发酵过程及优化实验

发酵过程及优化实验

——产淀粉酶细菌的优化实验

淀粉酶是一类能催化淀粉糖苷键水解的酶类，作用于淀粉分子产生糊精、低聚糖及葡萄糖等多种产物。而淀粉酶是应用最广的酶制剂之一，占全球酶工业市场份额的25%-33%。淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物有机体中。

目前，已报道的能够产生淀粉酶的微生物种属包括不动杆菌属、微球菌属、黄隐球酵母、盐单胞菌属、青霉菌属、类芽孢杆菌属、链霉素属、假单胞菌属和杆菌菌属等。

实验一培养基的配置、灭菌

一、实验目的

1. 温故配制微生物培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤。

2. 了解鉴别性培养基的原理，并掌握配制鉴别性培养基的放到和步骤。

二、实验原理

鉴别性培养基是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生胞外淀粉酶。

三、材料和器材

（1）培养基：

普通培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。鉴别型培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。另一个鉴别性培养基加可溶性淀粉15g每1000ml。（2）器皿：电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管等。

（3）其他：药匙，记号笔，报纸等。

（4）碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

稀碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。

四、方法和步骤

1．配制基本培养基，分装50mL至250mL锥形瓶，供实验菌株扩增。

2．配制鉴别培养基，检测实验菌株是否能产胞外淀粉酶。

3．配制稀释用的生理盐水，分装4.5mL至每个试管（11管）。

4．包扎培养皿、锥形瓶，移液管等。

5．121℃，灭菌20min。

6．将实验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培养基上培养2天，在菌落周围滴加碘液，根据透明圈的大小，挑取合适的单菌落进行后续实验。

在加可溶性淀粉15g/L的鉴别性培养基中涂布的稀释梯度分别是10-3，10-4，10-5。在加可溶性淀粉10g/L的鉴别性培养基中涂布的稀释梯度分别是10-5，10-6，10-7。

五、注意事项

将实验菌株涂布至鉴别性培养基表面时，掌握好稀释度，尽量获得单独的单菌落，以利于后期的筛选。

六、实验结果

1．菌落的透明圈

透明圈

2．菌落计数

一、实验目的

1．了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。

2．学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法。

二、实验原理

将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中，在适宜的条件下培养，定时测定培养液中微生物的生长量（吸光度或活菌数的对数），以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线，它反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律。依据生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量和培养条件而异。因此，通过微生物生长曲线的测定，可了解微生物的生长规律，对于科研和生产实践都具有重要的指导意义。

测定微生物的数量有多种方法，如血球计数法、平板活菌计数法、称重法、比浊法等。本实验采用比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸光值（A）也称光密度成正比，只要用分光光度计测得菌液的A后与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线，此法快捷、简便。

产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。工业发酵的目的是为了收获产物，因此必须搞清楚产物积累最高时所需的发酵时间。如果提前终止发酵，营养物质还没有完全被利用，发酵液中的产物量偏低；如果发酵时间过长，一方面产物可能会分解，另一方面也降低了设备利用率。因此，学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有非常重要的指导意义。

三、材料和器材

1．菌种

实验菌株。

2．培养基

普通培养基，鉴别性培养基。

3．器材

高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，分光光度计，摇床等。

四、方法和步骤

（一）生长曲线的测定

1. 将实验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培养基上培养2天，在菌落周围滴加碘液，根据透明圈的大小，挑取合适的单菌落进行后续实验。

2. 将选择的菌挑取到新鲜的基本培养基中，放置摇床上30℃，180rpm培养，过夜。

3. 将第2步中培养得到的菌悬液摇匀，吸取0.5mL接入新鲜基本培养集中，30℃，180rpm培养，每隔4h取一瓶，在560nm处测吸光度，以未接种、但已灭菌的

基本培养基作对照；每隔2小时取次样。

4. 以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作生长曲线。

（二）产物形成曲线的测定

同上，在进行生长量测定的同时，进行产物形成量（淀粉酶活力）的测定，以培养实验为横坐标，产物形成量为纵坐标，作出产物形成曲线。

五、注意事项

1．各瓶的接种量、培养条件应一致。

2、若吸光度太高，可适当稀释后再测定。

六、结果记录

1．数据记录

2．绘制出实验菌株的生长曲线和产物形成曲线。

从标曲中，查出对应时间下吸光度值A660下的淀粉浓度，计算出酶活力。

生长曲线及淀粉酶活力图见下个实验的实验结果中。

实验三液化型淀粉酶活力的测定

一、实验目的

1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。

2．掌握在微生物分批培养时酶活力测定的基本方法。

二、实验原理

淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶，淀粉1,4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶），淀粉1,4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1,6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的黏度下降，因此又称为液化型淀粉酶。

淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。

三、材料与器材

1．样品

实验二中的发酵液4000rpm，5min 离心得到的上清液作为粗酶液。

2．试剂

（1）碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容

至500mL，贮于棕色瓶中。

（2）比色稀细碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。

（3）2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，倒入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100mL。须当天配制。

（4）pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）

4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100mL。

（5）0.5mL/L乙酸溶液，0.85%生理盐水。

3．器材

恒温水浴锅、分管光度计。

四、方法和步骤

1．标准曲线的制作

（1）将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%和2%的稀释液。

（2）吸取淀粉稀释液 2.0mL加至试管中，再加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液

1.0mL，40℃水浴保温5min。

（3）加蒸馏水1mL，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10mL。

（4）吸取反应液1mL，加稀碘液10mL，混匀，在660nm下测得吸光度A（用

2.0mL蒸馏水代替步骤（2）中的淀粉稀释液作为对照）。

（5）以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。

标准曲线：

2．淀粉酶活力测定

用2%可溶性淀粉按1（2）操作，用稀释后的粗酶液1mL代替1（3）中的蒸馏水，测得吸光度A660，从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。

3．酶活力计算

酶活力以每毫升粗酶液在40℃，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。

实验四实验菌株的培养基条件的优化

一、实验目的

1．了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出实验菌株的最佳培养条件。

2．掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。

二、实验原理

发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮量高，还应增加培养基中氮源比例。但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可考虑用流加的方法逐步加入碳氮源。

培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。

选择碳源时常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉，而用豆饼粉、黄豆粉等作为氮源；此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基的优化实验。

发酵培养基中的原料多是大分子物质，微生物一般不能直接吸收，必须通过胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“迟效性”营养物质。而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖，可适当在培养基中添加一些速效营养物。

三、材料与器材

1．菌种

实验菌种。

2．培养基

以基本培养基为基础，分别添加葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖作为碳源。

3．器材

电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、超静工作台。

四、方法与步骤

1．查阅资料，选定培养基中碳源的含量，计算出对应的葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖和乳糖的量（以碳含量相同为准则）；配置相应培养基。

2．将实验菌株接种至新鲜的基本培养基中，30℃培养过夜。

3．将上述菌悬液以10%的接种量接种至各个培养基中，30℃，180rpm培养，培养时间以之前测出酶活最高点为准。

4．检测各个培养基培养的实验菌株的菌含量及酶活量。

五、结果记录

1、各个碳源对实验菌株生长的影响图

从芽孢杆菌生长情况来看，用淀粉作碳源最为合适。(不同碳源对实验菌株生长量由大到小顺序为：可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖。)

2、各个碳源对实验菌株产酶的影响图

从芽孢杆菌的生产淀粉的酶活力的情况来看，以乳糖为碳源的培养基最佳。(不同碳源对实验菌株产酶酶活力由大到小顺序为：乳糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖。)

六．思考题

1. 如若通过鉴别性培养基鉴定该实验菌株不产生透明圈，是否可以认定该菌就不产淀粉酶？原因是什么？

不可以。原因还有可能是该菌产的淀粉酶很少，透明圈不明显；或是培养时间不够，还没有开始产淀粉酶。不一定代表该菌就不产淀粉酶。

2．如果每次从同一摇瓶中取出1mL进行测定，会对结果产生怎么样的影响？

这样的话前面测的值与后面测的值除了培养时间不同之外，培养液的多少等其他条件也不相同，无法在只有一个变量的情况下相互对照，结果会变得不准确。3．本实验中产物形成量用淀粉酶活力来表征，是否合适？为什么？

合适。产生的淀粉酶用来分解淀粉正好是酶活力在此次试验的定义即以每毫升粗酶液在40℃，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数。

4．根据实验所得曲线，我们可以得到哪些结论？

一段时间内枯草芽孢杆菌量不断增加，超过一段时间后开始缓慢减少。而酶的活力也随时间先升后降，最高处有一个酶活力最高的时间。

5. 查阅相关资料，提出切实可行的提高酶活量的相关措施。

1）培养基的成分以及含量应该选择最佳的量。2）最佳的培养时间和温度。

3)温度、pH等条件适宜。4）适当添加有益于菌体生长的物质。

6. 根据本实验设计的思路，请设计考察不同氮源的种类及含量对实验菌株生长和产酶的影响。

1）将实验菌株接种至新鲜的基本培养基中，30°C培养过夜。

2) 查阅资料，选定培养基中氮源的含量，计算出对应的植物蛋白、牛肉膏、

酵母膏、硫酸铵、硝酸铵的量（以碳含量相同为准则）；配置相应培养基。

3) 将上述菌悬液以0.2ml的接种量接种至各个培养基中，30℃，180rpm培养，培养时间以之前测出酶活最高点为准。

4）检测各个培养基培养的实验菌株的菌含量及酶活量。

实验小结

本次实验主要是是产淀粉酶细菌的优化实验。步骤就是筛选产淀粉酶的菌株，测出生长曲线及酶活力，最后找出最适合菌株生长及产酶的碳源。

在加可溶性淀粉15g/L的鉴别性培养基上涂布的菌液稀释倍数太低，导致10-3 的平板菌落生长的太密集而无法计数，这是以后实验要注意的。鉴别性培养基上菌落生长的大致规律是稀释倍数越小的，长得菌越多越密，也比较小；稀释倍数大的平板上的菌长得菌比较少，但是明显比稀释倍数少的平板要长得大。

在实验中，在用稀碘液滴定透明圈时，要注意不要滴到菌上，挑取菌株时选择长得比较大的单菌落挑取。在测定生长曲线时，要适当稀释菌液，我们稀释了6倍。

配制培养基时不要忘记调PH，实验过程中注意操作规范。

第10章 发酵过程的优化和放大

第10章生物过程的优化和放大 生物过程的研究一般经历 摇瓶培养→小罐培养→中试→生产规模 10.1 生物过程的优化 优化方法 1单次单因子法 2统计法：Plackett-Burman法，部分因子设计法响应面法，响应面法 响应面法：中心组合设计法，Box-Behnken法 3改进单纯形法 统计法一般需要经过以下几步：实验设计；实验结果的数据分析，以得到合适的数学模型；数学模型的检验，即方差分析；求解最优化值及其校验。 一、Plackett-Burman法 Plackett-Burman法是一种两水平的实验设计方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，但无法考察各因子对发酵的相互交叉的影响，因此常作为响应面法的初步实验，用于确定影响发酵过程的重要因子。 1. 实验设计 Hadamard矩阵 设计的准则为： 1)若要考察k 个因子，则需要进行N=k+1个实验，为便于进行方差分析，往往要求k 至少 包括1-3个虚构变量，即空项，且k为奇数； 2)每个因子取两个水平，即用“＋”、“－”分别代表其高、低水平，低水平为原始培养条件， 高水平约取低水平的1.25倍； 3)矩阵每行含“＋”的数目为(k+1)/2，含“-”的数目为(k-1)/2，而每列含“+ ”、“-”的数目相等； 4)矩阵第一行任意排列，但必须符合上述要求，最后一行全部为“-”；其余行以上一行的最 后一列为该行的第一列，上一行的第一列为该行的第二列，其余类推。 2. 数据分析 3. 方差分析 二、响应面法 1. 实验设计 2. 数据分析 3. 方差分析 4. 优化 10.2 生物过程的放大 不管是微生物细胞、动、植物细胞还是重组质粒，要进行工业化生产，都必须经过放大中试阶段，生化过程的放大有各种各样的方法和手段，其放大方法和原理林林总总，对具体某一体系来说，用何种放大模式可以快捷地成功过渡到工业化生产，没有固定模式，必须针对具体菌种生理生化及培养基及环境条件的放大效应综合考虑，至目前为止，生化过程放大一直是个长脖子的事。 传统的工业放大，一般要经过四个阶段：实验室摇瓶培养、实验室小型发酵罐培养、中间工厂和生产工厂。 一、摇瓶与罐培养的差异 摇瓶的试验条件放大到生产罐或小发酵罐的试验条件转移到大发酵罐时，它们所得产物的产量往往不完全一致，特别是产抗生素的新菌株，差异更大，当然也有一致的巧合。引起这种

微生物发酵培养基的优化方法

工业发酵进展

微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。

3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法

发酵过程优化原理复习

发酵过程优化原理复习 1、 发酵过程优化的目标 答：①建立生物反应过程的数量化处理和动力学模型。 ②实现发酵过程优化，以更好地控制发酵过程； ③规避生物技术产业化过程的技术风险，追求其经济效益； 2、发酵过程优化主要涉及的研究内容 答：①细胞生长过程研究，了解微生物从非生物培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环境条件下微生物的代谢产物分布； ②根据微生物代谢反应符合质量守恒定律，对微生物反应的化学计量进行研究，简化对发酵过程的质量衡算； ③研究生物反应速率及其影响因素，建立生物反应动力学，这也是是发酵过程优化研究的核心内容。 ④生物反应器工程，包括生物反应器及参数的检测与控制，它们是发酵过程优化最基本的手段。 3、Hasting （1954年）指出生化工程要解决的十大问题是哪些？ 答：深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害。其中通气搅拌与放大是生化工程学科的核心，其中放大是生化工程的焦点。 4、Cooney 指出，要实现发酵过程的优化与控制，必须解决好哪些问题？ 答：必须解决好5个问题：①生物模型；②传感器技术；③适用于生物过程的最优化技术；④系统动力学；⑤计算机-监测系统-发酵罐之间的接口技术 5、流加发酵、分批发酵、连续发酵方式的优缺点比较 答：①与传统的分批发酵相比，流加发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应和代谢阻遏等；与连续发酵相比，流加发酵则具有染菌可能性更小，菌种不易老化变异等优点。 ②与流加发酵和连续发酵相比，分批发酵工艺操作简单， 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题， 对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。但其 人力、物力、动力消耗较大，生产周期较长，生产效率低。 ③连续发酵最大的优点是，微生物细胞的生长速度、代谢活性处于恒定状态，可达到稳定高速培养微生物或产生大量代谢产物的目的，且便于进行微生物代谢、生理生化和遗传特性的研究，在工业上可减少分批培养中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等操作时间，提高了生产效率和自动化程度。 6、重组生物药物生产过程的优化包括哪6个方面 答：①适宜宿主的选择；②重组蛋白积累位点（如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累）的确定；③重组基因最大表达的分子策略；④细胞生长和生产环境的优化；⑤发酵条件的优化；⑥后处理过程的优化。 7、操作细胞循环生物反应器时必须考虑哪两个因素？为什么？ 答：①稀释率（流速/体积），因为稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同； ②循环速率（指通过过滤系统的培养基速率），因为高的循环速率可使组分混合均匀，但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。 因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。 8、细胞生长过程可以分为哪3个步骤，运输过程包括其中的两个步骤，在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关心的内容，在细胞膜上可能存在哪些运输机制？各有何特点？ 答：（1）细胞生长过程的3个步骤：①底物传递进入细胞；②通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物；③代谢产物排泄进入非生物相； （2）研究表明在膜上存在3种不同的运输机制：①自由扩散；②协助扩散；③主动运输。 特点：①自由扩散和协助扩散只有存在浓度梯度时，由高浓度向低浓度的运输才可能发生，统称被动运输，在运输过程中不需要提供外部能量； 自由扩散分子扩散的质量通量遵守Fick 第一定律，通过自由扩散进行运输的化学物质主要有氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等；协助扩散是通过膜上的转运蛋白来进行物质运输的，具有选择性，其运输速率比自由扩散又快又多，运输速率遵循典型的饱和型动力学。 ③主动运输是逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能，以特定的膜内蛋白作为运输过程的媒介，可以逆着浓度梯度的方向进行运输，因此是一个耗能的过程，根据运输动力来源可以分为一级主动运输和次级主动运输两大类，还有一种特别的主动运输过程为基团转移。 9、发酵过程数量化处理包括哪些方面的内容？常规的参数一般包括哪些？通常如何测量这些参数？ 发酵过程的数量化处理包括：①发酵过程的速度；②化学计量学和热力学；③生产率、转化率和产率； 10、比速率和速率有什么区别？ 答：比速率是一个相对速度，表示细胞的个体行为，反应了细胞的生长和代谢能力，它与生物量（以细胞干重表示）或有催化活性物质的量（如酶量）有密切的关系，各种比速率的单位均为h -1，定义类似于化学反应动力学中比速率r i *的定义 速率：是绝对速率，所表示的是细胞的整体行为，不能代表系统的特征。 11、生物反应过程中有关的宏观产率系数及定义 答：宏观产率系数（或称得率系数）Y i/j （i 表示菌体或产物，j 表示底物）是常用于对C 源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，将消耗的量同 形成的量关联起来，定量表示细胞或产物甚至热量的产率，也能用于定量的表示不同消耗量之间或形成量之间的相互关系，最初是由Monod 以质量单位和商的形式定义的： 12、Y A TP 与其它产率系数相比有何特点？ 答： ，是Bauchop 以异化代谢中ATP 的生长量作为菌体产率的基准而定义的。Y ATP 与微生物及底物种类无关，基本为一常数。 在复合培养基的厌氧培养中，不管微生物和环境的性质如何，Y ATP 总是约为10.5g/mol 。但该值对微生物生长具有普遍性。在基本培养基中无论是厌氧还是需氧培养，单一碳源中一部分作为能源通过异化代谢分解，其余部分用于同化构成菌体。假设用于同化的这部分碳源与ATP 生成无关，则对于异化代谢的碳源亦服从Y ATP ≈10g/mol 。 13、复合培养基厌氧培养过程中细胞的生物合成步骤及ATP 的生成和利用途径 P26 14、代谢产物理论产率系数和实际过程产率系数有何区别？影响实际过程产率系数的因素有哪些？ 答：假设发酵过程中完全没有菌体生成，则Y P/S 可以达到最高值，即为理论代谢产物产率，可以根据化学计量关系、生物化学计量关系计算。 而在实际发酵过程中的实际产率是变化的，所以需对产率系数的概念进行修正。实际产率值取决于各种生物和物理参数。 ，式中μ为比生长速率；m 为混合度；s 为底物浓度；t 为平均停留时间；t m 为混合时间； OTR 为氧传递速度 15、微生物反应动力学模型的类型及着眼点。Monod 模型属于什么模型？其使用的条件包括哪些? 底物消耗的质量细胞形成的质量==-=≈--=??-=ds dx dt ds dt d Y r r //x s s x x s x s x t 00t s /x Y M Y A x ATP/s s x/s ?=??=TP Y ATP

发酵过程及优化实验

发酵过程及优化实验 ——产淀粉酶细菌的优化实验 淀粉酶是一类能催化淀粉糖苷键水解的酶类，作用于淀粉分子产生糊精、低聚糖及葡萄糖等多种产物。而淀粉酶是应用最广的酶制剂之一，占全球酶工业市场份额的25%-33%。淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物有机体中。 目前，已报道的能够产生淀粉酶的微生物种属包括不动杆菌属、微球菌属、黄隐球酵母、盐单胞菌属、青霉菌属、类芽孢杆菌属、链霉素属、假单胞菌属和杆菌菌属等。 实验一培养基的配置、灭菌 一、实验目的 1. 温故配制微生物培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤。 2. 了解鉴别性培养基的原理，并掌握配制鉴别性培养基的放到和步骤。 二、实验原理 鉴别性培养基是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生胞外淀粉酶。 三、材料和器材 （1）培养基： 普通培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。鉴别型培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。另一个鉴别性培养基加可溶性淀粉15g每1000ml。（2）器皿：电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管等。 （3）其他：药匙，记号笔，报纸等。 （4）碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。 稀碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。 四、方法和步骤 1．配制基本培养基，分装50mL至250mL锥形瓶，供实验菌株扩增。 2．配制鉴别培养基，检测实验菌株是否能产胞外淀粉酶。

发酵工艺优化

发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！

发酵工艺优化

发酵工艺优化---现代发酵工业调控策略 发布日期：2010-04-10 来源：[标签:来源] 作者：[标签:作者] 浏览次数：716 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH 值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物

发酵过程中的优化

发酵过程中的优化 高望 （兰州理工大学生命科学与工程学院） 摘要：发酵过程优化控制技术是发酵工程的重要技术。综述了近年来微生物发酵过程优化控制技术的研究现状，综合运用微生物反应计量学、生化反应和传递动力学、生物反应器工程及代谢工程理论，(1) 基于微生物反应计量学的培养环境优化技术；(2) 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术；(3) 基于反应动力学模型的优化技术；(4) 基于代谢通量分析的优化技术；(5) 基于系统观点的生物反应系统优化技术；（6）基于环境胁迫的优化技术；（7）基于辅因子调控的优化技术 关键词：发酵过程优化 1 发酵过程优化技术 1.1基于微生物反应计量学的培养环境优化技术 研究微生物从培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响，进而优化微生物生长的物理和化学环境，保证微生物生长处于最适的环境条件下，为进一步的发酵过程优化奠定基础。：(1) 培养基组成的优化技术。 (2) 发酵环境条件的优化技术。研究表明，培养基中的氮含量与葡

萄糖消耗及丙酮酸积累密切相关。氮源缺乏时, 葡萄糖消耗和丙酮酸生产均受到抑制。在小型反应器流加发酵中采用氨水控制pH 值( 相当于同时提供氮源) , 细胞能够持续、快速地积累丙酮酸。[1]李寅；陈坚；梁大芳营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响[J]生物工程学报2000,16（2）：225-227 1.2 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术 对分批发酵过程的研究发现，适合微生物生长的温度、pH 值、剪切和溶解氧浓度往往并不一定适合目标产物的形成，提出分阶段溶解氧和搅拌转速控制策略、分阶段温度控制策略及分阶段pH 值控制策略，将环境条件控制在最适合细胞生长或最适合产物合成的水平。研究表明，郑美英等以Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｍｏｂａｒａｅｎｓｅ为出菌株，研究了培养中温度控制策略，并在小型发酵罐上进行了验证。得出ＴＧ发酵过程中温度控制策略为：Ｏ～１８ｈ，控制温度为３２℃，１８ｈ后将温度切换到２８℃。采用此温度控制策略在２．５Ｌ小罐上进行ＴＧ发酵，酶活比未控制温度时的最好水平提高了１４%，发酵时间也缩短了６ｈ。由此可见，采用合理的温度控制策略确实能够显著提高ＴＧ的发酵过程中的各项指标。郑美英堵国成陈坚分批发酵生产谷氨酰胺转氨酶的温度控制策略[J]生物工程学报，200,16（6）：759-761 刘延岭，邓林，周昌豹，陈丽微生物发酵生产谷氨酰胺转胺酶的研究进展四川食品与发酵 2004,4：1-4 1.3 基于反应动力学模型的发酵过程优化和控制技术 研究不同目标代谢产物发酵过程的反应动力学，应用统计热力学理论和功能单元扩展理论，建立目标代谢产物分批发酵过程的动力学模型，用龙格库特法求取模型方程数值解，然后用单纯形搜索法或最速下降法寻出动力学模型方程中的最优参数，并对动力学模型的适用性进行评价。基于分批发酵动力学模型，在下列3 个方面已取得一定成果：①采用奇异优化理论，优化透明质酸的流加培养过程，并通过重复操作和优化补料组合发酵模式，显著提高透明质酸的生产强度[23]；②应用最小值原理，分别建立真氧产碱杆菌细胞生长期和聚羟基丁酸合成期底物流加的准优化控制策略，确定以指数速率流加和变速流加相结合的流加操作方式，得到以聚羟基丁酸最大生产强度和最高转化率为目标的准优化控制策略并成功应用[24－25]；③在无反馈控制的情况下，比较了不同流加培养模式对重组大肠杆菌生产谷胱甘肽的影响，发现采用简单的指数速率流加方式即可实现重组大肠杆菌的高密度培养[26]。 1.4 基于代谢通量分析（MFA）的发酵过程优化技术 参考已知的生化反应计量关系和特定微生物的代谢途径和生理代谢特征，构建生物合成特定目标代谢产物的代谢网络。利用代谢通量分析方法，对代谢中间产物进行拟稳态假设，然后通过测定细胞和代谢产物浓度的变化速率，计算得出胞内各条代 谢途径的通量变化。根据代谢通量分析的计算数据，分析特定目标代谢产物，如丙酮酸、透明质酸和生物絮凝剂生物合成途径中主要代谢节点的性质(刚性、弱刚性或弹性)，结合发酵

发酵工艺优化

发酵工艺优化 发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统

微生物发酵过程优化控制技术进展

微生物发酵过程优化控制技术进展 摘要发酵工程是生化工程和现代生物技术及其产业化的基础。在发酵工程领域，为了提高发酵水平和生产率，更多的研究工作集中在菌种的筛选和改造上。随着生物科学技术的发展，基因工程与代谢工程研究领域都出现了长足的进步与发展，利用基因重组与诱发等技术可以实现高产菌株普遍生产。但只有通过发酵过程的优化控制，才能实现产品质量最高、生产力最大、成本消耗最低的生产过程，因此对微生物发酵过程的优化控制成为发酵工程中研究人员日益关注的焦点。 关键词微生物发酵；影响因素；优化控制技术 1 培养基对发酵的影响 1.1 发酵培养基碳源和氮源的选择 碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞以及形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂等，比如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及豆油等。氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的重要来源，与此同时，氮源也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源以及有机氮源，比如氨盐、硝酸盐、蛋白胨以及豆粉等。 1.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响 无机盐对代谢产物的生成及微生物的正常生长都具有相当重要的影响。在微生物的生长代谢过程中，磷参与了微生物细胞中核酸等辅酶的构成，是微生物能量代谢、生长的重要因素之一。在苏云金芽泡杆菌的发酵产物苏云金素的分子结构中包含磷酸根，所以在其发酵培养基中添加更多磷酸盐，更有利于产物苏云金素的合成。钙离子在微生物发酵过程中的主要作用是调节细胞的生理状态，比如说维持细胞的胶体状态、降低细胞膜的通透性等。与此同时，在大多数发酵培养基里面，添加适量的CaCO3，能够对发酵液含菌量的变化起到相当明显的影响，其主要原因是CaCO3的添加对发酵液的pH具有非常良好的缓冲作用，从而大大改善了菌体的生长环境。镁元素是许多酶的催化剂。锰、锌、铁、钼以及钴等元素是微生物所需要的微量元素[1]。 2 培养条件对发酵的影响 2.1 种子质量对发酵的影响 在发酵培养基中接入合适的接种量以及种龄适宜的优质种子液，能够使目标微生物更加迅速地进入到对数生长期，从而使发酵周期大大地减短，进而促使产物质量得以有效提升。如果种龄过长则会直接导致菌体过早的发生衰退，菌体的生产能力也随之而有一定程度的下降；如果种龄过短，则会直接导致菌体生长缓慢，产物合成时间大大推迟。若接种量过小，那么便会使得菌体细胞的生长量变

发酵工艺条件的优化修订稿

发酵工艺条件的优化集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]

发酵工艺条件的优化 发酵优化对于搞发酵的工作者而言是非常必需的，下面结合其他战友的一些经验之谈引出此专题，希望大家踊跃讨论，以其提高发酵水平和解决实际问题。 发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平.发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。 注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,我总结了以下几累,也不是很全,当然从其他的方面进行交流也可以,但是希望你注明附加说明!!!谢谢大家的参与!!!!!!!!!一. 好氧发酵1. PH 工艺的优化2. 溶氧工艺的优化3.原材料工艺的优化4.消毒(灭菌)工艺的优化5.菌种制备工艺的优化6.小试到中试,中试到生产等扩大实验的工艺优化7.成本工艺优化8.种子罐工艺的优化9.发酵罐工艺参数控制的优化10.仪表控制的工艺优化11.环境的工艺优化12.染菌处理的工艺优化13.紧急情况处理的工艺优化(停电\停水\停气\停汽等)14.补料工艺的优化15.倒种工艺的优化16发酵设备的工艺优化17.其他的工艺优化 二. 厌氧工艺的优化三.固体发酵的工艺优化四.其他1. PH工艺的优化A.配料中的PH 很重要,其中有配前PH,配后PH,消前PH,消后PH,接种前PH,工艺控制PH等,配前PH,配后PH,可以用来检测厡材料的质量,初步估计配料的情况,如果出了错误,有时候可以从PH中的变化看出来,能够减少错误的发生.B.另外,每次有新的配方我们总是要用PH方法检测其中的每种厡材料是否会和其他的发生反应,可以互相两两混合,检测PH的变化,也可以用来作为配微量元素的检测.C.消前PH可以用来减少消毒过程对培养基的破坏,因为培养基在消毒中会有PH的变化,在不同的PH条件下对培养基破坏也不一样,因此可以在消毒的时候选择合适的PH,消毒完后可以调节过来,这样一来可以对PH敏感的一些原材料减少破坏,这种方法在生产中已经取得了初步的成绩,提高了指标.D.工艺控制的PH,在发酵的产抗期间,通过在不同的发酵时间调整不同的P H,可以减少杂质的产生,同时还可以缓解溶氧,比如在头孢发酵中,通过在后期调整PH可以减少DCPC的含量,给提取工序带来很大的好处,E.补料罐通过PH的调节可以更好的通过流加物料而不影响发酵.(部分发酵在不同时期的PH有所不同,所以通过补料罐的调整可以对发酵指标有所提高)F.发酵过程中的PH调节可以通过各种方法,不一定要添加氨水和氢氧化钠,可以添加玉米桨等其他的物料来进行调节.G.控制放罐时的PH可以对后面的过滤有所影响,所以一定要控制好放罐前的PHH.绘制种子瓶和种子罐以及发酵罐等整个发酵过程的PH生长曲线,可以用来参考控制工艺,检测无菌情况的发生.A. 华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化

微生物发酵过程优化控制技术进展

CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2008年第27卷第8期·1210· 化工进展 微生物发酵过程优化控制技术进展 王建林，冯絮影，于涛，薛尧予 （北京化工大学信息科学与技术学院，北京 100029） 摘要：微生物发酵过程优化控制技术是发酵工程的重要技术。综述了近年来微生物发酵过程优化控制技术的研究现状，讨论了机理分析建模、黑箱建模、混合建模等发酵过程建模方法，对基于模型的优化控制策略进行了分析。指出了基于混合模型和多目标优化策略建立动态优化控制器，是微生物发酵过程优化控制的有效方法，并给出了实现优化控制需要解决的关键问题。 关键词：发酵过程；过程建模；非线性控制；优化控制 中图分类号：TP 18；TP 274 文献标识码：A 文章编号：1000–6613（2008）08–1210–05 Research progress of optimal control techniques in fermentation process WANG Jianlin，FENG Xuying，YU Tao，XUE Yaoyu （School of Information Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）Abstract：The optimal control technology of the microbial fermentation process is a crucial part of fermentation engineering. The researches on bioprocess optimal control techniques in recent years are reviewed from two points，modeling and control methods. The modeling techniques include the mechanism based methods，the experience based ‘black-box’ methods，and the hybrid methods by combining different modeling techniques. The progress of the research in the model based optimal control strategies are reviewed. It demonstrates that an efficient method to deal with the control problems in bioprocess optimization is to construct a dynamic optimization controller，based on hybrid modeling and multi-objective optimization techniques. Finally，some important problems which need to be resolved in the implementation of fermentation optimal control are presented. Key words：fermentation process；process modeling；non-linear control；optimal control 发酵工程是生化工程和现代生物技术及其产业化的基础。在发酵工程领域，为了提高发酵水平和生产率，更多的研究工作集中在菌种的筛选和改造上[1]。尽管现代生物技术在基因工程和代谢工程领域内有了长足的进展，通过诱发变异、基因重组和培养能够得到高产菌株，然而，通过优化控制使发酵过程产品生产最优（即生产能力最大、成本消耗最低、产品质量最高）仍是发酵工程领域中存在的主要问题之一，因此对微生物发酵过程优化控制的研究日益受到重视。微生物发酵过程优化控制的主要问题是建立过程模型和制定优化控制策略和算法。近年来，微生物发酵过程优化控制技术研究已经取得了一些进展，发酵过程建模方面的主要研究成果包括：机理分析建模、黑箱建模和混合建模。发酵过程优化控制策略方面的主要研究成果包括：基于线性化近似的经典优化控制，基于直接寻优算法的仿真优化控制，基于非线性系统理论的优化控制以及基于人工智能技术的优化控制。 1 微生物发酵过程建模 1.1 基于过程机理分析的建模 发酵过程机理分析建模是基于质能平衡、Monod方程、Contois方程等建立过程机理模型[2]，以及从基因分子、细胞代谢和反应器等多尺度建立 收稿日期：2007–12–28；修改稿日期：2008–03–25。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（20676013）。 第一作者简介：王建林（1965—），男，博士，教授，主要研究方向 为复杂工业过程智能检测与优化控制。电话010–64433803；E–mail wangjl@https://www.sodocs.net/doc/1a3857354.html,。

发酵过程优化

第一章、绪论 第一节发酵过程优化在生物工业中的地位及其研究内容 一、发酵过程优化在工业中的地位 现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地生产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊化学品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环境等重大问题的过程中必将发挥积极的作用 二、发酵过程优化的研究内容 第一个方面是细胞生长过程研究 第二个方面是微生物反应的化学计量 第三个方面是生物反应过程动力学的研究（主要研究生物反应速率及其影响因素） 第四个方面的内容是生物反应器工程（包括生物反应器及参数的检测与控制） 第二节、发酵过程优化的研究进展 一、发酵过程优化是生物反应工程的研究前沿之一 生物反应动力学的研究内容：是有关生物的、化学的与物理过程之间的相互作用，诸如生物反应器中发生的细胞生长、产物生成、传递过程等及影响微生物反应宏观动力学的重要因素 生物反应动力学研究的目的：是为描述细胞动态行为提供数学依据，以便进行数量化处理 二、流加发酵 1、概述 流加发酵即补料分批发酵(fed-batch fermentation),有时又称版连续培养或连续发酵,是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法 2、流加发酵与连续发酵和分批发酵的比较 流加发酵介于分批发酵和连续发酵之间,兼两者的优点,又克服了两者的缺点.

3、流加发酵的研究进展 (1)、在20世纪70年代以前流加发酵的理论研究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加 1973年日本学者Yoshida 等人首次提出了“Fed-Batch Fermentation ”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，流加发酵的研究才开始进入理论研究阶段 其后,随着研究深入,流加发酵在一下三个方面有重大进展 20世纪70年代中后期对流加发酵过程的动力学解析 结合发酵过程的可测参数对流加过程进行反馈控制（如DO 法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH 法、代谢物法、萤光法等） (2)流加发酵的最优化研究 流加发酵最优化研究的核心问题是找出最佳的底物流加方式，以维持发酵过程始终处于最佳状态 流加发酵最优化的研究内容包括： 状态方程的建立;目标泛函的确定;最优化底物流加方式的求解 (3)对流加过程进行反馈控制 流加发酵的物料衡算式可以表达为： 方程试中, μ , π , σ 分别代表菌体,产物生成比速度及其 质消耗比速,在等式中是以个相对于X,P,S 的函数,它可以是X,P,S 中某单一因子的函数,也可以是X,P,S 中两个或三个因子的函数. 4.高生产率和细胞密度发酵 细胞生长环境的优化策略 (1)培养基组成的优化 (2)特殊营养物的添加 (3)限制代谢副产物的积累 培养模式 (1)所培养细胞的具体代谢行为 (2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力 (3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力 诱导策略 细胞循环发酵 (应用限制：作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；系统的放大存在许多实际困难) XV dt XV d μ=)(F S XV dt SV d F +-=σ)(XV dt PV d π=)(F dt dV =

发酵优化与控制

发酵过程的优化与控制 1.举例说明反馈控制系统是如何工作、间接优化发酵性能的。 答：以《应用溶氧反馈控制高密度培养重组大肠杆菌过程中乙酸的产生》为例简介如下： 在供氧充足的条件下，当大肠杆菌比摄糖速率q g≥临界值q g crit时(图1A)，就会产生乙酸，溶氧信号pO2在产生乙酸时为图1B中的2，不产生乙酸为图1B中的1； 在葡萄糖限制培养的条件下，脉冲补入葡萄糖，当q g≤q g crit时，大肠杆菌比摄氧速率q o升高，pO2值降低。 脉冲过后，葡萄糖浓度的下降，q g下降，pO2值也逐渐回升(图1B)。 当脉冲补入的葡萄糖过多，大肠杆菌的摄糖速率超过临界值时，大肠杆菌的摄氧能力处于饱和状态，pO2值的响应就不会随着葡萄糖的脉冲补入而产生振荡变化(图1B)。 如图：在补料的前阶段(15~28h)，以对数增加的流速补入葡萄糖时，pO2值随着葡萄糖脉冲补入而上下振荡；加入IPTG开始诱导(26h)重组大肠杆菌表达人表皮生长因子后，在接近30h时，振荡的幅度变小，这标志着重组菌的比摄糖速率逐渐接近产生乙酸的临界比摄糖糖速率(q g crit)，而此后降低补料速率则又使pO2的振荡幅度有所增加。根据pO2值的振荡变化来控制葡萄糖的补料速率(30~44h)，能使重组大肠杆菌继续保持较高的生长速率，同时发酵液中的乙酸和葡萄糖的浓度也维持在较低的水平，大肠杆菌的细胞干重在44h时达到48g/L，人表皮生长因子的表达量比第二批提高45％。

2、实现发酵过程优化的目标有哪些？如何根据发酵过程的特点实现这些目标 的相对统一？举一例进行表述。 答： ⑴实现发酵过程优化的目标： 使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂的相互作用尽可能的简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使之最适于特定发酵过程的进行，以达到高产量（提高设备利用率；降低产品提取费用），高转化率（降低原料成本；减少环境污染），高生产强度（缩短生产周期；降低设备投资）的目的。 ⑵举例说明实现发酵目标相对统一：《L-组氨酸发酵优化》 ①L-组氨酸测定方法的研究 产物的快速测定，可以帮助生产者及时知道发酵过程进行的水平。快速测定方法的建立不仅给生产带来方便，也节约了生产成本。 本研究中应用“Paully试剂比色法”对发酵液中L-组氨酸进行了定量分析研究，确立了L-组氨酸定量测定条件和计算方法，并对其精确度进行研究，证明Paully试剂比色法能够快速，准确的测定发酵液中L-组氨酸含量。 ②L-组氨酸发酵条件的优化 组氨酸工业优生产的关键是发酵，发酵水平的高低是决定产品成本的主要因素。提离发酵水平的途径有二条：一是选育适合工业化生产的优良菌种，二是获得与生产菌种相匹配的最佳发酵工艺条件和控制手段。前者是建立在代谢控制发酵研究基础上的现代菌种选育技术，后者是建立在生化反应工程基础上的发酵过程技术。只有二者紧密结合才能最终实现发酵生产的高水平。 本研究中进行了分批发酵和补料分批发酵的条件优化，通过研究培养方式、营养条件控制、无机盐影响、生长因子影响以及环境条件控制对于L-组氨酸发酵的影响，从而提高了组氨酸的产量。 如图3-1所示为不同碳源对种子培养基的影响，从种子活力分析，以葡萄糖和果糖作为碳源，菌体浓度较高，而蔗糖作为碳源时种子活力最低。从产酸角度看，蔗糖产酸最高，葡