完全染成黑色。具体操作为 :
(1染液的配制和保存:把一小管过氧化物酶指示剂 ((包括 25mgp-苯二胺双盐酸和
50mg 邻苯二酚, Sigma 390-1和200μl 3%的 H 2 O
2
(用 pH7.4的磷酸缓冲液配制 ,加入
到 37℃预热的 50 ml稀释的 Trizmal 6.3缓冲液中 (用 Trizmal 6.3浓缩液和去离子水 1∶ 9混合。染液在冰箱中能保存 15~20d ,这期间若发现染液颜色由浅棕色变为深棕色或黑色,说明染液已失效。
(2测定时,取少量 37℃预热的染液滴到待测的花粉样品上, 10~15分钟后观察, 如果花粉变黑,说明花粉具生活力。
2.5.2孔雀绿一酸性品红一桔红 G 混合试剂染色法
该混合试剂将有活力的花粉染成红色,无活力的花粉为绿色,在试验中将少许花粉埋入染色剂中,保持湿度,在室温放置 7— 8 h ,再镜检 [39]。该方法曾用在牡丹[40]、百合 [39]花粉活力的检测上,但结果都偏高,随着牡丹花粉贮藏时间的推移花粉活力并没有明显的变化,甚至 80℃高温处理,染色率也没有明显下降。
3萌发测定法
3.1离体萌发法
花粉离体萌发测定花粉的活力是普遍用到的方法,检测效果最为准确,广泛地应用于各种植物中。取适量的花粉散在培养基上, 在 25℃气温下培养一段时间, 然后再显微镜下观察花粉的萌发,一花粉管大于或等于花粉直径为标准确定花粉的活力。常用的培养基有业态和固态两种,固态培养基就是多加了琼脂,其他的成分一样。培养基的基本成分为蔗糖和硼酸,蔗糖的作用是提供渗透压和花粉管萌发时所需的能量,浓度根据不同的植物而不同,一般为 10%~20%,山楂最适宜的蔗糖浓度为10%[41],桉树的最适宜浓度是 20%[42],风信子的最浓度为 15%[43]。硼酸的作用是促进花粉管的萌发,浓度不同的植物也差别较大, 木麻黄的适宜硼酸浓度为
250mg.kg -1[46], 金银花 [47]、仙客来 [48]以 0.01%硼酸浓度最好,茄子则以 10mg.L 为适宜浓度 [49]。固体培养基的组合中,对不同植物来说是不同, 适合桉树花粉萌发的最佳培养基为 20%蔗糖 +6%琼脂 +0.01%[42]; 茄子适宜的培养基为 O . 5%琼脂+5%蔗糖 +硼酸 lOmg ·L -1[49]; 客来花粉在 10%蔗糖 +O. Ol %硼酸 +l%琼脂的培养基上萌发率最高 [48]。
二细胞型花粉,一般在仅含蔗糖和硼酸的基本培养基上培养即可萌发,但三细胞型的花粉则需加入其他的元素才能促使花粉更好地萌发,如十字花科、菊科、禾本科。在基本培养基中加入 PEG(聚乙二烯明显提高花粉的萌发率 [50]。代光明在研究菊花花粉离体萌发的培养基时,在基本培养基上加入 Ca 和 PEG 时,花粉的萌发率也得到显著地提高 [51]。
3.2活体萌发测定法
基本原理是 [52],具有花粉管的花粉粒能被锚定在柱头上,并且不会被漂洗掉,因此可以通过漂洗柱头和比较漂洗前后柱头上的花粉粒数目来推测其萌发率。操作过程为: (1将待测花粉人工授粉于柱头上, 保证花粉与柱头充分接触, 并把授粉的柱头与外界隔离以免被污染。
(2一段时间后 (以具体物种而定 ,将柱头取下并小心置于 1%的醋酸结晶紫水溶液内。此步骤的目的是使花粉的外壁着上深紫色以易于与浅色的柱头区别开来。
(3用解剖镜对指定柱头上的花粉粒记数。
(4将该柱头用水漂洗几次后 , 再对其上剩余的花粉粒记数。
根据公式漂洗后花粉粒数目 /漂洗前花粉粒数目×100%可得出萌发率。与其他方法
比较，此方法最为直接可靠，王金祥、陈良碧[53]在研究本科植物花粉活力是时就用了此方法。但是只适合于感受性柱头，并且柱头的表面性质对所测的试样也有限制，测得结果偏低。 4 田间授粉检测法基本原理[54]是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力。将新鲜花粉与贮藏的花粉同时授给相关的植物，观测并比较贮藏前后的结实率。孙文耕[54]在李花粉贮藏性与授粉效果的研究中，得出田间授粉的坐果率较低，新制的花粉的做过滤与贮藏的花粉存在显著差异。张照坤[55]用田间授粉得出紫薇划分的生活力，同时也验证长短雄蕊的花药都具备使雌蕊受精的能力。该方法较为精确和可靠，不仅可以得出花粉的活力，而且还可以判断出柱头可授性，但是其费时费力，不利于生产，而且还受到田间气候、环境
条件及母本植株性状的影响，测定结果明显其他方法[54,55]。 5 形态测定法形态测定法的基本原理是根据花粉自身的形状来判断花粉生活力。该法虽然简单，但测定有活力的花粉与实际值相差太大，且重复之间相差也比较明显，一般不采用。苗青[56]等观察文冠果的花粉形态得出，可与花粉和败育花粉的大小相当，表面均有大小不等的疣状突起，萌发沟内有复饰物，如莲花状，不同的是可育花粉极面观可见 3 个萌发沟，贯穿两极，为圆形，而败育花粉的表面有凹陷，萌发沟之间有压痕。 6 无机酸检测法也称瞬时花粉管法，基本原理是，由于酸对花粉粒质膜的刺激作用，使质膜变得非常脆弱，通透性也增大，以致大量地吸收 H+，使内压迅速升高并导致质膜膨胀，最后活性花粉的胞质内含物就会喷射而出，形成“瞬时花粉管” 。此法首选的无机酸为硝酸， 38,52] 38,52 其次是硫酸，硝酸的理想浓度为 0.8mol/L，硫酸的浓度为 14.4%[38,52 。该方法是在体外产生花粉管，但不是真正的花粉管。用该法检验花粉的活力时，在处理好后 5 到 10min 观察有活力的花粉。因花粉吸水后，萌发孔也会膨胀，因此不以判断是否具有活力，所以很少用无机酸检测花粉活力，周莉花等用此方法检测腊梅花粉的活力得到同样的结论[57] ，说明无机酸法不适合腊梅花粉活力的检测。汪妮等[58]在研究韭菜花粉测定方法及袁德义等[59]研究比较油茶花粉生活力检测方法时，也因花粉吸水后也能观察到萌发孔膨胀外突的现象，而认为无机酸不适合这两种植物花粉生活力的测定。杨秀莲等[60]用此法检测桂花花粉的活力时，没有花粉管的萌发，因此此法也不宜用于桂花花粉活力的检测。
7 总结总体上，染色法简单、快速能够在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉的特性影响较大，不能直接表现出花粉的萌发率。因此，不同植物用不同适宜的染色法来检测花粉的活力。发芽测定法是最接近花粉的实际活力，而且观察指标明显，易于区分花粉的活力，在实际应用中以该法最多。用离体培养法测定花粉活力时，需要注意的是，不同植物的花粉对培养基的配方不同，某些植物还需要在基本的培养基中加入除硼以外 6161 63] 的矿质元素及其他的物质，花粉才能够更好地萌发[61-63 。田间授粉法虽然与实际生产最为接近，反映最终的结实率，但其时间周期长，工作量大，而其易受到天气条件、时间地点的影响，且不利于生产，该法在实际应用中很少采用。形态鉴定法虽然简单，但测得值与实
际花粉活力相差太大，各重复间也存在着较大差异，也很少采用。无机酸法是靠经过无机酸处理后，花粉会出现萌发孔有膨胀外突起的现象来来判断花粉是否有活力，但花粉吸水后也会出现此现象，采用无机酸不判断花粉是否真正具有活力。
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植物花粉生活力检测技术进展_左丹丹
植物花粉生活力检测技术进展 左丹丹1,2,明军23,刘春2,王丽娜1 (1.长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025;2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081) 摘要 总结了植物花粉生活力检测的染色法、萌发测定法以及田间授粉测定法等的基本原理和应用,并且分析了各种方法的特点。 关键词 花粉;生活力;检测技术 中图分类号 Q945 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)16-04742-04 Advance in T echnique of P lant Pollen V iability ZU O Dan2d an et al (C ollege of H orticulture and Landscape Architecture,Y angtze University,Jingzh ou,Hubei434025) Abstract T he principle and application of technique of plant pollen viability were summ arized,including staining m eth od,germ ination m eth od and polli2 nation in field m eth od,etc.T he characteristics of different techniques were studied. K ey w ords P ollen;Viability;T esting technique 花粉是高等植物的雄配子体。它在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。花粉既是植物遗传、育种、进化、生殖等研究的重要对象,又是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理试验等的重要材料。花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力。在农业和林业的常规育种中,为了进行人工辅助授粉或杂交授粉,需要早期采集和贮存花粉。尤其是在杂交育种工作中,研究花粉的生活力和育性是必不可少的基础性工作。为了解决亲本花期不一致或远距离杂交的困难,更需要保存花粉的活力。在使用采集和贮存花粉之前,通常要做花粉生活力的鉴定。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命、花粉的适宜贮存条件以及花粉生活力的适宜测定方法均有所差异。这些差异对于研究花粉贮藏期间控制花粉生活力、花粉—柱头间的相互作用、品种改良与育种操作、基因库的保持、不亲和性与受精关系、生理调节对花粉萌发的影响以及基因流等均有重要的实践意义[1]。因此,掌握花粉生活力检测的方法对于提高植物育种效率具有较高的实际应用价值。 1 染色法 1.1 I22KI染色法 I22K I染色法的基本原理是:根据淀粉遇碘变蓝的特性,根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量,从而确定花粉粒活性的高低。 具体操作步骤如下:①I22K I的配制。称取2g K I溶于10 m l蒸馏水中,然后加入1g I2,待全部溶解后,加蒸馏水定容至300m l。②染色。取少量花粉置于载玻片上,滴上1～2滴 I2K I染色液,5m in后在显微镜下观察。③结果判断。凡是染成蓝黑色的花粉粒具较强活力,淡蓝色次之,几乎无色则为无活力花粉。 该方法在柑橘[2]、辣椒[3-4]、梅(桃)属[5]、瓜叶菊[6]、黄 瓜[7]、澳洲坚果[8]等植物上均有应用。该方法的局限在于,它是靠花粉粒内的淀粉着色而进行判定的。虽然花粉失去了活力,但是淀粉依然存在,所以测定值偏高,而且对于那些淀粉含量少的种类如菊属[9]不适宜。 基金项目 国家社会公益研究项目(2005DI B022);湖北省自然科学基金(2004ABA142);林木、花卉遗传育种教育部重点实验室开放 基金(200605212)。 作者简介 左丹丹(1981-),女,湖北宜昌人,硕士研究生,研究方向:园林及观赏植物资源与分子育种。3通讯作者。 收稿日期 20072022061.2 TTC染色法 TT C即2,3,52氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料。TT C染色法的基本原理是:当TT C渗入细胞后,可被呼吸代谢中的还原酶所还原,并由无色的氧化型变成红色的还原型,由此来判断花粉的生活力。 具体操作步骤如下:①磷酸盐缓冲溶液的配制。称取1.673g十二水磷酸氢二钠和0.273g磷酸氢二钾溶解于100 m l的蒸馏水,调整pH值为7.17。②TT C溶液的配制。称取0.02～0.05g TT C(依植物而定)溶解在10m l磷酸盐缓冲溶液中,然后放于棕色瓶中于暗处待用。因氯化三苯基唑有毒,操作时要注意安全。③染色。取少量花粉置于普通载玻片上,滴入TT C溶液2滴,用镊子搅拌均匀,盖上盖玻片,在25～28℃的温度下放置15～20m in。④显微镜下观察。具较强生活力的花粉粒呈红色,微弱活力的花粉粒呈淡红色,无活力或不育的花粉为无色。 该方法已应用于黄瓜[7]、枇杷[10]、猕猴桃[11]、番木瓜[12]、瓜叶菊[7]、芸薹属[13]、百合[14]等的花粉生活力检测。但该方法耗时长,染色后花粉的颜色差别很小,不易分辨,且颜色受染色时间的影响较大,不便统计。 1.3 FCR染色法 FCR染色法即荧光染料反应法(Flu o2 rochrome Reaction),其基本原理是:荧光染料本身不产生荧光,无极性,可以自由地透过完整的原生质膜,当这种染料进入原生质后,即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质———荧光素,并且这种物质不能自由出入原生质膜,而只在细胞内积累,所以可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。而且,该方法可同时反映出酶活和质膜情况2个指标[15]。 具体操作步骤如下:①母液1(SS1)的配制。1.75m ol/L 蔗糖、3.32mm ol/L硼酸、3.05mm ol/L硝酸钙、3.33mm ol/L硫酸镁、1.98mm ol/L硝酸钾,混合后用蒸馏水定容。另外,可以增加蔗糖浓度以避免由渗透压引起的花粉管破裂,也可以根据荧光的强弱来调整盐的浓度。②母液2(SS2)的配制。 7.21mm ol/L双乙酸荧光素(Flu orescein Diacetate)溶于丙酮中,放于4℃冰箱。③染色液的配制。取8～12滴SS2于10m l SS1中,混匀直到该混合液变为轻乳状。④染色。取2～3滴染色液于花粉粒上,盖上盖玻片,2m in后在荧光显微镜下观察即可。产生绿色荧光的花粉具有生活力,无荧光产生的花粉则没有生活力。 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2007,35(16):4742-4745 责任编辑 刘月娟 责任校对 胡先祥
花粉活力测定的3种方法
实验16花粉活力的测定 在作物杂交育种、作物结实机理和花粉生理的研究中，常涉及花粉活力的鉴定。掌握花粉活力快速测定的方法，是进行雄性不育株的选育、杂交技术的改良以及揭示内外因素对花粉育性和结实率影响的基础。 一、花粉萌发测定法 【原理】 正常的成熟花粉粒具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下可直接观察计算其萌发率，以确定其活力。 【器材与用具】 载玻片；显微镜；玻棒；恒温箱；培养皿；滤纸。 【试剂】 培养基：10%蔗糖，10mg/L硼酸，0.5%的琼脂。称10g蔗糖、1mg硼酸、0.5g 琼脂与90ml水放入烧杯中，在100℃水浴中熔化,冷却后加水至100ml备用。 【方法】 1.将培养基熔化后，用玻棒蘸少许，涂布在载玻片上，放入垫有湿润试纸的培养皿中，保湿备用。 2.采集丝瓜、南瓜或其他葫芦科植物刚开放或将要开放的成熟花朵，将花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃左右的恒温箱（或室温20℃条件下）中孵育，5~10min后在显微镜下检查5个视野，统计其萌发率。 【注意事项】 1.不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而改变培养条件。
2.此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度，离体时间，环境条件等因素对花粉活力的影响。 3.不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的葫芦科等植物花粉活力的测定。 二、碘- 碘化钾染色测定法 【原理】 多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I 2 -KI溶液可将其染 成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，I 2 -KI溶液 染色呈黄褐色。因此，可用I 2 -KI溶液染色来测定花粉活力。 【器材与用具】 显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。 【试剂】 I 2-KI溶液：取2g KI溶于5～10ml蒸馏水中，加入1g I 2 ，待完全溶解后， 再加蒸镏水300ml。贮于棕色瓶中备用。 【方法】 采集水稻、小麦或玉米可育和不育植株的成熟花药，取一花药于载玻片上， 加一滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1～2滴I 2 -KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。观察2～3张片子，每片取5个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。 【注意事项】 此法不能准确表示花粉的活力，也不适用于研究某一处理对花粉活力的影响。因为三核期退化的花粉已有淀粉积累，遇碘呈蓝色反应。另外，含有淀粉而 被杀死的花粉粒遇I 2 -KI也呈蓝色。 三、氯化三苯基四氮唑（TTC）法
实验六 种子生活力的快速测定
实验六 种子生活力的快速测定 一、实验目的 1.加深对种子作用的理解； 2.掌握种子生活力的测定方法。 二、实验原理 在播种、交换和调运种子之前，都要及时了解种子的发芽率，以确定是否作为播种材料或引种种源。因此，快速而又准确地测定种子生活力，对于及时调种和播种后确保全苗、壮苗具有极其重要的意义。种子生活力是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。 有生活力的种子进行呼吸作用，呼吸代谢途径催化产生的氢（H ） 种子生活力越强，代谢活动越旺盛，被染成红色的程度越深； 死亡种子没有呼吸作用，不会将TTC 还原成红色； 种胚生活力衰退或部分丧失生活力，染成较浅或局部被染色； 三、实验材料及用品 材料：绿豆种子 实验器皿：恒温箱、小烧杯、镊子、刀片 实验试剂：0.5%TTC 溶液（避光保存） 四、实验步骤 1. 浸种：将待测种子在 30 ～ 35 ℃温水中浸种，以增强种胚的呼吸作用。 2. 显色 ：a 、种子处理：随即选取吸胀的种子 40 粒，小心剥去种皮，勿伤及种胚。 b 、实验组处理：将处理好的20粒种子置于小烧杯中，加入0.5%TTC 溶液，以 刚好浸没种子为宜，恒温（32℃）中保1h 。 c 、对照组处理：另取20粒种子，于沸水浴中煮5min 后，加入0.5%TTC 溶液， 以刚好浸没种子为宜，恒温（32℃）中保温1h 。 有生活力的种子进行呼吸 作用，呼吸代谢途径催化产 生的氢（H ）
3. 统计：染色结束，马上鉴定；倒出TTC溶液，用清水将种子冲洗1-2次，观察种胚乳染 色情况。有生活力种子：种胚全部或大部分被染成红色；无生活力种子：不被染 色。 生活力的种子数 计算种子生活力的比率= ————————X 100% 实验组测定种子数 五、实验现象与结果 表一种子染色情况记录表 图1 未煮沸的种子染色情况 图2 煮沸的种子染色情况 生活力的种子数 未煮沸的种子生活力的比率= ————————X 100% = 14/20 X 100% = 70% 实验组测定种子数
三种常用检测种子生活力方法比较
植物生理学小论文 三种常用检测种子生活力方法的比较 班级：09级生物技术2班 学号: 系别: 化学与生命科学系 : 雪婷 日期：2012年5月15日
浅谈三种常用检测种子生活力的方法 雪婷 （师学院化学与生命科学系675000） [摘要] 种子活力是种子最重要的生理及生产指标之一，近年来，无论在育种选种方面还是植物生理实验方面都得到广泛关注。本文基于对种子活力的概念、影响种子活力的因素和种子活力快速测定的最新研究进展为基准, 对TTC法、BTB法及红墨水染色法三种常见种子活力快速检测方法进行了简要综述。结论：四氮唑染色法是蔓荆子种子生活力测定的最佳方法，生活力与发芽率呈显著的正相关。 关键词：种子活力；TTC法；BTB法；红墨水染色法；研究进展 The discussion on three kinds of methods to detect seed vigor SUN-xueting （Chuxiong normal university，chuxiong，yunnan675000，China） Abstracts: The seed vigor is the most important physiological and seed production indexes. In recent years，No matter in selecting seeds breeding or in plant physiology experiments. The seed vigor is widely mentioned This paper based on the concept of the seed vigor influence factors of the seed vigor and the seed vigor rapid determination of the latest research progress Comparition of three kinds of methods to determine seed vigor. Keywords: seed vigor ；Triphenyl Tetrazolium Chloride method；Bromo—thymol blue method; red ink method;research progress 种子生活力是检测种子质量最重要的指标之一，它对于种子的发育，萌发，成熟以及成长为植株的潜在能力具有十分紧密的联系。对于科学选种，快速预测种子的利用价值也具有重要的意义。快速检测种子生活力的方法很多，但生产实验及植物生理实验中常用的主要有氯化三苯基四氮唑(TTC)法、溴麝香草酚蓝(BTB)法和红墨水染色法。这三种方法都能快速测定种子的正常生理代功能是否受到损害，胚是否存活,以了解种子是否还具有发芽的潜力。 种子生活力（seed viability)是指种子的发芽潜在能力和种胚所具有的生命力，通常是指一批种子中具有生命力（即活的）种子数占种子总数的百分率。早在1876年种子学的创始人Nobbe（德国）[1]就指出在同一批种子存在个体间发芽和幼苗生长速度的差异，并且不
花粉生活力测定方法研究进展.
花粉生活力测定方法研究进展 摘要:总结了花粉活力测定的染色法、离体萌发法以及田间授粉法等的原理和应用并分析了各种方法的优缺点。 关键词:花粉花粉活力测定方法 花粉是高等植物的雄性配子体,在有性繁殖过程中起到传递雄性亲本的遗传信息。花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象,也是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉具有生长、萌发、或发育的能力。在农业生产及农业常规杂交育种的中,研究花粉的生活力和育性是不可缺少的基础性工作。农业生产和育种工作通常会遇到花期不一致带来的困难,为解决这一难题,保存花粉的活力成为重要手段,而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。因此,掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有较高的作用和意义。 综合前人的研究结果,花粉生活力的检测方法可以分为四大类:①染色法;②萌发测定法;③田间授粉检测法;④形态测定法、无机酸检测法。 1染色法 1.1TTC 染色法 TTC 即 2,3,5-氯代三苯基四氮唑,它是一种氧化还原染料,水溶液无色。基本原理是 [1]:当 TTC 渗入细胞后, 遇到活细胞里的脱氢酶接受氢离子,由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物,由此来判断花粉的生活力。 具体操作步骤:①配制 PH 为 7.17的磷酸缓冲液。称取 0.832克磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾溶于 100ml 的蒸馏水中,调整 pH 为 7.17。② TTC 溶液配制。依据不同植物称取 0.02~1.0g 的 TTC 溶于 100ml 的磷酸缓冲液中, 于棕色瓶中黑暗处保存。③染色。取少量花粉置于载玻片上,加上一滴 TTC 溶液,用镊子搅拌均匀,
花粉的形态观察及生活力测定
实验一花粉贮藏及花粉生活力的测定 花期不遇给杂交工作造成困难，有的园林植物可通过调整花期来解决，有的则不得不进行花粉贮藏，或者从外地寄运花粉。为了避免杂交工作失误，在使用外地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉的生活力进行检测，以便对杂交结果进行分析与研究。因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术 一、实验目的 掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。 二、实验材料 百合、金鱼草、菊花等花粉。 三、仪器及药品 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、吸水纸、TTC（2.3.5—氯化三苯基四唑）、KI-I2、蓝墨水。 四、实验原理 花粉在低温（ 0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。 花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过
氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。 鉴定花粉生活力的方法很多，概括起来主要有如下几种： 1 ．直接测定法将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。 2 ．形态观察法直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。 3 ．染色观察法 1 ）碘－碘化钾染色法：以碘－碘化钾溶液（ 0.3g 碘＋ 1.3g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水）染色后于显微镜下观察，花粉被染成蓝色者表示具有生活力，花粉呈黄褐色者不具有生活力。 2 ） TTC 染色法：使用TTC测定花粉生命力的原理，主要是无色药液进入花粉遇到活组织里的脱氢酶，接受氢离子，还原成红色三苯基甲腊TTF，还原结果使有生命力的花粉染上红色，死花粉不着色；花粉生活力强弱有异，染色深浅也有不同。在28—30℃的温度下2小时以上(花卉不同染色时间也不同)。
花粉生活力测定
实验九花粉生活力测定 一、实验目的 1．学习和了解植物花粉生活力测定方法及原理。 2．初步掌握稻、麦的花粉生活力测定方法。 二、内容说明 农业常规育种工作中，为了进行人工辅助授粉和杂交授粉，尤其是杂交育种工作，为解决亲本花期不一致和远距离杂交的问题，通常需要早期采集和储藏花粉。不同类群植物花粉在自然条件下的寿命，花粉的储藏条件，以及花粉生活力的测定有所区别，这一是由花粉本身的特征决定的，二是由贮藏条件决定的。一般来说，禾谷类作物花粉的寿命较短，自花授粉植物花粉的寿命尤其短，如小麦在花药开裂后30min，花粉即由鲜黄色变为深黄色，此时己有大量花粉丧失活力。 在许多特殊条件下，花粉生活力的差异对于研究花粉-柱头的相互作用，作物改良与育种操作，基因库的保持，不亲和性与受精关系，生理调节对花粉萌发的影响和基因流等，均有非常重要的实践意义。因此，对于外地采集来的花粉的短暂贮藏、花粉的生物学研究、自交或远缘杂交分析结实率或不结实原因、鉴定雄性不育系时，花粉生活力的测定显得很重要。 花粉生活力有很多表述法，为了方便起见，现将各种表述方法列表如下(表9-1)，以供参考。 表9-1 花粉生活力的各种表述法 花粉生活力的测定方法较多，通常可分为萌发测定和不萌发测定两大类，常用的有：（1）形态鉴定法是一种简便的鉴定新采集花粉的方法。可通过直接观察花粉在形态上有明显差异来鉴定花粉有无生活力。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物充实饱满，形状规则，大小整齐。因
内部含有较多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代花粉形态和育性的鉴定。 （2）染色鉴定法（FCR法）用不同的化学试剂如双乙酸荧光素(fluorescein diacetate)、联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。双乙酸荧光素是一种荧光染料，其本身不产生荧光，无极性，可以自由地透过完整的原生质膜。当此种染料进入原生质后，即被酯酶作用而形成一种能产生荧光的极性物质—荧光素，并且这种物质不能自由出入原生质膜，而只在细胞内积累，所以，可以根据花粉产生荧光的情况判断花粉的生活力。此方法可同时反映出酶活和质膜情况两个指标。 （3）花粉发芽测定法配制一定浓度的蔗糖溶液等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验。根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。 三、材料仪器药品 1．材料当天采集的稻、麦任一种作物的新鲜花粉。 2．仪器用具冰箱、荧光显微镜、普通显微镜、恒湿箱、载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、镊子、解剖针、吸水纸、滤纸、标签、铅笔等。 3．药品KNO3、NaOH、MgSO4、MnSO4、Ca(N03)2、H3BO3、1%I-IK溶液、双乙酸荧光素、丙酮、乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、苯胺蓝、冰醋酸、蔗糖、琼脂、马铃薯淀粉、蒸馏水。 四、方法步骤 花粉的育性和生活力可由浅入深按以下顺序观察鉴定：外形观察→I-IK测定内含物的充实度→染色法鉴定花粉酶学性质→花粉发芽试验→观察花粉在柱头上萌发和伸长情况。 （一）形态鉴定 1．将少量正常的稻、麦的新鲜花粉用解剖针播于一般载玻片上，于低倍显微镜下观察花粉形态。根据形态特征，判断花粉的生活力状况。一般来说，畸形、皱缩、小型化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。将观察的结果统计一下填写表格9-2。 2．与形态观察相同。但在有花粉的载玻片上滴1滴1%I-IK，再观察花粉是否染色和染色深浅情况，以判断花粉内含物的充实度。正常花粉应有较多的淀粉粒，遇I-IK呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。 （二）FCR测定法（荧光染料反应法) 荧光染色法可根据细胞质膜完整性判断花粉的生活力。迅速简便，与萌发测定有相
实验四、花粉生活力的测定
实验四、花粉生活力的测定 一、实验目的：通过实验掌握花粉生活力测定的具体技术和方法。 二、实验原理：花粉生活力是指在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 三、实验材料：苹果花粉 四、实验用具与试剂：指形管、显微镜、载玻片、盖玻片、凹式载玻片、滴瓶、培养皿、天平、烧杯、玻璃棒、微波炉、滤纸、水浴锅、计数器、镊子；碘化钾（KI）、碘、蓝墨水、蒸馏水、蔗糖、琼脂、硼酸等。 五、实验步骤 常用的测定花粉生活力的方法：形态观察法、碘-碘化钾染色法、蓝墨水染色法和培养基发芽法。 1. 形态观察法 直接在显微镜下观察花粉的形态，根据花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。具体方法：将花粉置于载玻片上，在显微镜下观察3个不同视野，要求被检查的花粉粒总数达到100粒以上，计算正常花粉粒占总数的比率。 此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。 2. 染色法 (1) 碘-碘化钾染色法 ①原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正常花粉用I-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当I-KI染色时呈黄褐色。 ②I-KI溶液：取2.0 g KI溶于5～10mL蒸馏水中，然后加入1.0 g I2待全部溶解后，再加蒸馏水至200mL，贮于棕色瓶中备用。 ③具体方法：取少量花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再加一滴I-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察。凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。为了保证实验的准确性，要求观察不同的3个视野，求其平均值，统计花粉生活力。 (2) 蓝墨水染色法 ①蓝墨水溶液：正常购买的蓝墨水稀释10倍。
四唑法测定种子生活力Word版
四唑染色法测定种子生活力 福建农林大学20**级农学0******* ***** 一、目的 1、了解种子生活力测定方法 2、熟悉利用四唑染色法测定种子活力方法及操作方式 二、原理 有生活力的种子活细胞在呼吸过程中都发生氧化还原反应，四唑溶液作为一种无色的指示剂，被种子吸收后参与活细胞的还原反应，从脱氢酶接受氢离子，在活细胞里产生红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲。化学反应如下：DPNH2 + TTC DPN + TTCH + HCl （辅酶IH2）（四唑）（辅酶Ⅰ）（甲）（氯化氢） H N‐N‐C6H5N‐N‐C6H5 ∥2H ∥ C6H5‐C C6H5‐C +HCl \ \ N﹦N+‐C6H5 N＝N‐C6H5 无生活力的种子则无此反应。 根据种子的四唑显色的部位，即可区分有活力的部分和死亡部分。一般鉴定原则是，凡是胚的主要结构及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有生活力的种子。凡是胚的主要构造局部不染色或染色成异常的颜色和光泽，并且活营养组织部染色成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已软腐或异常、虫蛀、损伤、腐烂的为死种子。 三、试材与设备 1、材料大豆种子 2、设备烧杯、滤纸、刀片、镊子、恒温培养箱 3、试剂 1.0%的四唑溶液 四、实验步骤 从净度分析后并经过充分混合的大豆种子中，随机抽取30粒，3次重复。 1、种子预湿将选取的大豆种子水浸预湿，室温下浸泡8h，使其充分吸胀。 2、种子处理将吸胀的大豆种子的种皮去除，掰开子叶，露出子胚芽，保持湿润备用。 3、四唑染色将处理好的种子放入烧杯中，加入1.0%的四唑溶液，将种子淹没，然后置于35℃恒温培养箱中避光染色0.5~1 h。 4、观察鉴定将染色后的大豆种子经清水冲洗后进行染色情况的观察鉴定。胚部全部显成鲜红色、仅子叶远离胚芽部分少量未染色、仅子叶边缘少许未染色，为有生活力的种子。 5、结果计算及处理统计各个重复中有生活力的大豆种子数，并计算其平均值。
种子发芽箱延长种子生活力与提高种子发芽率
延长种子生活力和提高种子发芽率 一、简介概述： 提供种子生长的最适宜环境种子发芽需要合适的环境参数，如温度、湿度、光照度、空气质量等。种子发芽需要每个参数的参与，任何一个参数如果超出了临界值，都会造成不可逆的后果。但是，自然环境的各种参数，受着很多情况的制约导致它的不可控，从而决定了种子发芽的不可知性。那么如何才能做到对种子发芽充分了解和控制呢。现在市场上有很多种子发芽箱或者光照箱等仪器，就是为人们解决自然环境参数的不可控制性而研发生产的。我们不得不承认，这些种子发芽箱或者光照箱的诞生，改变了种子或者植物的生长，让我们对植株的生长有了更加深刻的认识和更加全面的掌握。水分：水分是一切植物生长的源泉，是所有植物生长最重要的因素。有了水分，种子才能进行呼吸作用，才能进行细胞生长，才能进行其他一切生命活动。温度：种子发芽需要合适的温度，一般的，种子发芽的温度在0-40℃，而一般种子发芽的最适温度为15-30℃之间，如太阳花的适宜发芽温度为13-18℃。植物的发芽温度因植物而异，因原产地而异。光照度：一般种子的发芽都需要阳光，需旋光性植物，而一些嫌旋光性植物并不需要阳光。由于这一特性，植物播种后可以根据植物种子发芽是否需要阳光来决定是否覆盖土壤。而种子发芽箱正好弥补了自然界的各种环境参数，如温度的不可控，湿度的不可知性。跟光照箱类似，种子发芽箱采用微电脑全自动控制，控制板一体化，能够人工任意设置种子发芽的温度、湿度和光照度，以及运行时间。此时我们只需将程序设定成种子发芽最合适的温度、湿度等，就能够保证种子按照我们需要的方式发芽，基本达到我们预期的发芽率要求。这样，不仅大大提高了种子的发芽率和成活率，同时也节约了成本和资源。 二、功能特点： 具有超温和传感器异常保护功能，保证仪器和样品安全；选配全光谱的植物生长灯，有利于植物的生长，提高抗病性。具有掉电记忆、掉电时间自动补偿功能。种子发芽箱采用大屏幕液晶屏程序控制，中文指导操作流程，操作简单，控制精确，可设置0-99个时段随意自动转换功能，具有超温和传感器异常保护功能，保证仪器和样品安全。
三花粉的贮藏和生活力测定
实验三花粉的贮藏和生活力测定 一、目的和要求 在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 从生产上来看，在选择相互授粉的品种时，也应考虑到品种的花粉发芽能力，凡是花粉发育不全的品种，其花粉的发芽率都很低。因此不适宜做授粉品种。 本实验的主要目的是掌握花粉贮藏和花粉生活力测定的方法。 二、花粉及用具 材料：桃或苹果树的花粉。 用具：显微镜、天平、盖玻片、凹式载玻片、培养皿、干燥器、试管、滴瓶、蒸馏水、凡士林、蔗糖、氯化钙、琼脂、联苯胺、α-奈酚、碳酸钠、过氧化氢等。 三、方法 （一）花粉贮藏 从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中，放于干燥的室内，令其开裂，花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中，口上塞以棉花或橡皮塞，贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内，使花粉在空气相对湿度较低的条件下（一般0～40%）保存；为了减少呼吸作用，可以放在低温（0～4℃）黑暗的地方贮藏。 （二）花粉生活力试验 1、花粉发芽法 人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。 （1）培养基的制作与接种 一般采用5～20%蔗糖或葡萄糖加1～2%琼脂，溶于蒸馏水中。加热煮沸即可，将已配制好的培养基保持在40℃温度即不凝固，用玻璃棒点一点培养基敷在载玻片的凹坑内，然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。轻轻振动，使花粉均匀地撒在培养基上，将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上，并
花粉生活力萌发试验
实验二花粉生活力的测定―――悬滴培养法 一、实验目的：掌握了解花粉生活力测定的意义和方法。 二、实验材料：二月兰花粉 三、实验仪器及药品：凹玻片、盖玻片、解剖针、镊子、纱布、标签、铅笔、显微镜、恒温 箱、蔗糖、蒸馏水、硼酸、凡士林。 四、实验原理：花粉是植物自然授粉和人工杂交的主要物质基础，花粉生活力的大小是保证 杂交成功的关键。在有性杂交育种中，常因父母本花期的不同，作为父本的花粉必须经过贮藏直到母本植株开花时再用于授粉（花粉在低温0－2℃、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低。花粉贮藏的原理就是创造代谢强度低的环境，以延长花粉的寿命）；或者双亲不在同一个地方，必须由外地邮寄花粉供应。经过贮藏或外地邮寄的花粉是否已经丧失生活力，必须经过测定才能确定。 鉴定花粉生活力的方法主要有四种：一是将待测花粉直接授粉，然后统计结实率和结子数。此法的缺点是需要的时间较长，且实验的结果易受气候条件的影响。二是将待测花粉授到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下检查花粉的萌发情况。根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。三是在培养基上进行花粉的人工萌发，检查待测花粉萌发率的高低。后两种方法都是根据花粉的萌发率来反映生活力的高低，有一定的参考价值。但是萌发的不一定都能受精，特别是人工萌发还受许多条件的限制，所以也只有相对的可靠性。四是用染色方法来鉴定花粉的生活力。其原理是在活的花粉内有过氧化氢酶的存在，它可以促进过氧化物（如H2O2）放氧分解。这些刚被放出的活性氧很容易使还原剂氧化，常用无色联苯胺、α－萘酚等还原剂做指示剂，这些还原剂被氧化后表现红色或玫瑰红色。如果花粉是活的，那么会很快被染成红色或玫瑰红色，如果花粉是死的，则这一反应迟迟不能进行，花粉保持原色。此法优点是比较快捷，但是比较间接。本试验采用悬滴培养法鉴定花粉生活力。 五、实验步骤： 1.配培养液：用蒸馏水和蔗糖分别配成5％、10%、15％的蔗糖溶液，并在各培养液 中加少量硼酸。 2.取盛开的正在散粉的二月兰花朵。 3.播花粉：在凹玻片的凹点滴一滴清水。在盖玻片中央滴一滴培养液，用镊子轻轻夹 取二月兰的花药，在培养液中央轻轻蘸一下，使花粉均匀的分散在培养液的球面上。 在盖玻片的四角涂抹少量的凡士林，用镊子夹住盖玻片在上提的过程中迅速把它翻 转过来，小心放在凹玻片上，使培养液处在盖玻片和凹点形成的小密室中。每个凹 玻片分别做蔗糖溶液的三个浓度，并用蒸馏水做对照。 4.培养：做好的凹玻片上贴好标签，注明花粉种类、培养液的浓度以及时间，然后小 心放到铺有湿润滤纸的培养皿中，放到22－24℃的恒温箱中培养5h。 5.观察：从恒温箱中取出凹玻片，在低倍镜下随机观察三个视野，计算花粉的萌发率。 以花粉管长度达到花粉粒径的2倍及以上视为萌发。 六、结果分析 1.分析花粉萌发率高或低的原因。 2.本实验关键性步骤总结及实验中所存在问题的讨论。 七、作业 1.绘制一幅花粉粒萌发形态图。 2.花粉生活力测定在杂交育种中的重要意义？测定花粉生活力的方法有哪些？
实验四 种子生活力测定
实验四种子生活力测定 一、目的要求 应用化学药剂处理和生物化学法快速测定体眠种子生活力并比较不同方法的效果。 二、材料用具 （一）材料：水稻和玉米种子 （二）药品：2．3—5一氯化三苯基四氮唑和红墨水等。 三、方法步骤 （一）四唑盐类法： 1．在洁净的水稻种子中，随机数取试样2份，各100粒剥去谷壳，浸入30℃的水中6－8小时。 2．用2．3．5－氯化三苯基四氮唑配制成的溶液，装在棕色玻璃瓶里，保存在黑暗中。 3．将已剥去壳的软化的米粒沿种胚纵切，取其一半浸于已配好的药液中，放于暗处（最好用棕色发芽皿盛放），经24小时可观察结果，如果提高温度可以缩短处理时间（40℃1小时）。 4．观察结果：凡种胚的主要构造染成深红色者为有生活力的种子，凡种胚的主要构造染成浅红色或不染色者为无生活力的种子。 5．具体种子具体做法： 取水稻种子样品200粒，去壳，放纸间或水中30℃预湿12h，沿种子侧面胚纵切，放入0.1%四唑溶液35℃染色1-2h，凡是胚的主要构造染成正常鲜红色，或胚根尖端2/3不染色而其他部分正常染色的种子为有生活力种子。 （二）红墨水染色法： 1．从洁净玉米种子随机数取试样二，各100粒，于30℃温水中浸2-3小时。 2．配制红墨水溶液，用红墨水加水配成1：60的溶液。 3．取出软化过的种子，沿胚切成对半，取其半粒种子。 4．浸入红墨水溶液，15分钟后取出，用清水冲洗。 5．观察结果：凡种胚的主要构造不染色或染色浅者为有生活力的种子，凡种胚染色者为无生活力的种子。
四、结果表示与报告 计算各个重复中有生活力的种子数，重复间最大容许差距不得超过附表（生活力测定重复间的最大容许差距）的规定，平均百分率计算到最近似的整数。
百合花粉生活力测定
百合花粉生活力测定 孙永田 （齐齐哈尔大学生命科学与农林学院园艺101，齐齐哈尔 161006） 摘要百合，球根花卉近年来在我国市场需求越来越大，培育新的百合品种是我国花卉科研工作者的工作之重。通过染色观察发测定百合花粉生活力，本实验采用两种方法为碘-碘化 钾法和α-奈酚法。 关键词百合生活力测定染色观察法碘-碘化钾法α-奈酚法 引言我国球根花卉近年来生产面积不断扩大，特别是百合种球的用量不断增加，根据资料统计2004年国内种植百合的面积达2567hm2，生产切花4.7亿枝，但是每年生产中使用的种球一亿粒以上都是从荷兰进口的。我国是百合属植物自然分布的中心，原产于中国的约47种，野生百合种质资源丰富，有很多独特的特性。但是长期以来，我国百合的育种工作远远落后于荷兰、美国、日本等发达国家，充分利用我国丰富的野生百合资源和国外的优良品种资源，培育具有自主知识产权的百合新品种，打破垄断行为，加快百合产业的发展，是我国花卉科研工作者的当务之急。 当前育成的百合新品种中，大部分采用的是常规杂交育种方法，一部分为远缘杂交种。进行杂交工作之前，熟悉掌握花粉的生活力是育种工作的必要准备。从花粉生活力作为亲本选择的标准进行亲本筛选，提高杂交授粉成功率。 1 试验方法和试验方案 1.1试验方法 染色观察法 1.1.1碘-碘化钾法（I-KI） 碘-碘化钾溶液的配制：取2g碘化钾溶于5~10ML蒸馏水中，然后加入1g碘，待全部溶解后加入蒸馏水至300ML定容。取适量新鲜花粉置于载玻片上，加1滴蒸馏水，再加1~2滴碘-碘化钾溶液，盖上盖玻片，置于低倍显微镜下观察。凡花粉粒被染成蓝色的表示具有生活力，呈黄褐色为缺少生活力的花粉。 1.1.2α-奈酚法 A.配置药液：①将0.20g联苯胺溶于100ml的50%的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。 ②将0.15gα-奈酚溶于100ml的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。③将0.25克碳酸钠溶于100ml蒸馏水中，盛入白色瓶中备用。④将以上三种溶液等量混合，即成“甲液”，盛入棕色瓶中。⑤将3%过氧化氢，临用前用蒸馏水稀释成0.3%溶液，即成“乙液”，随配随用。 B.制片：取花粉少许，撒入凹型载玻片的凹点内，滴入“甲液”，片刻后再滴入“乙液”，三至五分钟后，在显微镜下观察不同的五个视野。凡有生活力的花粉为红色或玫瑰红色。黄色的（不着色的），为无生活力的花粉。 1.2实验方案 取同种百合花，不同生长程度的百合花花粉，分别用两种方法染色实验花粉生活力。取5 组花粉，每组花粉查看五个视野观察花粉生活力情况，每个视野读书用“，”隔开。A表示从开裂的百合花花药上采集的花粉，A取三组。B表示从即将开裂的百合花花药上采集的花粉，B取两组。
花粉生命力的测定与形态观察
实验三花粉生命力的测定与形态观察 花期不遇，给杂交工作造成困难，有的树木和园林植物可通过催延花期解决，有的则不得不进行花粉贮藏，为此我们必须掌握花粉贮藏的原理与技术。 为了避免杂交工作失误，在使用远地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉生命力进行鉴定，以便对杂交成果进行分析与研究。 一、实验目的 掌握了解花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法及原理。 二、实验材料 芙蓉花的花粉。 三、仪器及药品 载玻片、盖玻片、标签、标记笔、显微镜、蔗糖、蒸馏水、联苯胺、 -萘酚、酒精、碳酸钠、过氧化氢、琼脂。 四、实验原理 在园艺植物有性杂交工作中，常因杂交亲本间花期不遇，或父本植株栽在异处(地)而必须预先收集花粉。花粉贮藏在低温(0～4℃)、干燥(相对湿度0～40％)、黑暗的环境下，代谢降低，可以较长时间地保持花粉生活力，但其贮藏期长短对花粉生活力的影响因品种而不同。在授粉之前，对贮藏的或外地采来的花粉必须预先测定花粉的生活力，以确定哪些花粉不能用于杂交，这对取得杂交效果有直接影响。 一是将待测花粉直接授粉，然后统计结实率和结子数。此法的缺点是需时间较长，且实验结果易受气候条件的影响； 二是将待测粉受到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生命力； 三是在培养基上进行花粉的人工萌发，检查待测花粉萌发率的高低。将花粉播种在特定的培养基上，并在一定的环境条件下来测定其发芽能力的方法。培养基常用蔗糖、琼脂(1％)和蒸馏水配制而成。不同植物的花粉，对蔗糖浓度要求不同，如柑桔花粉要求25％左右，苹果和梨10～15％，桃10％左右为宜。蔗糖浓度高低可调节培养基的渗透压，以防止花粉在培养基上破裂。培养基以微酸性为宜，一般在pH5.2～6之间。发芽温度在20～25℃左右，并需要空气和湿度，为了促进花粉发芽，在培养基中还可加入少量的硼酸和维生素B1。 利用花粉发芽试验测定花粉生活力是一种直接的测定方法，其结果也最可靠，但操作较麻烦，要有一定设备和一定时间。 四是用染色方法来鉴定花粉的生命力。其原理是在活的花粉内有过氧化氢酶
种子生活力的测定
种子生活力的测定 一、氯化三苯基四氮唑（TTC）法 【原理】 凡有生活力的种子胚部在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的种胚则无此反应。当TTC溶液渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH或NADPH）还原时，可产生红色的三苯基甲（TTF），胚便染成红色。当种胚生活力下降时，呼吸作用明显减弱，脱氢酶的活性亦大大下降，胚的颜色变化不明显，故可由染色的程度推知种子的生活力强弱。TTC还原反应如下： TTC（无色）TTF（红色） 【仪器与用具】 培养皿2套；镊子１把；单面刀片１片；垫板（切种子用）１块；烧杯１个；棕色试剂瓶；解剖针１把；搪瓷盘１个；pH试纸。 【试剂】 TTC溶液的配制：取1g TTC溶于１L蒸馏水或冷开水中，配制成0.1％的TTC溶液。药液pＨ应在6.5～7.5，以pH试纸试之（如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水）。 【方法】 1.将玉米、小麦等作物的新种子、陈种子或死种子，用温水（30℃）浸泡2～6h，使种子充分吸胀。 2.随机取种子2份，每份50粒，沿种胚中央准确切开，取每粒种子的一半备用。 3.把切好的种子分别放在培养皿中，加TTC溶液，以浸没种子为度。 4.放入30～35℃的恒温箱内保温30min.也可在20℃左右的室温下放置40～60min. 5.保温后，倾出药液，用自来水冲洗2～3次，立即观察种胚着色情况，判断种子有无生活力，把判断结果记入表32-1内。 表32-1 染色法测定种子生活力记载表 方法种子名称供试粒数有生活力种 子粒数 无生活力 种子粒数 有生活力种子 占供式粒数的% 【注意事项】 1.TTC溶液最好现配现用，如需贮藏则应贮于棕色瓶中，放在阴凉黑暗处，如溶液变红则不可再用。 2.染色温度一般以25～35℃为宜。 3.判断有生活力的种子应具备：胚发育良好、完整、整个胚染成鲜红色；子叶有小部分坏死，其部位不是胚中轴和子叶连接处；胚根尖虽有小部分坏死，但其它部位完好。 4.判断无生活力的种子应具备：胚全部或大部分不染色；胚根不染色部分不限于根尖；
种子生活力的测定红墨水法教学设计
《林果生产技术》实验实训2“种子质量的简易测定”之五： 种子生活力的测定（红墨水法）教学设计 课题：种子生活力的测定（红墨水法）课型：专业技能实训课 班级：2014级现代农艺班时间：2015年10月9日 教学目标： 1、应知：种子生活力的概念，红墨水法测定生活力的原理、意义、步骤。 2、应会：掌握用红墨水染色法测定种子生活力的操作技能，熟悉种子质量鉴定技术过程。 3、能力培养：学会自主学习、合作学习、探究学习，培养动手能力、观察能力、合作意识和专业情感。 教学重点： 小麦种子生活力红墨水染色法测定的方法步骤。 教学难点： 1、切分种子。 2、有无生活力的判断。 教学方法：
1、紧抓生本课堂的五大元素“前置学习、合作学习、展示分享、质疑问难、教师点拨”，让学生自主学习，先做后学，先学后教。 2、恰当运用信息化教学手段。 课前任务布置： 提前一天晚自习分发学案和适量材料样品（每小组分发经浸泡后充分吸胀了的小麦种子50粒左右，单面刀片2片，镊子2把，放大镜1个），自学时间2课时。学案附后。 材料器具准备： 经浸种吸胀后的小麦种子（每小组600粒左右）、直尺、烧杯、9cm培养皿（每小组4套）、镊子（每人1把）、单面刀片（每人1片）、瓷盘、洗瓶、滤纸、5%红墨水。 导入： 种子质量的好坏，直接关系到农业的丰歉。种子的纯度、净度、发芽率、生活力、含水量等是种子分级、是否合格的重要指标。今天我们以小麦种子为例，通过实训操作一起来学习种子生活力的测定方法。同学们课前已经做了预习，在操作之前我们先来弄清楚几个问题，分小组回答： 问题一：种子生活力指的是什么？（一组回答） 答案：种子生活力是指种子潜在的发芽能力。